共识脑源性蛋白，人类和小鼠脑蛋白质组使用两个2D-DIGE和Mini双向电泳免疫印迹法研究提取协议
2014年4月10日
用尿素/硫脲/ SDS缓冲液为人类和小鼠脑组织中一种常见的蛋白提取协议允许由蛋白质2D-DIGE并随后将其表征迷你2DE免疫印迹鉴定。这种方法使一个人从活组织切片检查和实验模型获得更多的可重复性和可靠的结果。
以下实验的总体目标是从人和小鼠脑组织中提取蛋白质用于蛋白质组学分析。这是通过使用通用裂解缓冲液获得适用于二维电泳方法的相同蛋白质提取来实现的。接下来，使用二维荧光差异凝胶电泳分离蛋白质以进行质谱鉴定。
然后进行微型 2D 凝胶电泳和免疫印迹，以鉴定翻译后修饰。结果可以显示整体蛋白质表达。宿主翻译根据等电点和分子量的差异改变所有韧带化和催化产物。
2D dash 和 2D monolo 的结合可以通过同时提供有关表达变化的信息来帮助我们回答神经蛋白质组学领域的关键问题。产品中的邮政修饰和分解代谢 从收获和均质化脑组织开始。在人脑组织的提取缓冲液中制备 10% 重量比的组织。
使用玻璃移液器对组织进行匀浆，但是，使用特氟龙匀浆器对啮齿动物组织进行溶解。使用 60 个半秒脉冲在 30 赫兹下对其进行超声处理。接下来，使用 BSA 作为标准品，通过 Bradford 测定法测定蛋白质浓度。
现在将氯仿甲醇沉淀溶液收集到冰桶中。计划收集约 125 μg 的 11 厘米 IPG 试纸或约 1.25 mg 的 18 厘米 IPG 试纸。一旦溶液达到 4 摄氏度，就完全在冰上进行沉淀。
首先，加入 3 体积的甲醇，然后加入 1 体积的氯仿。摇晃这种混合物。接下来，加入三体积的冷水。
涡旋，该混合物在 4 摄氏度下以 12， 000 Gs 离心样品管 30 分钟，离心 1 分钟。吸出并丢弃上清液。然后加入 3 体积的甲醇涡旋并以相同的方式离心蛋白质。
在 2D DIGE 之前，在氮气下干燥收集的蛋白质沉淀。将蛋白质以 2.5 毫克/毫升的浓度重新悬浮在 2D 缓冲液中。然后像以前一样对样品进行超声处理，直到它们被使用。
在开始此步骤之前和蛋白质沉淀后将它们储存在零下 80 摄氏度。有必要通过 Bradford 测定再次测定蛋白质浓度。遵循与前面所示的 psy 染料标记相同的程序。
为此，SDS 页面验证了蛋白质样品的质量。在 LDS 中稀释 15 微克蛋白质，然后在热浴或块中将其稀释至 37 摄氏度。然后在聚丙烯酰胺凝胶上运行它们，用 kumasi 蓝溶液对凝胶染色至少一个小时。
然后将凝胶在 7% 乙酸、10% 乙醇溶液中保存过夜。一旦确定了蛋白质样品质量，第二天开始 SD 标记程序。首先测量裂解物的 pH 值，该 pH 值应为碱性到中性。
后续反应的最佳 pH 值为 8.6。接下来，为每个蛋白质样品设置染料偶联反应。将 50 微克与 400 皮摩尔的 S3 染料混合，将 50 微克与 400 皮摩尔的 S 5 染料混合。
在四链体中执行此作，每个样品总共 8 个 D 偶联反应。对于每个测试样品，使用来自对照的蛋白质（例如来自患病大脑的蛋白质）进行一组互补的 DI 偶联反应。然后，对于每对反应，用 400 皮摩尔的 CY 2 和所有蛋白质的均匀表示总计 250 微克设置一个内对照反应。
SAI 标记是通过将所有反应混合物在 4 摄氏度下避光孵育一小时来实现的。孵育后，在 200 μL 2D 缓冲液中将三种不同青色反应的所有组合并成 150 μL 体积，每组反应。然后继续进行 2D 电泳步骤。
首先为制备凝胶制备未标记的蛋白质溶液，从中为每个样品和阳性对照切除蛋白质点。将 300 至 350 μg 未标记的蛋白质分装到 2D 缓冲液中，并让它们在与 IPG 试纸条接触时再水化。接下来，加载 IPG 条带，将标记和未标记的蛋白质转移到再水化中。
然后用 IPG 反应条覆盖每个孔。然后覆盖矿物油，让试纸条在不超过 25 摄氏度的温度下用蛋白质溶液被动地被动再水化过夜。第二天，对 IPG 条带进行等电聚焦。
然后去除油并将 IPG 试纸条存放在零下 20 摄氏度以平衡 IPG 试纸条。将它们浸入平衡缓冲液中 15 分钟。然后将试纸条转移到平衡缓冲液中的 4.7%IDO 乙酰胺中，在沐浴试纸时缺乏 DTT。
使用大型 2D 凝胶系统将每个样品中的四块 12% SDS 页面凝胶倒入低荧光玻璃板中，用于标记蛋白质。对于每种未标记的蛋白质，还将一块 12% SDS 页面凝胶倒入 1.5 毫米厚的标准玻璃板中。这些是制备凝胶。
凝胶冷却后，将胶条转移到凝胶顶部，冷却后用 0.5% Aros 覆盖胶条，在 4 摄氏度下以 2.5 瓦的功率运行凝胶过夜，第二天进行分析。许多 2D 反应可以用用于制备凝胶的蛋白质样品进行。将少于 100 μg 的样品量入 200 μL 的 2D 缓冲液中。
然后剧烈涡旋样品混合物并快速旋转。将样品加载到 11 厘米的 IPG 试纸条上，让它们在第二天用矿物油覆盖被动再水化过夜。执行等电聚焦。
然后将试纸条移过三个平衡槽，每个槽 15 分钟。然后将条带在 2D SDS 页面凝胶上运行。将每个试纸条铺在适当分子量的预制凝胶上。
聚丙烯酰胺用于目标蛋白。然后，将凝胶转移到 NITROCELLULOSE PVDF 膜上，并在开发该方案时用抗体对其进行分析。三种不同的裂解。
测试了缓冲液。首先，一种常见的生化和分子生物学缓冲液。检测了 Tris SDS。
与另一种测试的缓冲液 UTS 相比，Tris SDS 的分离度较差。排除了 de 的第三个缓冲液，因为无法用它制备可测试样品。接下来，研究了人和小鼠的脑蛋白质组。
比较了人类对照皮层样本和 ad 皮层样本。还从人类样本中观察了来自 AD 样 tau 病理学小鼠的小鼠脑蛋白。SCI 2 是独立观察的，每个 D 的 S SI 3 和 sci 5 也是独立观察的，高光斑分辨率使对准变得容易。
