使用pTIRFM成像质膜形变

本实验的目的是展示如何利用基于偏振的全内反射荧光显微技术研究调控性胞吐过程中的膜重塑。首先，需确保光学元件（即四分之一波片和偏振立方体）正确安装，以产生独立的p偏振和s偏振激发光。第二步是验证p偏振和s偏振光束在全内反射荧光（TIRF）模式下共线通过显微镜的光轴，并照射到视野中的相同区域。

接下来，将待成像的细胞用羰基氰化物染料 D 染色，并施加去极化刺激以触发胞吐作用。最后一步是在全内反射荧光（TIRF）条件下捕获致密核心囊泡融合过程的图像。最终，采用 P-T-I-R-F 技术实时获取图像，以监测由嗜铬细胞胞吐作用引起的膜拓扑结构变化。

与现有的热辐射测量法和膜电容法相比，该技术的主要优势在于，ptro F 能够直接报告膜曲率，进而直接反映融合孔的扩张情况。掌握该技术时，学习曲线上最陡峭的部分首先是学会对齐 p 波和 s 波的激发偏振方向，使它们共线地沿显微镜的光轴传播，并照射到成像视野的同一区域。另一个常遇到的问题是细胞染色，即细胞暴露于 dd 的时间应为多长，以及怎样的染色效果才算染色良好，与染色不佳的细胞如何区分。

演示该实验操作的是我们实验室的研究生TA square row。首先启动显微镜的所有组件、激光器和计算机，将488纳米激光器的光束引导至数值孔径为1.49的物镜的后焦平面。如果激光束准确聚焦在后焦平面上，则光束将以准直状态出射，并在物镜正上方的天花板上呈现为一个微小且轮廓清晰的光斑。

然后调节X轴检流计镜，使激光束偏离光轴，并以相对于物镜法线逐渐增大的角度从物镜射出。接着，验证是否实现了全内反射（TIR）。向1毫升生理盐水溶液中加入10 µL荧光微球，并置于玻璃底培养皿中，仅应检测到来自紧邻TIR界面的培养皿底部的微球荧光信号。

若观察到微球漂浮，表明入射光与物镜法线之间的夹角不足。对于基于偏振的成像，使用已对准的488纳米激光束作为引导，调整原始561纳米激光束的位置，使其沿完全相同的光路传播。561纳米激光将用于碳氰染料的成像。

在561纳米激光器的下游放置了一个发散透镜和反射镜。通过调节反射镜上的调节旋钮，调整光束使其与488纳米的光束共轴，并使光斑在天花板上聚焦。当检流计反射镜处于零位置时，偏振立方体反射电场的垂直分量，而使水平分量通过。

它被放置在椭圆偏振光束下游的一个小型平移台上。为了便于后续的偏振对准，光路使用第二个偏振立方体和反射镜将光束重新合并。在第一个偏振立方体和垂直分量反射镜之间放置了一个快门。

在水平分量反射镜与第二个偏振立方体之间放置第二个快门。这些快门由成像软件控制，使用户能够快速在光束偏振态之间切换。使用偏振滤光片验证每条光路中电场的方向。

偏振滤光片仅允许与滤光片轴线方向一致的光通过。请验证激光束的垂直分量和水平分量是否彼此对齐，并与488纳米激光束对齐，必要时进行调整。三束激光均应聚焦于物镜的后焦平面，并从物镜平行射出，最终汇聚到天花板上的同一点。

可通过标记一个“X”来标示该位置，以便后续对齐。接下来，在物镜上滴加一滴浸油。放置含有荧光微球的培养皿。

在物镜上，通过在TIR的镜片移动软件中移动X轴检流计镜片来进入TIR模式。此时，光束的垂直分量为S偏振，水平分量为P偏振中心，在光路中加入四分之一波片（或简称qw）。在激光光阑下游立即使用一根杆状DOMINE样品观察每种偏振的渐逝场，该样品预计呈随机取向。

旋转 qw 培养板以匹配平均像素强度。按照文本方案所述，从猫肾上腺中分离健康的染色质细胞，使用血细胞计数板对细胞进行计数，并准备转染。根据制造商的建议，使用电穿孔系统将编码目标蛋白的 DNA 转染至细胞中。选择在转染效率与细胞存活率之间达到最佳平衡的参数设置。

