成像质膜变形随着pTIRFM
April 2nd, 2014
基于偏振的全内反射荧光显微镜（pTIRFM）实现实时检测细胞膜动力学。本文介绍pTIRFM的膜重塑的过程中调节胞吐作用的研究落实。该技术推广到在细胞生物学中的其他进程直接或间接地涉及改变膜的形状。
该程序的目的是展示如何实施基于偏振的全内反射荧光显微镜来研究调节胞吐过程中的膜重塑。这是通过首先确保光学元件（即四分之一波片和偏振立方体）正确定位以产生离散的 p 和 s 激发偏振来实现的。第二步是验证 p 和 s 光束是否同线穿过显微镜的光轴，并在全内反射荧光或 TIRF 中照亮视场的相同部分。
接下来，用碳氰化物模具、模具 D 对要成像的细胞进行染色，并用去极化刺激刺激触发胞吐作用。最后一步是在 TIRF 中捕获融合致密核心囊泡的图像。最终，P-T-I-R-F 用于实时获取图像，以监测色素细胞胞吐作用导致的膜拓扑变化。
与高温计和膜电容等现有方法相比，该技术的主要优点是 ptro F 直接报告膜曲率和引申聚变端口膨胀。使用这种技术的学习曲线最陡峭的部分是首先学习对齐 p 和 s 激发偏振，使它们通过显微镜的光轴并照亮成像场的同一部分。经常出现的第二个问题涉及细胞染色，即将细胞暴露于 dd 的时间以及染色良好的细胞与染色不良的细胞的构成。
演示该程序的将是 TA 方排，我们实验室的一名研究生。为了开始打开所有显微镜组件的电源，激光器和计算机将光束从 488 纳米激光器引导到 1.49 数值孔径镜头的后焦平面。如果激光束聚焦在后焦平面上，它将出现、整理并显示为物镜正上方天花板上的一个小而清晰的点。
然后调整 X 振镜，使激光束偏离轴线并以逐渐陡峭的角度从物镜中射出。接下来，验证是否实现了全内反射或 TIR。将 10 微升荧光微球加入 1 毫升体积的生理盐水和玻璃底培养皿中，仅应检测到来自培养皿底部最靠近 TIR 界面的微球的荧光。
检测到浮动微球表明入射光与物镜法线之间的角度不足。对于基于偏振的成像，使用对准的 488 纳米光束作为导向，并调整原始 561 纳米激光束的位置，使其沿相同的光路传播。561 纳米激光器将用于碳氰化物染料的成像。
发散透镜和反射镜位于 561 纳米激光器的下游。使用镜子上的调节旋钮，调整光束，使其与 488 纳米光束对齐，并且光斑聚焦在天花板上。当检流计镜处于零位置时，偏振立方体反射电场的垂直分量并通过水平分量。
它被放置在椭圆偏振光束下游的一个小平移台上。为了便于后续的偏振对准，光束路径使用第二个偏振立方体和反射镜来重新组合光束。在第一个偏振立方体和垂直分量镜之间放置一个快门。
第二个快门放置在水平分量镜和第二个偏振立方体之间。这些快门由成像软件控制，使用户能够在光束偏振之间快速选择。使用偏振滤光片验证每个光路中的电场方向。
偏振滤光片仅允许沿滤光片轴线传输。验证激光束的垂直和水平分量是否彼此对齐并与 488 纳米光束对齐，根据需要进行调整。这三束光束都应该聚焦在后焦平面上，并从物镜整理到天花板上的同一位置。
这个点可以用 X 标记，以方便将来对齐。接下来，在物镜上滴一滴浸油。放置含有荧光微球的培养皿。
在物镜上，通过在 TIR 中的镜子移动软件中移动 X 检流计镜子来输入 TIR。光束的垂直分量是 S 偏振，光束的水平分量现在是 P 偏振中心，即光束路径中的四分之一波片或 qw。在激光孔径的下游，用棒状 domine 样品观察每个偏振倏逝场，预计该样品是随机取向的。
旋转 qw 板以匹配平均像素强度。如文本方案中所述，从猫肾上腺中分离出健康的染色质细胞，使用血细胞计数器计数细胞，并准备转染，根据制造商的建议，使用电穿孔系统用编码目标蛋白质的 DNA 转染细胞。在转染效率和细胞存活率之间提供最佳平衡的设置。
对于牛色素蛋白细胞的制备，在 1 毫升加热的电介质中，将 1、100 伏特、40 毫秒和一个脉冲在转染板细胞上轻轻地放在 poly de lycine 和胶原蛋白处理的培养皿上。将培养皿放入 37 摄氏度的培养箱中。向每个培养皿中加入 1 毫升 2 x 抗生素培养基 6 小时后，第二天将培养基更换为正常培养基。
色蛋白细胞通常在电穿孔后 48 小时至 5 天使用成像系统开始采集软件进行成像。验证激光是否已对齐。使用微球检查倏逝场分布。
准备全球和局部 profusion 系统。用过滤的去离子水清洁溶液储液罐，并填充基础和刺激生理盐水溶液。在成像之前，染色细胞验证 P 偏振和 S 偏振激发是否照亮了视野的同一区域，并且照明强度大致相等，如文本协议中所述。
现在继续用 DD 对牛色细胞进行染色，冲洗含有色蛋白细胞的培养皿中的培养基，并用 2 毫升基础生理盐水溶液替换。将 10 微升 10 毫摩尔 DD 直接加入到含有细胞的培养皿中。轻轻搅拌培养皿 2 到 10 秒，然后取出溶液。
用基础生理盐水溶液洗涤培养皿 3 到 4 次，以去除任何残留的 DD，细胞现在已染色并可以使用。在物镜中加入一滴浸油。将含有 Dai D 染色色素细胞的培养皿放在物镜顶部。
放置局部灌注针，使其距离细胞大约 100 微米。聚焦在细胞膜上，并在细胞刺激图像采集前立即激活自动对焦硬件。开始图像采集，用基础溶液灌注细胞 10 秒，然后用去极化 56 毫摩尔氯化钾溶液灌注 60 秒。
