Name: 糖肽捕获的细胞表面蛋白组学 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-09T20:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: 学习糖肽捕获方法富集低丰度细胞膜蛋白的技术流程。该方法通过氧化糖链并使用树脂捕获糖基化肽段，经LC-MS分析实现蛋白质的鉴定与定量，适用于蛋白质组学和疾病生物标志物发现研究。

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本研究得到了西蒙弗雷泽大学启动资金的支持。&#160;

1. 收集膜
<ol>
	<li>将低渗缓冲液（10 mM Tris-HCl, 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, pH 8.0）加入细胞沉淀（约108个细胞）中，并在冰上孵育15-30分钟。通过注射器针头反复吹打（5-10次）或使用Dounce匀浆器匀浆（15-30次）裂解细胞。使用血细胞计数板和台盼蓝染色检测裂解效率。</li>
	<li>通过差速离心法从裂解物中获取微粒体组分：先在3,000 g条件下离心15分钟，随后在100,000 g条件下离心2小时。第一次离心所得沉淀为细胞核组分，将上清液进一步离心后获得的第二次沉淀即为微粒体组分，其中包含质膜及膜结合细胞器8。最终的上清液为胞质组分。将微粒体组分储存于-80 °C冰箱中，以供后续分析使用。</li>
</ol>
2. 溶解、变性及消化膜蛋白
<ol>
	<li>将微粒体组分溶解于变性缓冲液（40 mM Tris，10 mM EDTA，10 mM TCEP，0.5% Rapigest，pH 8）中，然后在100 °C孵育10分钟。</li>
	<li>将加热后的溶液冷却至室温，加入超纯尿素粉末至终浓度为8 M，于37 °C孵育30分钟。</li>
	<li>向样品中加入碘乙酰胺贮存液，使其终浓度为15 mM，在室温下避光孵育30分钟，以烷基化样品中的游离巯基。随后向样品中加入DTT贮存液，使其终浓度为10 mM，在室温下继续孵育10分钟，以淬灭过量的碘乙酰胺。</li>
	<li>将所得溶液稀释10倍&#160;用 pH 8 的 40 mM Tris 缓冲液重悬样品，随后按胰蛋白酶与总蛋白 1:20 的比例加入胰蛋白酶。将消化反应置于 37 °C 培养箱中过夜，以确保反应完全。</li>
	<li>用 HCl 将样品溶液酸化至 pH 1 以终止消化，此条件同时可降解去垢剂。 即 Rapigest。在37 °C下孵育1小时以降解Rapigest，然后通过离心去除生成的沉淀。</li>
	<li>使用C-18固相萃取（SPE）小柱纯化含有样本肽的上清液，并通过真空离心浓缩仪将所得样本干燥。</li>
	<li>对胰蛋白酶消化前后的样品进行SDS-PAGE分析，以确认消化效率。</li>
</ol>
3. 糖肽富集
<ol>
	<li>将清洗后的肽段溶解于偶联缓冲液（100 mM 醋酸钠，pH 5.5）中。在避光、室温条件下，向肽段溶液中加入高碘酸钠，使其终浓度为 10 mM，反应 30 分钟。此步骤可将糖链中的顺式二醇基团氧化为醛基，从而使糖链可通过肼化学与树脂偶联。加入亚硫酸钠至终浓度 20 mM，并调节 pH 至 5，室温反应 10 分钟，以淬灭过量的高碘酸盐。</li>
	<li>将酰肼衍生化树脂以1:4（树脂与溶液）的比例加入肽溶液中，使糖肽与树脂偶联。在37 °C下孵育反应体系1-2天，并进行末端旋转混匀，以确保完全偶联。</li>
	<li>用以下每种1 ml溶液各洗涤树脂两次，以去除未结合的肽：去离子水&#160;水、1.5 M NaCl、甲醇和80%乙腈。最后，用以下溶剂将树脂洗涤3次&#160;用1 ml 100 mM NH4HCO3 在 pH 8 条件下进行缓冲液置换，使体系缓冲液变为 100 mM NH4HCO3.
	<ol>
		<li>收集上清液和洗涤液，用于分析未结合的肽段（可选）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在37 °C下用PNGase F对树脂中的N-糖肽进行过夜孵育，并以端对端旋转方式释放N-糖肽。通过离心收集释放的肽段，并用80%乙腈洗涤。将所得溶液在真空浓缩仪中干燥，用于LC-MS分析。</li>
</ol>
4. 进一步分级分离（可选）
为进一步简化样品复杂性，对获得的N-糖肽进行分级分离。例如，将干燥的肽重新溶解于含20%乙腈的pH 3、10 mM甲酸铵缓冲液中，使用强&#160;阳离子&#160;交换（SCX）色谱法对肽进行分级分离。将所得洗脱液干燥后，通过反相液相色谱-质谱（LC-MS）分析获得的肽段组分8,17,18。
5. 释放的N-糖肽的纯化（可选）
如果担心肽段可能存在污染，可将干燥的肽段重新溶解于0.1%甲酸中，并使用MCX SPE柱在反相液相色谱-质谱分析前进一步纯化肽段。
注意：数据库搜索参数。
在选择性切割N-糖肽使其从树脂上释放的过程中，PNGase F会将与天冬酰胺相连的N-糖链转化为天冬氨酸。因此，释放出的N-糖肽会发生0.9840 Da的质量偏移。为了准确鉴定这些肽段，需在搜索参数中添加该修饰，同时加入半胱氨酸的羧甲基化和甲硫氨酸的氧化等常见修饰。