对于牛染色质细胞的制备，转染后将细胞轻轻铺于经多聚赖氨酸和胶原处理的培养皿中，使用1毫升预热的电穿孔介质，参数为100伏、40毫秒，单次脉冲。将培养皿置于37摄氏度培养箱中。六小时后，向每皿中加入1毫升两倍浓度的抗生素培养基，次日更换为正常培养基。

电穿孔后48小时至五天，通常使用成像系统的开始采集软件对Chromin细胞进行成像。确认激光已校准。使用微球检查渐逝场轮廓。

准备全局和局部灌注系统。使用过滤的去离子水清洗溶液储液器，并装入基础生理盐水溶液和刺激性生理盐水溶液。在对嗜铬细胞进行成像之前，需验证P偏振和S偏振激发光是否照射到视野中的相同区域，并确保照明强度大致相等，具体操作详见文本方案。

现在开始用DD对牛染色细胞进行染色。从含有染色细胞的培养皿中移除培养基，加入两毫升基础生理盐水溶液。将10微升10毫摩尔的DD直接加入含有细胞的培养皿中。轻轻振荡培养皿2到10秒，然后移除溶液。

用基础生理盐水溶液洗涤培养皿三到四次，以去除任何残留的DD，此时细胞已染色，可随时使用。在物镜上滴加一滴浸油。将含有Dai D染色染色质细胞的培养皿置于物镜上方。

将局部灌注针置于距离细胞约100微米的位置。聚焦于细胞膜，并在细胞刺激成像采集前立即启动自动对焦硬件。开始图像采集，先用基础溶液对细胞灌注10秒，随后用56毫摩尔氯化钾去极化溶液灌注60秒。

通过在561纳米P偏振光和561纳米S偏振光之间快速切换快门，获取图像，以监测DD和488纳米激发下P和S发射信号的变化。为成像转染的囊泡探针，在染色细胞中短暂孵育Dai D后即可实现细胞膜的强效标记。在此示例中，细胞膜染色效果良好。健康的贴壁细胞会表现出明显的P和S发射信号差异。

P发射图像显示细胞边界比细胞其余部分更亮。S发射图像显示在整个细胞投影区域内荧光大致均匀，通过逐像素计算P除以S以及P加2S得到。这些图像分别对膜曲率和染料浓度敏感。

所示的嗜铬细胞已转染了 synap OIN one florin，以标记分泌囊泡。通过氯化钾刺激该嗜铬细胞，使细胞膜去极化并触发胞吐作用。随着致密核心囊泡的融合，多个明亮的荧光斑点突然显现。

在一个融合事件周围画出一个白色方框，以逐帧分析该融合事件。通过观察CIT1和pH（+2）荧光强度的变化来分析此过程。CIT1的荧光强度随着蛋白质从融合位点扩散而迅速减弱。代表融合囊泡与质膜复合物的凹陷则以相对较慢的速率逐渐减小。

该示意图展示了这些测量结果的一种解释。快速且局部的膜形变是刺激诱发的钙离子内流所致，膜去极化引起 G-Camp 5G 荧光显著增强，表明胞浆钙水平升高。选取细胞中一个 30 × 20 像素的区域，逐帧分析 G-camp 5G、PS 和 p-plus-2s 的变化。

图像和图表中显示了像素强度。时间零点表示在PS变化尚不明显之前的帧。白色箭头指示膜变形伴随着p plus two S发射的减少。

融合致密核心囊泡将细胞质中的G CAMP 5G蛋白排除在该区域之外。同时注意，在时间零点时G camp 5G荧光强度突然下降。POS信号的持续升高以及p plus two s信号的持续降低表明存在一个扩张缓慢的融合孔，如图所示。

观看本视频后，您应能够充分理解如何构建PTU F系统并对细胞进行成像，以观察其发育后在turf中膜拓扑结构的变化。该技术为细胞生物学领域的研究人员探索活细胞中胞吐、胞吞、胞质分裂以及细胞运动过程中的膜形态变化奠定了基础。