Name: 在伴有海藻酸钠生产新基因的鉴定铜绿假单胞菌使用小型 himar1水手转座子介导的诱变 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-10T21:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: 了解利用mini-himar1水手转座子介导的诱变技术，在铜绿假单胞菌PAO1中筛选并鉴定新型海藻酸钠调控基因的方法。该技术有助于深入理解海藻酸钠合成调控机制。

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本研究工作得到了美国国家航空航天局西弗吉尼亚太空拨款联盟（NASA WVSGC）、囊性纤维化基金会（CFF-YU11G0）以及美国国立卫生研究院（NIH）P20RR016477 和 P20GM103434 项目对西弗吉尼亚州生物医学研究卓越创新与发展计划网络（IDeA Network for Biomedical Research Excellence）的支持。&#160; 我们感谢 Vonya M. Eisinger 在本研究工作中提供的技术支持。

1. 细菌菌株的制备与双亲接合
<ol>
	<li>将含有15 µg/ml庆大霉素的5 ml LB（Luria Broth）培养基接种E. coli SM10/λpir/pFAC，并于37 °C摇床培养过夜。</li>
	<li>将P. aeruginosa菌株PAO1接种于5 ml LB培养基中，于42 °C摇床培养过夜。</li>
	<li>测定过夜培养物的OD600值，并等量混合PAO1与E. coli pFAC，使终体积为1–1.4 ml。</li>
	<li>在6,000 × g条件下离心混合液5分钟。</li>
	<li>同时，干燥用于接合的LB平板：将平板在37 °C培养箱中打开放置10–15分钟。</li>
	<li>从细胞混合物中弃去上清液，仅保留50 µl。</li>
	<li>用剩余的50 µl上清液重悬细胞沉淀，并将悬液以一小滴形式移至干燥的LB平板上。</li>
	<li>小心将平板置于通风橱中晾干（重要提示：切勿使细胞在平板上扩散，否则会显著降低接合效率）。</li>
	<li>待液滴完全干燥后，将LB平板倒置，于37 °C孵育4–6小时。</li>
	<li>在细胞混合物孵育期间，准备含300 µg/ml庆大霉素的大尺寸（150 O.D. × 15 mm）PIA平板；使用前将其置于37 °C培养箱中15–20分钟，以去除表面残留水分。</li>
	<li>细胞混合物孵育结束后，用无菌接种环收集细胞，转移至含1 ml LB的微量离心管中，通过涡旋或移液充分混匀。</li>
	<li>将细胞均匀涂布于含300 µg/ml庆大霉素的大尺寸PIA平板上。（重要提示：此步骤建议将逐渐增加的细胞混合物体积分别接种至不同平板，e.g. 平板1：10 µl，平板2：50 µl，平板3：100 µl，平板4：500 µl，&#160;etc.）</li>
	<li>于37 °C过夜培养。</li>
</ol>
2. 黏液型菌落的检测与分离
<ol>
	<li>从培养箱中取出平板，观察是否有黏液状菌落。</li>
	<li>挑取单个黏液状菌落，在含有PIA和300 µg/ml庆大霉素的小型平板（100 O.D. × 10 mm）上划线分离。</li>
