Name: 共识脑源性蛋白，人类和小鼠脑蛋白质组使用两个2D-DIGE和Mini双向电泳免疫印迹法研究提取协议 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-10T15:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: 学习使用2D-DIGE和迷你双向电泳免疫印迹法从人类和小鼠脑组织中提取蛋白质，进行蛋白质组学分析，鉴定翻译后修饰并比较蛋白质表达变化。该方法为神经科学研究提供了可靠的技术方案。

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本工作得到了法国国家健康与医学研究院（Inserm）、里尔第二大学、MEDIALZ、LabEx（卓越实验室，“未来投资计划”项目）以及DISTALZ（阿尔茨海默病多学科创新策略发展项目）的支持。F-J.F-G 目前获得法国国家科研署（ANR）资助（NeuroSplice de Tau 项目 ANR-2010-BLAN-1114 01），但本工作也曾得到西班牙卡斯蒂利亚-拉曼查自治区政府（JCCM）资助项目的资助。

1. 人和小鼠脑组织的匀浆及总蛋白提取
<ol>
	<li>脑组织匀浆化。使用玻璃匀浆器（用于人源样本）或聚四氟乙烯匀浆器（用于小鼠样本），在8 M尿素、2 M硫脲和1%（w/v）SDS缓冲液（UTS）中以10%（w/v）的比例匀浆脑组织。使用超声波发生器在60 Hz条件下进行30次脉冲处理，每次0.5秒，以实现组织的完全裂解13,14。
	<ol>
		<li>采用Bradford法测定蛋白浓度，以BSA作为标准品。该UTS缓冲液提取方法完全适用于一维SDS-PAGE，只要避免裂解液过热以防止发生氨基甲酰化15。</li>
		<li>加入1%（w/v）Amberlite树脂，在室温下轻柔混匀孵育10分钟。随后通过0.22 µm注射器滤器过滤，并最终向尿素/硫脲溶液中添加SDS。此步骤可减少溶液中与尿素处于平衡状态的尿酸和异氰酸含量，从而减缓尿素的降解。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>氯仿/甲醇蛋白沉淀。为11 cm IPG胶条沉淀100–150 µg蛋白，为18 cm胶条沉淀1–1.5 mg蛋白（与所选IEF的pH范围无关）。
	<ol>
		<li>所有操作步骤均在冰上或4 °C条件下进行。在开始沉淀前，将氯仿和甲醇于4 °C预冷30分钟。</li>
		<li>向一体积的UTS裂解液中加入三体积甲醇和一体积氯仿，手动振荡混合，再加入三体积冷蒸馏水。涡旋混匀1分钟，于4 °C以12,000 × g离心30分钟以沉淀蛋白。</li>
		<li>使用巴斯德吸管弃去上清液，加入三体积冷甲醇。再次涡旋混匀，并于4 °C以12,000 × g离心30分钟。最后弃去上清液，并在N2气流下干燥蛋白沉淀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于二维分析的蛋白制备。将干燥的蛋白沉淀重悬于2D缓冲液（8 M尿素、2 M硫脲，补充4% CHAPS）中。按上述方法用Amberlite树脂清洗溶液，并尽量保持每200 µl 2D缓冲液中含500 µg蛋白的比例，适用于2D-DIGE实验。注意：2D缓冲液可于-80 °C保存，或在4 °C保存一周（以防止尿素降解）。
	<ol>
		<li>超声处理后，将样品储存于-80 °C，直至进行下一步操作。值得注意的是，本方案也可用于蛋白聚集体经甲酸溶解后的处理10。简而言之，将甲酸在N2气流下蒸发，然后按上述方法重悬沉淀。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 双向差异凝胶电泳（2D-DIGE）