在 561 纳米 P 偏振和 561 纳米 s 偏振之间快速快门的同时获取图像，以监测 DD 和 488 纳米激发的 p 和 s 发射的变化。为了对转染的囊泡探针进行成像，在与 Dai 短暂孵育后实现染色质细胞的旺盛膜标记 D.In 在本例中，细胞膜染色良好。健康的贴壁细胞在 p 和 s 发射方面会表现出明显的差异。
P 发射图像显示相对于单元的其余部分，单元边界更亮。S 发射图像显示整个细胞足迹的荧光大致均匀，计算出 S 和p 加 2 s 上的像素到像素 P。图像分别对膜曲率和染料浓度敏感。
所示的 CHRO 和细胞也已用突触 OIN one 弗罗因转染以标记分泌囊泡。用氯化钾刺激 CHRO 和细胞，使细胞膜去极化并触发胞吐作用。随着致密的核心囊泡融合，许多正确的荧光点突然变得明显。
在一个融合事件周围画一个白框：为了分析这个融合事件，在 sit 中逐帧变化，检查了 1 弗罗林、po、VS 和 p 加上 2 s 的图像强度。CIT one 的荧光强度随着蛋白质从融合位点扩散而迅速减弱。代表融合囊泡质膜复合物的压痕以相对较慢的速度减少。
此插图描述了对这些测量的一种解释。快速和局部的膜变形是刺激诱发钙内流的结果 膜去极化导致 G Camp 5G 荧光显着增加，这意味着亚质钙水平增加。选择小区的 30 x 20 像素区域，并在 G 阵营 5G PS 和 p 加 2 s 中逐帧变化。
像素强度显示在图像和图表中。乘以零表示 PS 变化明显的帧。白色箭头表示膜变形伴随着 p 和 2 S 发射的减少。
胞质 G CAMP 5G 蛋白被融合的致密核心囊泡排除在该区域。还要注意 G camp 5G 强度在零时突然降低。POS 的长期增加和 p 加 2 s 的减少表明融合孔如图所示，融合孔缓慢扩张。
在这里 看完这个视频，你应该对如何构建 PTU F 系统和成像细胞有一个很好的了解，以观察草坪发育后的膜拓扑变化。这项技术为细胞生物学领域的研究人员探索活细胞胞吐作用、内吞作用、胞质分裂和细胞运动过程中膜形状的变化铺平了道路。
概述
本文详细介绍了偏振基全内反射荧光显微镜（pTIRFM）在实时检测受控胞吐过程中细胞膜动力学方面的实施。该技术允许研究膜重塑，并适用于细胞生物学中的各种过程。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 荧光显微镜
- 膜动力学
背景
- pTIRFM能够实时成像膜变化。
- 该技术特别适用于研究胞吐。
- 光学元件的正确对准对于准确成像至关重要。
- 细胞染色和准备对成功实验很重要。
研究目的
- 展示pTIRFM在观察膜重塑中的应用。
- 提供实施该技术的详细协议。
- 突出pTIRFM相对于传统方法的优势。
使用的方法
- 对p和s激发偏振进行光学组件的对准。
- 用碳氰染料染色细胞并刺激胞吐。
- 捕捉TIRF过程中囊泡融合的图像。
- 利用特定激光波长进行成像。
主要结果
- 成功成像了胞吐过程中的膜动力学。
- 展示了对膜曲率变化的实时监测。
- 识别了细胞染色和光学对准中的挑战。
- 为研究人员提供了全面的协议。
结论
- pTIRFM是研究膜动力学的强大工具。
- 正确实施技术对于准确结果至关重要。
- 该方法可以适用于各种生物过程。
常见问题
Executive Industry Relevance
Precise visualization of plasma membrane deformations during exocytosis is critical for de-risking early discovery hypotheses about membrane fusion mechanisms. pTIRFM enables real-time, quantitative assessment of membrane curvature changes, supporting predictive confidence in target validation and mechanistic studies. This capability strengthens portfolio decisions at the interface of discovery biology and translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of membrane remodeling events during vesicle fusion.
- Supports mechanistic de-risking by linking protein function to dynamic membrane changes.