	<li>在37 °C下培养过夜。</li>
	<li>对前一步过夜培养物重复步骤&#160;2.2。</li>
	<li>再重复步骤&#160;2.2–2.4 两次，以确定黏液状分离株的稳定性。</li>
	<li>最终分离步骤完成后，用单个黏液状菌落接种4.5 ml LB培养基，在37 °C摇床中过夜培养。</li>
	<li>次日，为每个黏液状突变株标记3个微量离心管。</li>
	<li>将过夜培养物分别取1.25 ml两份加入两个离心管中，用于基因组DNA提取及转座子插入位点的鉴定（见方案3）。</li>
	<li>此外，通过移液将1 ml过夜培养物加入已标记妥当、含有等体积10%脱脂牛奶的冻存管中，以保存各黏液状突变株。于-86 °C保存。</li>
</ol>
3. 基因组DNA的限制性消化与连接
<ol>
	<li>使用任何首选方法从黏液状突变体中提取基因组DNA（gDNA）例如酚-氯仿，离心柱 等。).</li>
	<li>测定gDNA的浓度，用1 µl限制性内切酶SalI、0.5 µl牛血清白蛋白和5 µl SalI酶缓冲液（100 mM NaCl，50 mM Tris-HCl，10 mM MgCl）对总共2 µg的gDNA进行消化2，1 mM 二硫苏糖醇（DTT），室温下 pH 7.9），以及适量体积的 dH₂O2O，使总体积达到50 µl。</li>
	<li>37 °C 过夜消化 DNA。（重要提示：根据限制性内切酶的效率，可能需要在过夜消化后额外加入 1 µl 酶，并在 37 °C 继续孵育 1–2 小时。此步骤为过夜消化之外的补充操作。）</li>
	<li>使用任何首选方法纯化已消化的DNA（例如 琼脂糖凝胶纯化、离心柱）并用 25 µl 缓冲液洗脱。</li>
	<li>将纯化的DNA约11 µl（浓度优选为~10–20 ng/µl）与1.5 µl连接缓冲液（330 mM Tris-乙酸盐，pH 7.5，660 mM乙酸钾，100 mM乙酸镁，5 mM DTT）、1.5 µl 100 mM ATP和1 µl DNA连接酶混合，进行消化后DNA的连接反应。</li>
	<li>将混合物在室温下孵育15分钟，然后在70 °C孵育15分钟以灭活酶。（注意：延长室温孵育时间可能提高连接反应的成功率）。</li>
</ol>
4. 反向PCR（iPCR）与序列分析
<ol>
	<li>使用以下正向和反向引物及热循环条件对连接产物进行 iPCR： 
	-上游引物（Gm3OUT）：GGGCATACGGGAAGAAGTGA 
	- 反向引物（Gm5OUT）：GACTGCCCTGCTGCGTAACA 
	热循环仪条件： 
	1. 94 °C，1 分钟。 
	2. 94 °C 下变性 1 分钟。 
	3. 58 °C 反应 2 分钟。 
	4. 72 °C 反应 2 分钟。 
	5. 72 °C 反应 8 分钟。 
	6. 10 °C 保持。 
	重复步骤 2-4，共 34 个循环。 
	（注意：扩增的iPCR产物可在4 °C保存。）</li>
	<li>通过琼脂糖凝胶电泳确认iPCR扩增是否成功。</li>
	<li>使用 Gm3OUT 和 Gm5OUT 引物对 iPCR 产物进行测序。确定插入位点及插入片段的方向 himar1 被绘制出来。</li>
</ol>