<ol>
	<li>样品质量检测。使用 Bradford 法再次测定样品浓度。将 15 µg 蛋白质溶于 LDS 样品缓冲液中，在 37 °C 加热15，然后上样至 4-12% 聚丙烯酰胺凝胶。</li>
	<li>考马斯亮蓝染色。用含 0.1%（w/v）考马斯亮蓝 G-250、50% 乙醇和 10%（v/v）乙酸的溶液对聚丙烯酰胺凝胶染色至少 1 小时。随后在 7% 乙酸和 10%（v/v）乙醇溶液中脱色过夜。</li>
	<li>电泳前样品标记。在进行花青染料标记之前，需确认样品的 pH 值，应为碱性或中性，因为 N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）取代反应在碱性 pH 下效率更高，且在 pH 8.6 时效果最佳。
	<ol>
		<li>使用 Cy3 或 Cy5 荧光染料对两个待研究样品进行最小量标记，标记比例为每 50 μg 蛋白质使用 400 pmol 染料，在 4 °C 避光孵育 1 小时，以促进花青染料的 NHS 酯反应基团与赖氨酸的未质子化氨基发生反应。</li>
		<li>为减少样品间差异，采用 Cy3 和 Cy5 染料进行交叉标记，避免某一特定样品优先与某种花青染料结合。注意：花青染料的最小量标记可根据蛋白质用量按比例调整，保持每 1 µg 蛋白质对应 8 pmol 花青染料的比例。若如此，可使用微型二维电泳系统代替大型二维凝胶系统，从而实现对少量脑组织样本的 2D-DIGE 分析。</li>
		<li>将两份样品等量混合成一个混合样本（总蛋白量为 50 µg），用 Cy2 荧光染料标记，作为内标。标记条件与前述相同。</li>
		<li>用含有 1.1% Destreak 试剂、1.2% IPG 缓冲液及微量溴酚蓝的 2D 缓冲液将标记后的总蛋白（Cy2、Cy3 和 Cy5 各 50 µg，共 150 µg）补足至总体积 350 μl。该步骤需设置四个独立重复，使用四条独立的胶条。此外，另准备两条未标记的胶条（每条对应一个样品），每条上样 350–450 µg 蛋白质，用于制备胶。</li>
		<li>将六条上样后的胶条覆盖矿物油，室温下静置过夜进行被动水化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>等电聚焦（IEF）。在 20 °C 下进行等电聚焦。对于 pH 3–11NL、18 cm 的胶条，程序如下：最大电流设定为每根胶条 50 μA，共分八个阶段：1）150 V 恒压 1 小时；2）200 V 恒压 5 小时；3）500 V 梯度 2 小时；4）1,000 V 梯度 2 小时；5）2,000 V 梯度 2 小时；6）4,000 V 梯度 2 小时；7）8,000 V 梯度 2 小时；8）最终累计电压达到 24,000 V·hr。等电聚焦完成后，用层析滤纸吸去多余的矿物油，并将胶条保存于 -20 °C，待进行第二向电泳。</li>
	<li>IPG 胶条平衡。将胶条在含 6 M 尿素、2% SDS、30% 甘油、50 mM Tris-HCl 缓冲液（pH 8.6）和 1% DTT 的溶液中平衡 15 分钟，随后在相同缓冲液中但不含 DTT、含 4.7% 碘乙酰胺的溶液中再平衡一次。</li>
	<li>第二向电泳（SDS-PAGE）。使用大型二维电泳系统同时制备六块 12% SDS-PAGE 凝胶（1.5 M Tris-HCl pH 8.6，12% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺，0.1%（w/v）SDS，0.072%（w/v）APS 和 0.1%（v/v）TEMED）。其中四块使用低荧光玻璃板，用于承载含荧光标记样品的胶条；另两块使用厚度为 1.5 mm 的玻璃板，用于制备胶，以便后续切取蛋白点。