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<li>Sun, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycocapture-assisted+global+quantitative+proteomics+%28gagQP%29+reveals+multiorgan+responses+in+serum+toxicoproteome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Glycocapture-assisted global quantitative proteomics (gagQP) reveals multiorgan responses in serum toxicoproteome.</a> J Proteome Res. 12, 2034-2044 (2013).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性财务利益。&#160;

本文介绍了一种用于分析细胞表面蛋白质的糖肽捕获策略。该方法可应用于研究分泌蛋白，例如血液中的蛋白，以及其他体液或细胞培养基中的蛋白。
该方法的成功依赖于样品的完全消化，因此有必要对消化效率进行SDS-PAGE表征，尤其是首次分析某一样品时。膜蛋白的完全消化具有挑战性，只有在膜组分被充分溶解后才可能实现。溶解过程始于去垢剂的加入，并在尿素孵育后完成。因此，如果样品在加入尿素前出现浑浊，但在尿素孵育后浑浊消失，则表明溶解充分。如果膜组分难以溶解，可增加去垢剂的用量。对于富含膜结构的组织样品（如脑组织和脂肪组织），可使用5% Rapigest。有时，在胰蛋白酶消化前的样品稀释过程中会出现沉淀，这种情况在人血清样品中更为常见。产生沉淀的主要原因是尿素和去垢剂浓度的降低。这种沉淀通常会在消化过程中被胰蛋白酶降解，一般无需担忧。然而，一旦形成沉淀，在消化步骤中必须旋转样品管以确保充分混匀。糖捕获步骤的pH值至关重要，因为肽段中的伯胺基团（如N端和赖氨酸残基）会在高碘酸盐氧化后与新形成的醛基发生反应。因此，必须使用乙酸盐缓冲液将捕获溶液的pH调节至6.0以下，使这些胺基质子化，从而防止其干扰捕获...