<ol><li>Govan, J. R., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+pathogenesis+in+cystic+fibrosis%3A+mucoid+Pseudomonas+aeruginosa+and+Burkholderia+cepacia%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia.</a> Microbiol. Rev. 60, 539-574 (1996).</li>
<li>Chitnis, C. E., Ohman, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+the+alginate+biosynthetic+gene+cluster+of+Pseudomonas+aeruginosa+shows+evidence+of+an+operonic+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of the alginate biosynthetic gene cluster of Pseudomonas aeruginosa shows evidence of an operonic structure.</a> Mol. Microbiol. 8, 583-593 (1993).</li>
<li>Franklin, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+AlgG+is+a+polymer+level+alginate+C5-mannuronan+epimerase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa AlgG is a polymer level alginate C5-mannuronan epimerase.</a> J. Bacteriol. 176, 1821-1830 (1994).</li>
<li>Franklin, M. J., Ohman, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+analysis+and+cellular+localization+of+the+AlgI%2C+AlgJ%2C+and+AlgF+proteins+required+for+O+acetylation+of+alginate+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Mutant analysis and cellular localization of the AlgI, AlgJ, and AlgF proteins required for O acetylation of alginate in Pseudomonas aeruginosa.</a> J. Bacteriol. 184, 3000-3007 (2002).</li>
<li>Deretic, V., Gill, J. F., Chakrabarty, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+algD+coding+for+GDPmannose+dehydrogenase+is+transcriptionally+activated+in+mucoid+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Gene algD coding for GDPmannose dehydrogenase is transcriptionally activated in mucoid Pseudomonas aeruginosa.</a> J. Bacteriol. 169, 351-358 (1987).</li>
<li>Mathee, K., McPherson, C. J., Ohman, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranslational+control+of+the+algT+%28algU%29-encoded+sigma22+for+expression+of+the+alginate+regulon+in+Pseudomonas+aeruginosa+and+localization+of+its+antagonist+proteins+MucA+and+MucB+%28AlgN%29.%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Posttranslational control of the algT (algU)-encoded sigma22 for expression of the alginate regulon in Pseudomonas aeruginosa and localization of its antagonist proteins MucA and MucB (AlgN).</a> J. Bacteriol. 179, 3711-3720 (1997).</li>
<li>Boucher, J. C., Schurr, M. J., Yu, H., Rowen, D. W., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+in+cystic+fibrosis%3A+role+of+mucC+in+the+regulation+of+alginate+production+and+stress+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis: role of mucC in the regulation of alginate production and stress sensitivity.</a> Microbiology. 143, 3473-3480 (1997).</li>
<li>Martin, D. W., Holloway, B. W., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+locus+determining+the+mucoid+status+of+Pseudomonas+aeruginosa%3A+AlgU+shows+sequence+similarities+with+a+Bacillus+sigma+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Characterization of a locus determining the mucoid status of Pseudomonas aeruginosa: AlgU shows sequence similarities with a Bacillus sigma factor.</a> J. Bacteriol. 175, 1153-1164 (1993).</li>
<li>Damron, F. H., Goldberg, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolytic+regulation+of+alginate+overproduction+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Proteolytic regulation of alginate overproduction in Pseudomonas aeruginosa.</a> Mol. Microbiol. 84 (4), 595-607 (2012).</li>
<li>Browne, P., Barret, M., O'Gara, F., Morrissey, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+prediction+of+the+Crc+regulon+identifies+genus-wide+and+species-specific+targets+of+catabolite+repression+control+in+Pseudomonas+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Computational prediction of the Crc regulon identifies genus-wide and species-specific targets of catabolite repression control in Pseudomonas bacteria.</a> BMC Microbiol. 10, 300 (2010).</li>
<li>Damron, F. H., Qiu, D., Yu, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Pseudomonas+aeruginosa+sensor+kinase+KinB+negatively+controls+alginate+production+through+AlgW-dependent+MucA+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The Pseudomonas aeruginosa sensor kinase KinB negatively controls alginate production through AlgW-dependent MucA proteolysis.</a> J. Bacteriol. 191, 2285-2295 (2009).</li>
<li>Damron, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+Pseudomonas+aeruginosa+regulon+controlled+by+the+sensor+kinase+KinB+and+sigma+factor+RpoN%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the Pseudomonas aeruginosa regulon controlled by the sensor kinase KinB and sigma factor RpoN.</a> J. Bacteriol. 194, 1317-1330 (2012).</li>
<li>Qiu, D., Eisinger, V. M., Rowen, D. W., Yu, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+proteolysis+controls+mucoid+conversion+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Regulated proteolysis controls mucoid conversion in Pseudomonas aeruginosa.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 8107-8112 (2007).</li>
<li>Schurr, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Which+bacterial+biofilm+exopolysaccharide+is+preferred%2C+Psl+or+alginate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Which bacterial biofilm exopolysaccharide is preferred, Psl or alginate.</a> J. Bacteriol. 195, 1623-1626 (2013).</li>
<li>Wong, S. M., Mekalanos, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+footprinting+with+mariner-based+transposition+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Genetic footprinting with mariner-based transposition in Pseudomonas aeruginosa.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 10191-10196 (2000).</li>
<li>Lampe, D. J., Akerley, B. J., Rubin, E. J., Mekalanos, J. J., Robertson, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperactive+transposase+mutants+of+the+Himar1+mariner+transposon%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Hyperactive transposase mutants of the Himar1 mariner transposon.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 11428-11433 (1999).</li>
</ol>