	<ol>
		<li>将六根 IPG 胶条置于凝胶顶部，并覆盖一层 0.5%（w/v）琼脂糖。电泳缓冲液为 25 mM Tris、192 mM 甘氨酸和 0.1%（w/v）SDS。在配备制冷系统的电泳槽中以每块凝胶 2.5 W 的功率运行过夜，温度设定为 4 °C16,17。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>荧光图像采集与分析。使用 Typhoon 9400 扫描仪获取荧光凝胶图像（一次实验共 12 张图像）。分别在 488/520 nm、532/580 nm 和 630/670 nm 的激发/发射波长下扫描每块凝胶的 Cy2、Cy3 和 Cy5 图像。使用图像分析软件对结果进行分析。数据反映了两个研究样本在四块凝胶中蛋白点体积变化及其信号分布情况。</li>
	<li>大凝胶的考马斯亮蓝染色。将制备胶置于含 50%（v/v）乙醇和 3%（v/v）正磷酸的固定液中固定至少 24 小时。之后用超纯水洗涤两次，每次 20 分钟。染色液含 34%（v/v）甲醇、17%（w/v）硫酸铵和 2% 正磷酸，先在此溶液中浸泡 1 小时，再加入 0.1%（w/v）考马斯亮蓝 G-250。染色时间至少 48 小时，随后用超纯水脱色。
	<ol>
		<li>质谱鉴定用蛋白点。在完成荧光图像分析后，软件会列出表达量具有统计学差异的蛋白点。手动从制备胶中切取这些蛋白点。该操作需要一定熟练度和技巧，以避免角蛋白污染。切下的样品可保存在水中并置于 -20 °C，直至送质谱分析。蛋白点的鉴定完全适用于串联质谱（MS/MS），蛋白鉴定结果的可信度依据基于概率的 Mowse 评分判断，设定显著性水平 p 值为 0.05（p &#60; 0.05）18。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 定性微型双向电泳分析
<ol>
	<li>用2D缓冲液重悬最多100 µg蛋白质样品，定容至200 µl，用于11 cm IPG胶条。若为过表达体系或纯化蛋白，起始上样量可降低至20 µg。</li>
	<li>向终体积200 µl的样品中加入1.1% (v/v) Destreak试剂、0.55% (v/v) IPG缓冲液以及微量溴酚蓝。涡旋混匀后短暂离心，将样品加入IPG胶条中，覆盖矿物油，于室温下进行被动水化过夜（使胶条恢复至原始厚度）。注意：IPG缓冲液的比例在所有所需pH区间（如pH 3-11、4-7、7-11等）中均相同，但其组成随所选pH范围不同而变化。</li>
	<li>等电聚焦。在20 °C下进行等电聚焦（IEF）。程序运行时间取决于所选pH区间。值得注意的是，电渗等参数可能影响IEF图谱，在此类情况下需优化电聚焦时间19。注意：并非等电聚焦时间越长结果越好，适当缩短IEF时间也可能提高分辨率。IEF完成后，IPG胶条可在-20 °C保存数月。</li>
	<li>IPG胶条平衡。将胶条置于含25 mM Tris-HCl（pH 6.8）、20 mM DTT、10%甘油、5% SDS和0.05%溴酚蓝的缓冲液中进行平衡。更换缓冲液，共进行三次平衡，每次15分钟。</li>
	<li>SDS-PAGE。将IPG胶条置于预制胶上（IPG+1加样孔，适用于11 cm IPG胶条），聚丙烯酰胺浓度根据目标蛋白的分子量选择。随后，在100 mV条件下电转33分钟，将蛋白转移至硝酸纤维素膜或PVDF膜。</li>
	<li>用相应一抗于4°C孵育过夜，通过辣根过氧化物酶活性显色检测。利用二抗识别的非相关多肽条带对免疫印迹图进行比对校准。使用ImageJ软件对条带/斑点的体积和强度进行密度分析，实现半定量分析。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

