木质素下调玉米通过dsRNAi和Klason木质素分析

该程序的总体目标是通过 RNAi 下调迷宫中的木质素含量，以促进用于生物乙醇生产的可消化生物质的产生，并使用 Clayson 木质素测量方案测量木质素含量。这是通过首先构建迷宫 CCR 一 RNAi 质粒来下调木质素生物合成相关基因 syn oil COA 还原酶来实现的。接下来，用 ZM CCR 转化玉米高两个胚胎愈伤组织，使用粒子轰击一个 RNAi 构建体，并生成纯合转基因系。

然后通过组织学测定和对转基因迷宫的第一代、第二代和第三代进行的扫描电子显微镜来观察表型变化。最后，测量来自转基因迷宫系的酸不溶性或固定木质素，并与非转基因迷宫植物中的木质素含量进行比较。最终获得的结果表明，与使用粒子轰击的野生型植物相比，CCR one 转基因迷宫植物的木质素减少了 10%，并且由 Clayson 木质素测量确定该方法的结束视觉演示至关重要，因为有些步骤很难学习，而这些步骤难以学习包括准备安柏瑞玉米， Cali 在无菌条件下用质粒 DNA 对罐进行涂层，并对 Cali、Hossein Aladin 博士和 Gli Brew Han 博士和本科生进行粒子轰炸。

Donald 将通过通过粒子轰炸来展示这些程序来展示这项研究。克莱森木质素测量技术对生物乙醇生产的影响在于，它不仅提供了有关不同木质素纤维素材料中粘土木质素含量的信息，而且还提供了关于预处理过程中 lano cellose 生物质对脂肪团酶的抗性信息的见解。要制备钨颗粒，首先将 60 毫克钨珠放入 1.5 毫升的试管中。

加入 1 毫升 70% 乙醇并涡旋 2 分钟来清洗它们。然后在 23 摄氏度下孵育 10 分钟，并以 18， 894 倍 G 离心 2 分钟，然后弃去上清液。使用 1 毫升 100% 乙醇洗涤珠子 3 次。

然后加入 1 毫升无菌 50% 甘油，使微粒浓度达到每毫升 60 毫克。为了制备用于轰击的 DNA，将 50 微升甘油中的钨珠放入 1.5 毫升的试管中，并在每个版本之间添加以下涡旋。1 μg IV 1.1 ZM CCR，1 个 RNAi 质粒 DNA，根据文本方案制备。

50 微升 2.5 摩尔氯化钙和 20 微升 0.1 摩尔精子。最后一次涡旋后，将混合物以 18， 894 x G 离心 30 秒。然后倒出上清液，用 140 微升 70% 乙醇洗涤沉淀两次，弃去最后一次洗涤液后，向珠子中加入 48 微升 100% 乙醇并立即使用，或在轰炸前至少在轰炸前四小时在冰上储存长达四个小时。

将一个 3 到 5 厘米高的双胚胎生迷宫 Calli 放在含有 N six OSM 培养基的 100 毫米培养皿的中间。根据制造商的说明准备 PSD 1000 氦气颗粒输送装置，并使用 70% 乙醇对腔室壁进行消毒。接下来，将无菌 650 PSI 爆破片装入无菌固定盖中。

然后将 5 至 6 μL 的 M 10 DNA 溶液涂在宏观载体的表面并短暂干燥。在将宏载架和止动筛网装入微型载具发射组件之前，将微型载具发射组件和迷宫式愈伤组织放入腔室中，距离止动筛网保持选定距离，然后关上门。在 27 PSI 的真空中对着金属丝网筛网加速。

按下开火按钮，直到爆破片爆裂，仪表上的氦气压力降至零。然后松开开火按钮。将轰炸的愈伤组织转移到含有 N 6 OSM 的培养皿中，并在 16 摄氏度的黑暗中孵育 27 小时。

然后将愈伤组织分成约 10 块，将它们转移到培养皿中的 N 6 E 或愈伤组织诱导培养基中，并在 27 摄氏度的黑暗中孵育 5 天。大约 8 到 10 周后，白色快速生长的扇区将从非增殖和部分坏死中长出。母 C 眼切除白色快速生长的组织，将它们转移到新鲜的选择培养基中，继续孵育它们，将白色和快速生长的胚胎 Cali 转移到再生培养基上，并在 27 摄氏度的黑暗中孵育一周，然后在 25 至 27 摄氏度下切换到 16 小时的日光和 8 小时的黑暗时间。