作者 Hongwei D. Yu 是 Progenesis Technologies, LLC 的首席科学官兼联合创始人。

需要注意的是，该方法也可用于其他假单胞菌属（Pseudomonas）物种，但需进行以下修改：荧光假单胞菌（P. fluorescens）和恶臭假单胞菌（P. putida）应在30 °C下培养，而施氏假单胞菌（P. stutzeri）则应在42 °C下培养；施氏假单胞菌（P. stuzeri）应接种于添加了150 µg/mL庆大霉素的LB平板上；在步骤1.11中，应将施氏假单胞菌（P. stutzeri）细胞转移至500 µl LB培养基中，而非1 ml。此外，本实验方案中有两个关键步骤。首先，受体菌株必须在适当的温度下培养。例如，PAO1应在42 °C下培养，以提高重组频率15。如果受体菌株未在正确温度下培养，突变文库的效率将显著降低。其次，反向PCR（iPCR）具有高度可重复性，但基因组DNA（gDNA）必须完全消化，以确保可通过DNA连接形成共价闭合的环状DNA。若操作正确，iPCR产物在琼脂糖凝胶电泳中应呈现为单一条带。若出现多条条带，则表明该突变体中存在多个插入片段。我们发现，iPCR结果与Sout...

机会性革兰氏阴性病原体的能力 铜绿假单胞菌 过度产生藻酸盐是其形成生物膜能力的关键因素。藻酸盐的过度产生是一种常被称为黏液型的表型。从囊性纤维化（CF）患者痰液中分离出黏液型菌落，提示存在慢性感染，并与患者整体健康状况恶化直接相关。1目前认为，藻酸盐的调控与合成机制涉及 P. aeruginosa 主要发生在两个操纵子上。第一个是海藻酸生物合成操纵子，包含12个基因（algD-alg8-alg44-algK-algE-algG-algX-algL-algI-algJ-algF-algA负责将藻酸盐聚合物在周质空间合成并转运至胞外环境的蛋白2-5第二个操纵子是以替代σ因子开头的一组基因簇 algU/T 并继续进行 mucA, mucB，以及 mucDAlgU/T 是一种正向调控因子，而 mucAB-D 被归类为藻酸盐生成的负调控因子6-8此外，转录调控因子（如 AlgB、AlgQ、AlgR 和 RpoN）以及通过分解代谢物阻遏控制、激酶活性（KinB）和膜内蛋白水解所介导的转录后和翻译后修饰也被证实参与了藻酸盐的调控。9-14.
一种名为 pFAC 的 mini-himar1 转座子载体最初由哈佛医学院 Mekalanos 博士的实验室构建15。pFAC 质粒包含一个可移动元件，该元件两侧为两个27 bp的反向重复序列，中间携带一个庆大霉素抗性盒（aacC1：534 bp）、一个编码高活性mariner转座酶的基因16，以及一个编码β-内酰胺酶（bla）的基因（图1）。pFAC 可移动元件的序列信息可在 GenBank 登录号 DQ36630013 中获取。在 pFAC 中，aacC1 基因后方设有一个多克隆位点（MCS），可用于通过反向PCR鉴定染色体插入位点。使用 mini-himar1 转座子的一个主要优势是转座（诱变）过程不需要特定的宿主因子。此外，在P. aeruginosa基因组中广泛存在TA二核苷酸插入位点。例如，在PAO1（6,264,404 bp，GenBank登录号NC_002516.2）和PA14（6,537,648 bp；GenBank登录号NC_008463）基因组中，TA二核苷酸插入位点分别出现94,404次和100,229次。由于基因组中TA二核苷酸高度富集，mini-himar1转座子能够实现高密度且随机的诱变，特别适用于毒力基因及高度调控基因的分析。理论上，mini-himar1转座子可插入P. aeruginosa基因组中任意非必需基因内，在PAO1基因组中每个开放阅读框平均约有18个TA插入位点。
此处，我们介绍一种使用微型装置的实验方案himar1 转座子介导的诱变用于鉴定黏液型调控新因子 P. aeruginosa更具体而言，我们通过双亲接合将含有迷你-的 pFAC 载体himar1 转座子来自 E. coli SM10/λpir 转入非黏液型原养型菌株 PAO1。转座子整合至基因组后，将受体菌株在 假单胞菌 含三氯生的分离琼脂（PIA），可抑制细菌生长 E. coli因此，一个突变体文库 P. aeruginosa 可在添加了庆大霉素的PIA平板上通过生长情况及黏液表型的存在进行筛选。注意，真正的转座子介导的 与 一种整合突变体会表现出对庆大霉素耐药且对羧苄西林敏感的表型。在本研究中，通过四次独立的接合转移实验，共分离得到约80,000株PAO1插入突变体。随后，我们筛选出黏液型菌落，并通过限制性内切酶消化、连接和反向PCR确定插入位点。我们以庆大霉素抗性盒作为探针进行Southern印迹分析，以检测每个基因组中的插入拷贝数。结果表明，采用该方案每次接合获得的突变体中，超过90%的菌株基因组中仅含有单个插入拷贝。 himar1 基因组中，并表现出对庆大霉素耐药、羧苄西林敏感的表型。共鉴定出32株黏液型分离株，其中22株被定位至不同的基因位点 P. aeruginosa PAO1 染色体。该插入率足以提供充分的覆盖度，以鉴定出多个新的海藻酸盐过量产生的调控因子。

