共识脑源性蛋白质提取方案：用于人和小鼠脑蛋白质组研究的双向差异凝胶电泳与微型双向电泳免疫印迹法

以下实验的总体目标是从人和小鼠脑组织中提取蛋白质，用于蛋白质组学分析。通过使用一种常用的裂解缓冲液，获得适用于双向电泳技术的蛋白质提取物。随后采用双向荧光差异凝胶电泳对蛋白质进行分离，以便通过质谱技术进行鉴定。

随后进行微型二维凝胶电泳并结合免疫印迹，以鉴定翻译后修饰。结果可显示全局蛋白质表达情况。根据等电点和分子量的差异，可揭示宿主翻译过程中的变化、韧带化过程及催化产物。

2D 色谱与 2D 单一色谱的结合可通过同时提供表达变化的信息，帮助我们回答神经蛋白质组学领域的关键问题。翻译后修饰和代谢产物的分析始于脑组织的采集与匀浆。将人脑组织以 10% 质量体积比的比例置于提取缓冲液中进行制备。

使用玻璃移液器均质组织，但处理啮齿类动物组织时，应使用聚四氟乙烯（Teflon）均质器以充分分散均质液。在60赫兹下进行超声处理，采用30次半秒脉冲。随后，以牛血清白蛋白（BSA）作为标准品，通过Bradford法测定蛋白浓度。

现在将用于氯仿-甲醇沉淀的溶液收集到冰桶中。计划为11厘米IPG胶条收集约125微克样品，或为18厘米IPG胶条收集约1.25毫克样品。待溶液冷却至4°C后，全程在冰上进行沉淀操作。

首先加入三倍体积的甲醇，然后加入一倍体积的氯仿。振荡此混合液。接着加入三倍体积的冷蒸馏水。

涡旋混合1分钟，然后在4°C条件下以12,000 ×g离心样品管30分钟。吸除并弃去上清液。随后加入三倍体积的甲醇，涡旋混匀，并以相同方式离心沉淀蛋白质。

在进行二维差异凝胶电泳（2D DIGE）前，将收集的蛋白质沉淀在氮气下干燥。用2D缓冲液重悬蛋白质，浓度为2.5毫克/毫升。然后像之前一样对样品进行超声处理，直至使用。

在开始此步骤之前以及蛋白质沉淀后，将其储存在负80摄氏度。需再次通过Bradford法测定蛋白质浓度。操作步骤与之前进行psy染料标记前的步骤相同。

通过SDS-PAGE检测蛋白质样品的质量。将15微克蛋白质在LDS中稀释，置于37摄氏度的水浴或加热块中加热。然后在聚丙烯酰胺凝胶上电泳，并用考马斯亮蓝溶液染色至少一小时。

然后将凝胶置于7%乙酸、10%乙醇溶液中固定过夜。待蛋白样品质量确认后，次日开始SD标记程序。首先测定裂解液的pH值，其应为碱性至中性。

后续反应的最适 pH 为 8.6。接下来，为每种蛋白质样品设置染料偶联反应。将 50 微克样品与 400 皮摩尔的 S3 染料混合，另取 50 微克样品与 400 皮摩尔的 S5 染料混合。

每个样品进行四重平行实验，共计八次D型偶联反应。对于每个待测样品，使用对照组蛋白（例如来自病变脑组织的蛋白）进行一组相应的DI偶联反应。然后，针对每一对反应，设置一个内参对照反应，其中包含400皮摩尔的CY2以及总量为250微克且各蛋白等量混合的蛋白样本。

SAI 标记通过在避光条件下将所有反应混合物于 4 摄氏度孵育一小时来实现。孵育结束后，将三组不同的氰基反应混合物各取 150 微升，合并至含有 200 微升 2D 缓冲液的反应体系中。随后进行二维电泳步骤。

首先，为制备胶准备未标记的蛋白质溶液，以便从每份样品及阳性对照中切取蛋白点。将 300 至 350 微克未标记蛋白质分装至 2D 缓冲液中，并使其在与 IPG 胶条接触的条件下进行水化。随后，将 IPG 胶条装载，并将标记和未标记的蛋白质转移至水化步骤中。

然后用IPG胶条覆盖每个孔，再在上面覆盖一层矿物油，使胶条在蛋白质溶液中于不超过25°C的条件下被动复水过夜。次日，对IPG胶条进行等电聚焦电泳。

然后去除油液，将IPG胶条于-20摄氏度保存以使其平衡。将胶条浸入平衡缓冲液中15分钟。随后在避光条件下，将胶条转移至含有4.7%碘乙酰胺的平衡缓冲液中，缓冲液中不含DTT。

使用大型二维凝胶系统，在低荧光玻璃板上为标记的蛋白质样品每份制备四块12% SDS-PAGE凝胶。同时在1.5毫米厚的标准玻璃板上为每种未标记蛋白质各制备一块12% SDS-PAGE凝胶。这些为制备胶。

凝胶冷却后，将胶条转移至凝胶顶部，并在冷却后用0.5% Aros覆盖胶条，然后在4°C条件下以2.5瓦功率过夜电泳，次日进行分析。许多二维反应可使用制备凝胶所用的蛋白质样品进行。取少于100微克样品溶于200微升二维缓冲液中。

然后剧烈涡旋混合样品，并进行短暂离心。将样品上样至11厘米IPG胶条中，次日在矿物油覆盖下过夜被动复水。进行等电聚焦电泳。

然后将胶条依次浸入三份平衡缓冲液中，每份缓冲液中放置15分钟。随后将胶条用于2D SDS-PAGE凝胶电泳。将每根胶条铺在相应分子量的预制凝胶上。

目标蛋白的聚丙烯酰胺凝胶。随后，将凝胶转移至硝酸纤维素或PVDF膜上，并在本方案的开发过程中使用抗体进行分析。三种不同的裂解方法。

对缓冲液进行了测试。首先测试了一种常见的生物化学与分子生物学缓冲液，即Tris SDS。

与另一种经过测试的缓冲液UTS相比，Tris SDS的分辨率较差。第三种缓冲液因无法制备可测试的样品而被排除在测试之外。接下来，对人和小鼠脑蛋白质组进行了研究。

比较了人源正常大脑皮层样本与阿尔茨海默病（AD）皮层样本。同时，还观察了具有类似AD Tau病理特征的小鼠脑蛋白在人源样本中的情况。SCI two、S SI three 以及 sci five 针对每种疾病分别进行了独立分析。高点分辨率使得比对过程更加简便。

采用定性微型二维分析来研究翻译后修饰，在脂肪组织中发现的韧带化α-突触核蛋白具有正常谱型，但也以二聚体形式存在，由星号标记。箭头指示了α-突触核蛋白的位置。微型二维分析还检测到泛素化的淀粉样前体蛋白。

散发性阿尔茨海默病（AD）与家族性阿尔茨海默病进行了比较。在家族性AD中，β-淀粉样蛋白1-42及其异构体的浓度较低，因为在8千道尔顿处发现了ligand形式。观看本视频后，您应能充分理解如何通过检测蛋白质表达修饰来研究蛋白质组，以比较复杂样本。