定性 mini 2D 分析用于研究翻译后修饰，发现 ad 组织中的韧带化 α 突触核蛋白具有正常轮廓，但也发现以星号标记的二聚体。箭头标记了发现 α 突触核蛋白的位置。泛素化淀粉样蛋白前体蛋白也通过 mini 2D 观察。
将零星广告与家庭广告进行比较。在家族性 ad β 淀粉样蛋白 1 到 42 和 ISO 方差的浓度较低，因为在 8 千道尔顿处发现了韧带形式。观看此视频后，您应该对如何研究蛋白质组有很好的了解，以便通过测量蛋白质表达修饰来比较复杂样品。
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概述
本研究专注于使用常见的裂解缓冲液从人类和小鼠脑组织中提取蛋白质，以进行蛋白质组学分析。该方法允许通过先进的电泳技术来识别和表征蛋白质。
关键研究组成部分
科学领域
- 蛋白质组学
- 神经科学
- 生物化学
背景
- 蛋白质提取对于理解大脑功能至关重要。
- 二维电泳技术增强了蛋白质分离。
- 翻译后修饰可以显著影响蛋白质功能。
- 需要可靠的方法来获得生物样本和模型中的可重复结果。
研究目的
- 从脑组织中提取蛋白质进行分析。
- 利用二维荧光差异凝胶电泳。
- 通过免疫印迹法识别翻译后修饰。
使用的方法
- 使用尿素/硫脲/SDS缓冲液提取蛋白质。
- 二维荧光差异凝胶电泳（2D-DIGE）。
- 用于免疫印迹的迷你2D凝胶电泳。
- 用于蛋白质鉴定的质谱分析。
主要结果
- 成功从人类和小鼠脑组织中提取蛋白质。
- 使用质谱分析鉴定蛋白质。
- 表征翻译后修饰。
- 提高了生物样本和模型结果的重复性。
结论
- 该方法为蛋白质组学分析提供了可靠的结果。
- 它促进了蛋白质表达和修饰的研究。
- 这种方法可以应用于各种神经科学研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
This protocol enables standardized protein extraction from limited human post-mortem and murine brain tissue, supporting reproducible proteomic profiling in neurodegenerative disease models. By integrating 2D-DIGE for quantitative expression analysis and mini 2DE immunoblotting for post-translational modification validation, the method strengthens target validation confidence and mechanistic de-risking in early discovery. The approach facilitates cross-species comparison and biomarker discovery relevant to Alzheimer’s disease and Lewy body dementia pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through global protein expression profiling in disease-relevant brain tissues.
- Operational Value: Supports functional target validation by detecting post-translational modifications such as ubiquitination and dimerization of disease-associated proteins like alpha-synuclein and amyloid precursor protein.
- Predictive Value: Enhances portfolio triage by providing qualitative comparison of protein modifications across conditions, aiding in target prioritization.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream workflows by yielding protein extracts compatible with 2D-DIGE and immunoblotting platforms.
- Reproducibility: Addresses assay standardization through standardized lysis buffer and chloroform-methanol precipitation, improving consistency across human and murine samples.
- Quantitative Output: Enables reliable compound evaluation via fluorescence difference gel electrophoresis, supporting differential expression screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Supports study of molecular pathways in neurodegenerative diseases by enabling analysis of protein aggregates such as amyloid-beta and alpha-synuclein.