<table><tbody><tr><td>LB培养基（Luria Broth）</td><td>Difco</td><td>240230</td><td>通过Fisher Scientific购买</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Pseudomonas&lt;/em&gt;分离琼脂</td><td>Difco</td><td>292710</td><td>通过Fisher Scientific购买</td></tr><tr><td>小型培养皿（100 O.D. × 10 mm）</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-13</td><td></td></tr><tr><td>大型培养皿（150 O.D. × 15 mm）</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-14</td><td></td></tr><tr><td>甘油（Glycerol）</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-4</td><td></td></tr><tr><td>台式摇床培养箱</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Innova 4080</td><td>以200 rpm振荡</td></tr><tr><td>恒温培养箱</td><td>VWR</td><td>1540</td><td></td></tr><tr><td>台式微量离心机</td><td>Sorvall</td><td>75-003-287</td><td>通过Fisher Scientific购买</td></tr><tr><td>SmartSpec Plus分光光度计</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2525</td><td>或选用其他方法/供应商</td></tr><tr><td>一次性接种环</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-597</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml微量离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>2.0 ml冻存管</td><td>Corning</td><td>430659</td><td>通过Fisher Scientific购买</td></tr><tr><td>15 ml离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-12</td><td></td></tr><tr><td>脱脂奶粉（Skim Milk）</td><td>Difco</td><td>DF0032-17-3</td><td>通过Fisher Scientific购买</td></tr><tr><td>DNeasy血液与组织试剂盒（250）&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td>或选用其他方法/供应商</td></tr><tr><td>QIAquick PCR纯化试剂盒（250）</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td>或选用其他方法/供应商</td></tr><tr><td>QIAprep Spin质粒小提试剂盒（250）&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>或选用其他方法/供应商</td></tr><tr><td>FastLink II DNA连接试剂盒</td><td>Epicentre Technologies</td><td>LK6201H</td><td>通过Fisher Scientific购买</td></tr><tr><td>Accu block数字干式恒温器&amp;nbsp;</td><td>Labnet</td><td>NC0205808</td><td>通过Fisher Scientific购买</td></tr><tr><td>SalI限制性内切酶</td><td>New England BioLabs</td><td>R0138L</td><td></td></tr><tr><td>EasyStart Micro 50</td><td>Molecular BioProducts</td><td>6020</td><td>通过Fisher Scientific购买</td></tr><tr><td>Taq DNA聚合酶</td><td>New England BioLabs</td><td>M0267L</td><td></td></tr><tr><td>iCycler梯度PCR仪</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8740</td><td></td></tr><tr><td>LE琼脂糖</td><td>Genemate</td><td>3120-500</td><td>通过Fisher Scientific购买</td></tr><tr><td>硫酸庆大霉素（Gentamycin Sulfate）</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP918-1</td><td></td></tr><tr><td>2.0 ml冻存管</td><td>Corning</td><td>430659</td><td>通过Fisher Scientific购买</td></tr></tbody></table>