发现蛋白质的病理性表达变化、寻找生物标志物以及调控潜在的药物靶点通路，是神经蛋白质组学研究的重要目标30。在众多新兴技术中，双向电泳（2DE）领域展现出良好的前景。然而，为了最大限度地减少实验变异性并提高可重复性，亟需建立统一的标准。基于这一理念，本文详细描述了一种标准化的操作流程，用于对人和小鼠脑组织进行二维差异凝胶电泳（2D-DIGE）（图2）以及后续的二维电泳免疫印迹（2DE免疫印迹）（图3），该流程与一维免疫印迹完全兼容。
蛋白质组学中最大的难题之一是溶解缓冲液的选择。为了提高不同方法之间的可重复性，选择了UTS，因为它与等电聚焦（IEF）完全兼容。此外，使用UTS提取缓冲液在12,000 × g离心后不会产生沉淀或仅产生极微量沉淀（不要与4 °C下SDS沉淀混淆）。这一点至关重要，因为许多神经退行性疾病（包括阿尔茨海默病，AD）均涉及蛋白质聚集。由于无沉淀产生，实验操作和数据分析得以简化，无需分别对可溶性和不可溶性组分进行独立研究。
<p class="jove_conten...

精神与神经系统疾病占全球疾病负担的13%，必须深入探索诸如病理生理机制、风险因素以及前驱期生物标志物等新挑战1。为实现这一目标，开展人类大脑的蛋白质组学研究至关重要，有助于揭示参与记忆、行为、情绪及神经元可塑性等过程的分子通路，不仅适用于生理状态，也适用于病理状态。因此，动物模型尤其是转基因小鼠的应用，为模拟人类神经退行性疾病的病因提供了广泛的可能性2。
目前已有多种蛋白质组学方法可用于实现神经科学领域这些新的研究视角。二维凝胶电泳（2DE）是一种高效且相对简单的方法，能够比较多种样品的蛋白质组。此外，该技术也是一种从复杂混合物中分离蛋白质以进行质谱鉴定和进一步分析的有力手段。该技术主要包括两个连续步骤：1）通过等电聚焦（IEF）根据蛋白质的等电点（pI）进行分离。具体而言，在固定pH梯度的固相pH梯度胶条上施加电场，蛋白质会依据其整体净电荷迁移并聚焦于其特定的pI位置。2）将等电聚焦后的蛋白质通过添加十二烷基硫酸钠（SDS）进行变性并带上负电荷，从而使蛋白质在其一级结构状态下依据其表观分子量（MW）通过SDS-PAGE3进行分离。这两个不同的分离维度使得我们能够更深入地开展蛋白质组研究。一方面，该方法可结合微量染料2D-DIGE技术实现定量分析；另一方面，也可通过小型2DE联合蛋白质印迹法（western blotting）进行定性分析。
通过二维差异凝胶电泳（2D-DIGE）进行的定量分析可全面检测样品蛋白质组中蛋白质表达水平的变化。简言之，样品使用三种在不同波长（蓝色、绿色和红色）发射荧光的氰染料（Cy2、Cy3 和 Cy5）进行标记。这些含有 N-羟基琥珀酰亚胺酯基团的荧光最小标记试剂可与蛋白质赖氨酸残基的 ε-氨基发生反应，形成共价酰胺键4。赖氨酸残基的标记程度仅控制在1%至3%之间，从而避免每种蛋白质发生多重标记以及显著的净电荷改变5,6。通常使用 Cy3 和 Cy5 分别标记两个独立的样品，而 Cy2 则用于标记等量混合的待比较样品。该方法的两个主要优势在于：所有标记后的样品可混合后在同一块凝胶中完成等电聚焦（IEF）和 SDS-PAGE，每一步均只需一块凝胶，从而避免了因凝胶间比较所导致的实验间变异性。此外，该方法具有较高的检测灵敏度，蛋白质检测阈值可达约1飞摩尔（femtomole）7。凝胶经扫描后，二维分析软件对不同波长下的荧光图像进行比较，其中 Cy2 作为内标，有助于识别蛋白点之间的统计学差异，以便后续通过质谱技术进行鉴定。利用内标进行的二维分析软件可在超过95%的统计置信度下，快速检测出样品间低于10%的表达差异8。
通过微型二维电泳（mini-2DE）进行定性分析是蛋白质表征的关键步骤。其原理与此前所述的等电点（pI）和分子量（MW）分离方法相同，但在此方法中，蛋白质从一块小型聚丙烯酰胺凝胶转移至膜上，随后进行免疫印迹。虽然一维凝胶电泳可依据抗体检测一个或多个蛋白质表位在表达水平上的变化，但mini-2DE提供了两个额外的参数信息。首先，蛋白质同分异构体随pI的变化提示可能存在翻译后修饰。其次，质谱鉴定结果可能提示蛋白质潜在的酶原形式或降解产物。因此，通过2D-DIGE观察到的修饰变化可能揭示全局蛋白质组谱变化背后的机制。对多个样本中同一蛋白质表位/s采用mini-2DE进行免疫印迹图谱比对，可反映出酸碱性变化，从而揭示在单维免疫印迹中难以察觉甚至无法检测到的翻译后变异9,10。此外，该分析还可提供有关潜在蛋白水解位点的信息，前提是已知代谢残留片段的pI和MW11,12。
这两种技术的结合提供了互补的蛋白质组学分析。一方面，二维差异凝胶电泳（2D-DIGE）能够检测出一类差异，从而精确分离出表达水平发生变化的多肽。这些差异主要表现为蛋白点的出现或消失，或通过荧光凝胶的软件分析发现某一蛋白点强度的增强或减弱。然而，仅凭这些观察结果本身难以解释所观察到的修饰性质。因此，在多肽被分离并经质谱鉴定后，使用微型二维电泳（mini-2DE）可精确定证：1）所分离蛋白的身份；2）差异的性质，例如同种异型体/异构体表达水平的变化、翻译后修饰以及剪切过程等。然而，有必要开发一种起始裂解缓冲液，使其同时适用于2D-DIGE和mini-2DE，以尽量减少因使用差异较大的提取方案而可能导致的实验偏差。
本文介绍了一种改进的实验方案，用于制备、提取及实施二维差异凝胶电泳（2D-DIGE）和微型二维电泳（mini-2DE）技术，以分析来自人和小鼠组织的脑蛋白。