- Provides quantitative outputs for functional target validation in exocytosis pathways.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated cell systems for downstream screening of membrane-active compounds.
- Delivers reproducible, quantitative imaging of membrane curvature for assay standardization.
- Enables robust comparison of experimental conditions through synchronized polarization imaging.
Translational & Preclinical Research
- Aligns membrane remodeling measurements with disease-relevant exocytosis models.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling real-time tracking of fusion events.
- Provides mechanistic insights that inform risk-adjusted advancement decisions.
Pipeline & Workflow Integration
pTIRFM is positioned at the intersection of early discovery and preclinical research, enabling hypothesis testing and quantitative analysis of membrane dynamics in live-cell systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven studies of protein-lipid interactions during exocytosis.
- Screening: Provides quantitative, reproducible readouts for membrane deformation assays.
- Analytics: Delivers pixel-level measurements of curvature and fusion pore dilation for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges mechanistic findings to disease-relevant cellular models.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable imaging platform for diverse membrane remodeling studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and mechanistic studies.
- Operational Value: Standardizes imaging workflows and enhances reproducibility across experiments.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by providing direct evidence of membrane remodeling.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of membrane-targeted programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in advanced fluorescence microscopy and optical alignment.
- Demands access to high-precision instrumentation and custom analytical software.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of staining and imaging protocols.
- Adaptation may be needed for different cell types or membrane systems.
- Careful optimization of dye concentration and polarization alignment is essential for reliable outputs.