三到四个星期后，将再生芽转移到玻璃帐篷管中的生根介质上，并在光暗循环中继续孵育。在出现大量的根系发育后，用自来水小心地清洗根部。然后将小植株移植到有土壤的 4 英寸花盆中。用塑料袋盖住花盆，以保持植物湿润。

两天后，在塑料袋上打小孔。然后在 5 到 6 天后，取出塑料袋。继续再孵育 5 到 6 天。

将幼苗转移到装有土壤的 18 英寸花盆中，并保持在夏季充足的阳光或温室阳光下。最初的再生植物称为 T 零，而第一批种子属于 T 一代。要进行粘土木质素测量，请将样品研磨到 2 毫米的筛网中。

然后使用快速水份测定仪测定每个样品的水份含量并记录该值。称取每个样品约 1.5 克，并使用自动溶剂萃取仪记录重量。用水提取样品。

然后使用乙醇第二次提取它们。将提取的样品在 45 摄氏度下干燥过夜。然后让它们在干燥物中冷却，然后再称重。

接下来，将 0.3 克每个干燥提取的样品量入三个螺口高压管中，并将重量记录到最接近的 10 毫克。然后向每根压力管中加入 3 毫升 72% 硫酸。使用玻璃或特氟龙搅拌棒混合样品，并将搅拌棒留在试管中。

将样品瓶在 30 摄氏度下以 150 RPM 孵育 60 分钟。然后加入 84 毫升去离子水，将酸浓度稀释至 4%，与搅拌棒混合。注意不要将大量样品留在样品瓶侧面的水线以上。

将塞子密封在所有样品瓶上后，将它们放入金属架或大烧杯中，并在 121 摄氏度下高压灭菌。使用液体灭菌循环 1 小时，让它们在打开前冷却至室温。将过滤坩埚在 575 摄氏度的炉中预灰化至少四个小时。

然后，使用橡胶适配器让坩埚在干燥液中冷却至少一小时，以固定每个坩埚真空，通过单独的坩埚过滤每个管中的溶液。使用去离子水冲洗每根试管中的颗粒。在 105 摄氏度下干燥木质素残留物至少四个小时，然后记录干燥坩埚和残留物的重量。

使用 575 摄氏度的炉子。在本生灯上预烧样品，直到没有可见的烟雾或灰烬，然后再将它们放入炉中 24 小时。从炉中取出坩埚，在干燥液中冷却。

最后，使用以下等式计算酸不溶性残留物，其中 M pre 等于前 提取的生物质的质量 M post 等于 postex 提取的生物质的质量。M 样品瓶等于添加到样品瓶中的提取生物质的质量，M 残留物等于坩埚和木质素残留物的质量。M 灰分等于坩埚和灰分的质量，mc 等于萃取前生物质的水分含量。

与对照植物相比，通过 DS RNAi 粒子轰击转化使迷宫中木质素含量的总重量基础降低产生了大约 30% 的 zm CCR 基因沉默，在 T 零到 T 两代中始终观察到。转基因的生长相似，除了叶子、中肋壳和茎中的棕色，如图所示。组织学分析显示，突变细胞系表现出 scle enma 纤维的细胞壁厚度显着减少。

然而，木质部血管流和鞘细胞看起来与野生型植物相似，表明突变株系中茎的水分运输、养分转移或机械强度没有不利影响。该图显示了野生型迷宫和 zm CCR one RNAi 转基因系中酸不溶性 clason 木质素的量。与野生型植物相比，三个转基因品系显示木质素的统计学显着减少，以确定碳流是否从木质素生物合成途径转移到细胞壁碳水化合物生物合成途径。

通过图形方法分析纤维素，如图所示。两个 zm CCR 一个 RNAi 突变细胞系的结晶纤维素水平显著增加。然而，对半纤维素含量的分析显示，突变株系在其发育后没有变化。

这项技术为植物转基因视觉可视化领域的研究人员铺平了道路。该技术将为需要以高转化频率引入目标基因的研究人员提供指导。此外，我们使用的粒子轰击技术也可以应用于将基因转移到其他单子叶植物，如小麦、水稻、高粱，甚至双子叶植物。

看完这个视频，你应该对如何从 li， no cellulose 生物材料中测量克莱森木质素有了很好的了解。值得一提的是，使用 72% 硫酸可能非常危险，因此任何处理化学品的人员都应非常小心，并将化学品和安全柜放在通风橱下工作。