<table><tbody><tr><td>CyDye DIGE 荧光最小试剂盒 5 nmol 1 * 5 Nmo</td><td>GE Healtcare</td><td>25-8010-65</td><td></td></tr><tr><td>Immobiline DryStrip</td><td>GE Healtcare</td><td></td><td>根据pH区间/尺寸选择参考编号</td></tr><tr><td>IPG 缓冲液，pH X-X</td><td>GE Healtcare</td><td></td><td>根据所需pH区间选择参考编号</td></tr><tr><td>AMBERLITE IRN-150L 混床树脂 1&amp;nbsp;</td><td>GE Healtcare</td><td>551797N</td><td></td></tr><tr><td>DRYSTRIP 覆盖液 Immobiline 1 * 1 L</td><td>GE Healtcare</td><td>17-1335-01</td><td></td></tr><tr><td>IPG 试剂盒箱 1 * 1 套装</td><td>GE Healtcare</td><td>28-9334-92</td><td>用于被动水化的塑料盒&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>MILLEX GS 滤器</td><td>Millipore</td><td>SLGS033SB</td><td></td></tr><tr><td>Criterion XT 预制凝胶 13.3 x 8.7 cm（宽 x 长）</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>根据待分离分子量选择参考编号</td></tr><tr><td>IPGphor III 等电聚焦仪</td><td>GE Healtcare</td><td>11-0033-64</td><td></td></tr><tr><td>Ettan DALTsix 大型电泳系统</td><td>GE Healtcare</td><td>80-6485-08</td><td></td></tr><tr><td>OneTouch 2D 凝胶斑点挑取器 1.5 mm&amp;nbsp;</td><td>Gel Company</td><td>P2D1.5</td><td></td></tr></tbody></table>

共识脑源性蛋白质提取方案：用于人和小鼠脑蛋白质组研究的双向差异凝胶电泳与微型双向电泳免疫印迹法

Consensus Brain-derived Protein, Extraction Protocol for the Study of Human and Murine Brain Proteome Using Both 2D-DIGE and Mini 2DE Immunoblotting

双向凝胶电泳（2DE）是一种强大的工具，可用于揭示可能与不同生理或病理状态相关的蛋白质组变化。该技术的基本原理是首先根据蛋白质的等电点进行分离，然后在第二步中通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）根据其分子量进行分离。本文描述了一种针对少量人死后脑组织和小鼠脑组织的优化样品制备方案。该方法可用于进行双向荧光差异凝胶电泳（2D-DIGE）以及微型双向凝胶电泳免疫印迹（mini 2DE immunoblotting）。结合这两种方法，不仅因其与质谱检测兼容而能够发现新的蛋白质和/或蛋白质表达中的修饰，还能进一步验证生物标志物。因此，微型双向凝胶电泳与蛋白质印迹联用可实现对翻译后修饰、蛋白质降解过程的鉴定与验证，并可在不同条件和/或处理之间进行定性比较。本文中，我们提供了一种用于研究阿尔茨海默病（AD）和路易体痴呆中蛋白质聚集体组分的方法，例如淀粉样β肽和α-突触核蛋白。该方法也可适用于人脑组织及小鼠模型中蛋白质组和不溶性蛋白质提取物的分析。同时，该方法还可为研究神经退行性疾病相关的分子与细胞通路，以及潜在的新型生物标志物和治疗靶点提供有价值的信息。