- Translational Continuity: Provides continuity from discovery through preclinical validation by allowing side-by-side comparison of human and mouse brain proteomes.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by identifying disease-associated protein modifications and expression changes in models of tau pathology.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification, particularly in neurodegenerative disease programs requiring mechanistic insight and target de-risking.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by resolving protein expression changes and post-translational modifications via isoelectric point and molecular weight separation.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs through 2D-DIGE, enabling comparison of protein expression across complex samples.
- Analytics: Generates measurable readouts including spot intensity, migration shifts, and modification patterns that help teams compare conditions and prioritize targets.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling analysis of human and murine brain tissue under comparable conditions, supporting biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable proteomic capability rather than a single-use technique, applicable across multiple targets and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct observation of protein modifications and expression shifts.
- Operational Value: Promotes standardization and reproducibility via standardized lysis buffer and protein precipitation protocols, minimizing variability across laboratories.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets through mechanistic insight, reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing data on protein biomarkers and modification states relevant to disease progression.
Implementation Considerations
- Requires expertise in proteomics, protein biochemistry, and electrophoresis techniques including 2D-DIGE and immunoblotting.
- Depends on instrumentation such as electrophoresis systems, sonicators, centrifuges, and mass spectrometry-compatible platforms.
- Necessitates cross-team standardization of sample handling, protein quantification, and labeling procedures to ensure reproducibility.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to different brain regions, disease models, or sample quantities.
- Includes practical limitations such as the need for careful sample handling to prevent degradation and the dependency on sufficient protein yield from limited tissue inputs.