鉴定与海藻酸盐产生相关的新基因 铜绿假单胞菌 使用微型装置himar1 mariner 转座子介导的诱变

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

铜绿假单胞菌 是一种革兰氏阴性环境细菌，具有多样的代谢能力。 P. aeruginosa 是一种机会性细菌病原体，可在囊性纤维化（CF）患者中引起慢性肺部感染。该菌过度产生一种称为藻酸盐的荚膜多糖，这一表型也被称为黏液状表型（mucoidy），可促进形成黏液状生物膜，这类生物膜对抗生素化疗和宿主防御机制的抵抗力强于浮游状态的细菌细胞。此外，由非黏液状向黏液状表型的转化是CF患者进入慢性感染阶段的临床标志。藻酸盐的过度产生由 P. aeruginosa 是一个吸能过程，会大量消耗细胞能量。因此，海藻酸盐的合成在细胞内受到严格调控 P. aeruginosa为了更好地理解海藻酸盐的调控机制，我们描述了一种使用微型装置的实验方案himar1 转座子诱变法用于鉴定原型菌株PAO1中新的海藻酸盐调控因子。该实验流程包括两个基本步骤。首先，我们转移了mini-himar1 转座子（pFAC）从宿主 E. coli SM10/λpir 转入受体菌 P. aeruginosa PAO1 通过 双亲接合以构建高密度插入突变体文库，并在后续进行筛选 假单胞菌 添加庆大霉素的分离琼脂平板。其次，我们筛选并分离黏液型菌落，利用指向庆大霉素抗性盒外侧的DNA引物进行反向PCR，并结合DNA测序以定位插入位点。通过该方案，我们已鉴定出两个新的海藻酸盐调控因子， mucE (PA4033) 和 kinB (PA5484)，在野生型菌株PAO1中 mucA 编码抗σ因子MucA，该因子作用于藻酸盐合成主要调控因子AlgU（AlgT，σ22该高通量诱变方案可经修改用于鉴定其他与毒力相关且导致菌落形态改变的基因。

如图1所示，微型-himar1 mariner 转座子载体 pFAC 包含两段27 bp的反向重复序列，其侧翼为插入位点TA，中间为aacC1庆大霉素抗性盒及其依赖σ70的启动子，以及一个多克隆位点（MCS）。此外，pFAC载体还含有编码高活性himar1转座酶、β-内酰胺酶（bla）以及tra转移操纵子的基因。TA插入位点可实现该载体在铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）菌株基因组中的高效整合。准确识别和筛选黏液型突变体对于确定参与藻酸盐调控的基因位点至关重要。图1展示了黏液型和非黏液型分离株的示例。
为了更准确地鉴定黏液型突变株，应将完成的接合反应产物接种到多个大培养皿（150 mm）上。将细胞混合物重悬于无菌PBS中，并涂布于含庆大霉素（300 µg/ml）的PIA平板上。用PBS对细胞混合物进行梯度稀释，使每个平板上长出1,000–3,000个菌落。根据上述方案，每次接合反...

在此，我们介绍一种使用微型装置的实验方案himar1 mariner转座子介导的诱变用于构建高密度插入突变体文库，以筛选、分离和鉴定模式菌株中新的海藻酸盐调控因子 铜绿假单胞菌 菌株PAO1