脑组织蛋白质组学研究仍然具有挑战性，因为目前尚无理想的缓冲液能够完全回收所有蛋白质，尤其是膜结合蛋白或细胞骨架蛋白。第一组实验旨在寻找一种适合两种方法且能广泛回收多种蛋白质的裂解缓冲液。为此，测试了三种裂解缓冲液以确定最适宜的一种。首先使用的是常见的生化与分子生物学缓冲液 Tris-HCl20 10 mM，含1% (w/v) SDS （图1A）此外，Tris-HCl 广泛用作聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶电泳的缓冲液。另外两种裂解缓冲液为 UTS （图 1B） 以及二维电泳结果。Tris-SDS 获得的分辨率较差，且蛋白点数量显著减少 （图 1B） 与UTS观察到的图谱相比，后者表现出较高的斑点分离度、无畸变以及更佳的蛋白质回收效果 （图 1B）这一点由以下事实支持：UTS提取法几乎不产生残余沉淀，而Tris-HCl在台式离心后则形成较厚的沉淀。图中显示的模式表明 图1B 清楚地表明，与其他缓冲液（如 Tris-HCl）相比，UTS 缓冲液中的蛋白质溶...

一种使用尿素/硫脲/SDS缓冲液从人和小鼠脑组织中提取蛋白质的常用方法，可实现通过二维差异凝胶电泳（2D-DIGE）对蛋白质进行鉴定，并随后通过微型二维电泳免疫印迹法（mini 2DE immunoblotting）对其进行表征。该方法有助于从人类活检样本和实验模型中获得更可重复且可靠的结果。

双向凝胶电泳（2DE）是一种强大的工具，可用于揭示可能与不同生理或病理状态相关的蛋白质组修饰。

以下实验的总体目标是从人和小鼠脑组织中提取蛋白质，用于蛋白质组学分析。通过使用一种常用的裂解缓冲液，获得适用于双向电泳技术的蛋白质提取物。随后采用双向荧光差异凝胶电泳对蛋白质进行分离，以便通过质谱技术进行鉴定。随后进行微型二维凝胶电泳并结合免疫印迹，以鉴定翻译后修饰。结果可显示全局蛋白质表达情况。根据等电点和分子量的差异，可揭示宿主翻译过程中的变化、韧带化过程及催化产物。2D 色谱与 2D 单一色谱的结合可通过同时提供表达变化的信息，帮助我们回答神经蛋白质组学领域的关键问题。翻译后修饰和代谢产物的分析始于脑组织的采集与匀浆。将人脑组织以 10% 质量体积比的比例置于提取缓冲液中进行制备。使用玻璃移液器均质组织，但处理啮齿类动物组织时，应使用聚四氟乙烯（Teflon）均质器以充分分散均质液。在60赫兹下进行超声处理，采用30次半秒脉冲。随后，以牛血清白蛋白（BSA）作为标准品，通过Bradford法测定蛋白浓度。现在将用于氯仿-甲醇沉淀的溶液收集到冰桶中。计划为11厘米IPG胶条收集约125微克样品，或为18厘米IPG胶条收集约1.25毫克样品。待溶液冷却至4°C后，全程在冰上进行沉淀操作。首先加入三倍体积的甲醇，然后加入一倍体积的氯仿。振荡此混合液。接着加入三倍体积的冷蒸馏水。涡旋混合1分钟，然后在4°C条件下以12,000 ×g离心样品管30分钟。吸除并弃去上清液。随后加入三倍体积的甲醇，涡旋混匀，并以相同方式离心沉淀蛋白质。在进行二维差异凝胶电泳（2D DIGE）前，将收集的蛋白质沉淀在氮气下干燥。用2D缓冲液重悬蛋白质，浓度为2.5毫克/毫升。然后像之前一样对样品进行超声处理，直至使用。在开始此步骤之前以及蛋白质沉淀后，将其储存在负80摄氏度。需再次通过Bradford法测定蛋白质浓度。操作步骤与之前进行psy染料标记前的步骤相同。通过SDS-PAGE检测蛋白质样品的质量。将15微克蛋白质在LDS中稀释，置于37摄氏度的水浴或加热块中加热。然后在聚丙烯酰胺凝胶上电泳，并用考马斯亮蓝溶液染色至少一小时。然后将凝胶置于7%乙酸、10%乙醇溶液中固定过夜。待蛋白样品质量确认后，次日开始SD标记程序。首先测定裂解液的pH值，其应为碱性至中性。后续反应的最适 pH 为 8.6。接下来，为每种蛋白质样品设置染料偶联反应。将 50 微克样品与 400 皮摩尔的 S3 染料混合，另取 50 微克样品与 400 皮摩尔的 S5 染料混合。每个样品进行四重平行实验，共计八次D型偶联反应。对于每个待测样品，使用对照组蛋白（例如来自病变脑组织的蛋白）进行一组相应的DI偶联反应。然后，针对每一对反应，设置一个内参对照反应，其中包含400皮摩尔的CY2以及总量为250微克且各蛋白等量混合的蛋白样本。SAI 标记通过在避光条件下将所有反应混合物于 4 摄氏度孵育一小时来实现。孵育结束后，将三组不同的氰基反应混合物各取 150 微升，合并至含有 200 微升 2D 缓冲液的反应体系中。随后进行二维电泳步骤。首先，为制备胶准备未标记的蛋白质溶液，以便从每份样品及阳性对照中切取蛋白点。将 300 至 350 微克未标记蛋白质分装至 2D 缓冲液中，并使其在与 IPG 胶条接触的条件下进行水化。随后，将 IPG 胶条装载，并将标记和未标记的蛋白质转移至水化步骤中。然后用IPG胶条覆盖每个孔，再在上面覆盖一层矿物油，使胶条在蛋白质溶液中于不超过25°C的条件下被动复水过夜。次日，对IPG胶条进行等电聚焦电泳。然后去除油液，将IPG胶条于-20摄氏度保存以使其平衡。将胶条浸入平衡缓冲液中15分钟。随后在避光条件下，将胶条转移至含有4.7%碘乙酰胺的平衡缓冲液中，缓冲液中不含DTT。使用大型二维凝胶系统，在低荧光玻璃板上为标记的蛋白质样品每份制备四块12% SDS-PAGE凝胶。同时在1.5毫米厚的标准玻璃板上为每种未标记蛋白质各制备一块12% SDS-PAGE凝胶。这些为制备胶。凝胶冷却后，将胶条转移至凝胶顶部，并在冷却后用0.5% Aros覆盖胶条，然后在4°C条件下以2.5瓦功率过夜电泳，次日进行分析。许多二维反应可使用制备凝胶所用的蛋白质样品进行。取少于100微克样品溶于200微升二维缓冲液中。然后剧烈涡旋混合样品，并进行短暂离心。将样品上样至11厘米IPG胶条中，次日在矿物油覆盖下过夜被动复水。进行等电聚焦电泳。然后将胶条依次浸入三份平衡缓冲液中，每份缓冲液中放置15分钟。随后将胶条用于2D SDS-PAGE凝胶电泳。将每根胶条铺在相应分子量的预制凝胶上。目标蛋白的聚丙烯酰胺凝胶。随后，将凝胶转移至硝酸纤维素或PVDF膜上，并在本方案的开发过程中使用抗体进行分析。三种不同的裂解方法。对缓冲液进行了测试。首先测试了一种常见的生物化学与分子生物学缓冲液，即Tris SDS。与另一种经过测试的缓冲液UTS相比，Tris SDS的分辨率较差。第三种缓冲液因无法制备可测试的样品而被排除在测试之外。接下来，对人和小鼠脑蛋白质组进行了研究。比较了人源正常大脑皮层样本与阿尔茨海默病（AD）皮层样本。同时，还观察了具有类似AD Tau病理特征的小鼠脑蛋白在人源样本中的情况。SCI two、S SI three 以及 sci five 针对每种疾病分别进行了独立分析。高点分辨率使得比对过程更加简便。采用定性微型二维分析来研究翻译后修饰，在脂肪组织中发现的韧带化α-突触核蛋白具有正常谱型，但也以二聚体形式存在，由星号标记。箭头指示了α-突触核蛋白的位置。微型二维分析还检测到泛素化的淀粉样前体蛋白。散发性阿尔茨海默病（AD）与家族性阿尔茨海默病进行了比较。在家族性AD中，β-淀粉样蛋白1-42及其异构体的浓度较低，因为在8千道尔顿处发现了ligand形式。观看本视频后，您应能充分理解如何通过检测蛋白质表达修饰来研究蛋白质组，以比较复杂样本。