鉴定与海藻酸盐产生相关的新基因 铜绿假单胞菌 使用微型装置himar1 Mariner 转座子介导的诱变

铜绿假单胞菌是一种革兰氏阴性环境细菌，具有多样化的代谢能力。铜绿假单胞菌是一种机会性细菌……

本实验的总体目标是利用mini-Himar1转座子介导的突变技术，鉴定与铜绿假单胞菌产生胞外多糖藻酸盐相关的新基因。首先分别培养两种过夜培养物：携带PAC质粒的大肠杆菌Lambda Pir供体菌株和受体细胞铜绿假单胞菌PAO1。随后通过将大肠杆菌Lambda Pir与铜绿假单胞菌共培养，实现PAC质粒的接合转移。在假单胞菌分离琼脂上筛选PAO1及其接合子，然后在PIA平板上鉴定并分离黏液型菌落。最后，确定mini-heMar1转座子在铜绿假单胞菌PAO1基因组中插入位点的位置和方向。最终，利用mini-heR1转座子介导的诱变技术，鉴定并表征与铜绿假单胞菌藻酸盐生成相关的基因。该方法有助于回答微生物学和细菌遗传学领域中的关键问题，例如鉴定参与调控不同细胞功能的遗传位点，本文将通过实验演示该流程。本实验室的一名研究生指出，微型的 he R one Mariner 转座子载体 P fac 包含一对 227 个碱基对的反向重复序列，其两侧为 TA 插入位点，中间夹有 A CC one 庆大霉素抗性表达盒，该表达盒上游含有依赖 Sigma 70 的启动子，并位于多克隆位点的上游。PFAC 载体还包含编码高活性 he R one 转座酶、β-内酰胺酶以及 TRA 转移操作相关的基因。TA 插入位点可实现向产气假单胞菌菌株基因组的高效整合。准确鉴定和筛选 OID 突变体对于确定参与藻酸盐调控的基因位点至关重要。准备细菌菌株时，首先将大肠杆菌 SM 10 λpir pFac 接种于 5 毫升 LB 培养基中，添加 15 µg/mL 的庆大霉素，并于同一天在 37°C 条件下置于摇床培养箱中过夜培养。将posa菌株PO接种于5毫升LB培养基中，于42摄氏度摇床培养过夜，次日进行后续操作。测定过夜培养物在600纳米处的光密度（OD 600），并取等量的PAO1与大肠杆菌P fac混合，使终体积介于1毫升至1.4毫升之间。将混合液在6,000 × g离心5分钟。同时，将用于接合的LB平板置于37摄氏度培养箱中敞口干燥10至15分钟。从细胞混合物中移除上清液，仅保留50微升。然后重悬。将细胞沉淀重悬于剩余的50微升上清液中，用移液器吸取后滴加到干燥的LB平板上。将平板置于通风橱中，小心放置，使液滴保持紧凑并自然干燥。切勿让细胞在平板上扩散开。这将显著降低偶联效率。待液滴干燥后，将LB平板倒置，并在37摄氏度下培养4至6小时，同时继续孵育细胞混合物。准备含有300微克/毫升庆大霉素的大型假单胞菌分离琼脂（PIA）平板。孵育结束后，使用无菌接种环将该单个液滴中的细胞收集到含有1 mL LB培养基的微量离心管中，涡旋或用移液器充分混匀，然后将细胞均匀涂布于大型PIA平板上。将平板置于37°C过夜孵育。从孵育箱中取出平板，观察OID菌落的形成情况。挑取单个 moid 菌落，在含有 PIA 和每毫升 300 微克庆大霉素的平板上划线分离。次日，再次挑取单个 moid 菌落并重复划线操作。在初次分离后，重复单菌落分离共两次，以确定 moid 分离株的稳定性。步骤：用单个OID菌落接种4.5毫升LB培养基，在37摄氏度摇床中过夜培养。第二天，为每个OID突变株标记三个微量离心管。取过夜培养物制备两份1.25毫升的等份样品，用于基因组DNA提取及转座子插入位点的鉴定。此外，通过移液枪吸取一毫升过夜培养物，加入到含有等体积10%脱脂牛奶的适当标记的冻存管中，以保存每个OID突变株。在负86摄氏度下保存。在从MOID突变株中提取基因组DNA后。采用任意首选方法测定浓度后，总共取两微克DNA，加入一微升限制性内切酶S one，在总体积为50微升的体系中，37摄氏度下过夜消化。将消化后的DNA采用任意首选方法纯化，最终体积为25微升。随后，取约11微升DNA进行连接反应，并在室温下孵育至少15分钟。然后在70摄氏度下灭活15分钟，对连接产物使用以下正向和反向引物以及相应的热循环条件进行反向PCR（IPCR）。然后在使用GM three out和GM five out引物对反应进行测序之前，通过AROS凝胶验证扩增结果。本图展示了MOID和非MOID分离株的示例。根据本视频演示的方案，由于藻酸盐的过量产生，每次接合反应应在15至20个大培养皿上产生约20,000个突变株的文库。菌落应呈透明或白色，具有奶油状或黏液状外观。若诱变和DNA扩增成功，则应出现一条大小合适的单一扩增产物，如本图所示。PAO1中无IPCR扩增产物。然而，我们在PA、PA O1 VE2和PA O1 VE13中分别检测到一条约1,400个碱基对和约1,000个碱基对的单一扩增片段。这些扩增片段的大小表明，HER1 mariner转座子分别插入至PA O1 VE2中PA4033基因启动子区域，以及PA O1 VE13 PA O1基因组DNA中PA5484基因的内部。经过限制性酶切、消化和连接处理的基因组DNA可作为阴性对照。因此，一旦掌握，只要操作得当，该技术可在三到四天内完成。在进行该实验步骤时，务必记住在亲本接合前将菌株于适宜温度下进行孵育。

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