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共识脑源性蛋白，人类和小鼠脑蛋白质组使用两个2D-DIGE和Mini双向电泳免疫印迹法研究提取协议

识别调控突触可塑性和记忆的分子与通路，至今仍是神经科学领域的主要挑战之一。本文描述了一种工作流程，用于在听觉学习范式中，对可能参与学习与记忆巩固过程中突触分子重组的突触蛋白进行相对定量分析。...

小鼠听觉辨别学习后脑区突触蛋白质组的高分辨率定量分析

本文描述了一种从人类尸检脑组织中富集去垢剂不溶性蛋白聚集体的简化分级分离方案。...

从人死后脑组织中富集去污剂不溶性蛋白聚集体

本文介绍了一种二维凝胶电泳（2DE）结合质谱法（MS）的技术，用于分离和鉴定人类垂体腺瘤组织的蛋白质组，该方法可获得良好且可重复的2DE图谱。在利用高灵敏度质谱分析复杂的癌症蛋白质组时，每个2DE斑点中均可检测到多种蛋白质。...

二维凝胶电泳联合质谱法分析人类垂体腺瘤组织蛋白质组

本文介绍了一种定量分析方法，通过免疫荧光染色、共聚焦显微镜和计算机辅助分析，确定突触蛋白相对于标记蛋白的分布情况。...

使用免疫荧光法量化小鼠脑内突触蛋白的异质性分布

我们介绍一种从复杂的生物样品中纯化、检测和鉴定来源于泛素化蛋白质的diGly肽的方法。该方法具有良好的重复性和稳健性，在泛素化修饰组分析的深度方面优于已发表的方法。...

通过肽段富集与质谱法检测蛋白质泛素化位点

本方法介绍了一种采用标准化定量蛋白质印迹技术，对不同组织及不同发育阶段的蛋白质水平进行可靠且可重复比较的实验方案。...

使用标准化定量 Western Blotting 在不同组织及发育过程中对蛋白质水平进行稳健比较

本文介绍一种利用近红外染料结合免疫组织化学与高分辨率扫描，检测脑区蛋白质的实验方案。...

利用近红外荧光与高分辨率扫描检测啮齿类动物脑组织中的蛋白质表达

本方案旨在介绍使用三重四极杆质谱仪对临床样本中的蛋白质进行多反应监测（MRM）的方法。我们提供了一套系统的工作流程，涵盖从样本制备到数据分析的各个环节，并列出了处理临床样本时所需采取的所有必要预防措施。...

基于多重反应监测技术检测人脑组织蛋白质的定量蛋白质组学工作流程

这种结合质谱法蛋白质组学分析的生化纯化方法有助于对淀粉样纤维核心进行稳健表征，可能加速阿尔茨海默病防治靶点的发现。...

脑源性淀粉样纤维核心的生化纯化与蛋白质组学表征

本文研究了Theta-Burst经颅磁刺激对脆性X综合征患者以及自闭症谱系个体大脑皮层可塑性的影响。...

TMS：使用theta爆发模式探究脆性X综合征和自闭症患者突触可塑性的机制

学习使用2D-DIGE和迷你双向电泳免疫印迹法从人类和小鼠脑组织中提取蛋白质，进行蛋白质组学分析，鉴定翻译后修饰并比较蛋白质表达变化。该方法为神经科学研究提供了可靠的技术方案。

共识脑源性蛋白质提取方案：用于人和小鼠脑蛋白质组研究的双向差异凝胶电泳与微型双向电泳免疫印迹法

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