细胞表面蛋白与细胞外环境相互作用，并将细胞外信号传递至细胞内部。因此，这些蛋白&#160;（包括细胞外基质蛋白）&#160;在细胞生物学和生理学的各个方面发挥着关键作用，涵盖增殖、生长、迁移、分化以及衰老等过程。表面蛋白通过与其他细胞、蛋白以及小分子相互作用而发挥功能1-3。对细胞表面蛋白进行分子表征不仅受到生物学家的高度关注，也受到制药企业的重视，因为超过60%的药物靶向作用于细胞表面蛋白4。
串联质谱法（MS）因其在蛋白质和多肽鉴定中具有优异的灵敏度、准确性和通量，已成为全局蛋白质组学研究的有力工具5,6。然而，细胞表面蛋白对基于质谱的蛋白质组学分析构成了重大挑战，因为大多数表面蛋白含量较低且存在大量修饰。表面蛋白的跨膜区域使其具有疏水性，对于多次跨膜蛋白尤其如此。因此，在没有去垢剂的情况下，很难将膜蛋白溶解于水溶液中；然而，去垢剂的使用通常会抑制高效液相色谱（HPLC）和质谱（MS）在蛋白质鉴定中的性能1,7,8。因此，在直接基于液相色谱-质谱（LC-MS）的蛋白质组学分析中，膜蛋白的表征仍不充分。
糖基化是发生在细胞表面蛋白质中最重要且最丰富的翻译后修饰之一9。糖链结构的高度复杂性和异质性会干扰肽段的质谱信号10。尽管如此，已有多种蛋白质组学方法利用这一独特修饰来富集表面蛋白，并在液相色谱-质谱（LC-MS）分析前去除蛋白质上的糖基。这些方法包括基于凝集素的亲和捕获11、基于肼化学或硼酸化学的捕获方法12，以及亲水相互作用色谱分离技术8,13。去除糖链可将膜蛋白转化为常规蛋白质，从而显著简化质谱表征过程。由于糖基化也存在于与膜蛋白相比具有更高溶解度的分泌蛋白中，许多糖蛋白质组学方法均针对可溶性蛋白进行了优化，因此在应用于膜蛋白时往往表现出较低的糖肽选择性和灵敏度8,14。此外，还存在其他专门用于富集细胞表面蛋白的方法，例如超速离心法15和标记策略16。最近一项研究对本方法与其他现有膜蛋白表征方法进行了详细比较17，结果表明，本方法在操作更简便的同时，性能至少与所比较的其他膜蛋白质组学方法相当，甚至更优。
为了帮助研究人员使用该方法，本文详细描述了一种通用实验方案。该方法整合了现有糖蛋白质组学策略的多项优势，并专门针对膜糖蛋白设计，但同样适用于分泌蛋白。本方法的特点包括：1）膜蛋白的完全溶解；2）富集糖肽而非糖蛋白，以避免使用固相捕获基质时可能产生的空间位阻；3）利用肼化学法在糖肽与捕获基质之间形成共价键，使结合的糖肽能够耐受严格洗涤，从而实现高糖选择性；4）整个捕获过程可在单管中完成，减少样品损失并缩短操作时间。在将该方法应用于多种生物样品（包括细胞和组织）的研究后，我们观察到对糖蛋白具有高选择性（&#62; 90%）8,17,18。

<table><tbody><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>646563</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Sigma</td><td>646547</td><td></td></tr><tr><td>碘乙酰胺</td><td>Sigma</td><td>A3221</td><td></td></tr><tr><td>Rapigest SF</td><td>Waters</td><td>186001860</td><td></td></tr><tr><td>高碘酸钠</td><td>Sigma</td><td>311448</td><td></td></tr><tr><td>PNGase F</td><td>New England Biolabs</td><td>P0704S</td><td></td></tr><tr><td>Affi-Gel Hz 肼化凝胶</td><td>Bio-Rad</td><td>153-6047</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Worthington Biomedical</td><td>LS02115</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak C-18 小柱</td><td>Waters</td><td>WAT054955</td><td></td></tr><tr><td>Oasis MCX 小柱</td><td>Waters</td><td>186000252</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>Amersco</td><td>568</td><td></td></tr><tr><td>亚硫酸钠</td><td>Caledon</td><td>8360-1</td><td></td></tr><tr><td>转化酶</td><td>Sigma</td><td>I0408</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-1 胰蛋白酶</td><td>Sigma</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr><td>核糖核酸酶 B</td><td>Sigma</td><td>R7884</td><td></td></tr><tr><td>亲和素</td><td>Sigma</td><td>A9275</td><td></td></tr><tr><td>卵白蛋白</td><td>Sigma</td><td>A5503</td><td></td></tr><tr><td>伴清蛋白</td><td>Sigma</td><td>C0755</td><td></td></tr></tbody></table>

用于细胞表面蛋白质组学的糖肽捕获

Glycopeptide Capture for Cell Surface Proteomics

细胞表面蛋白（包括细胞外基质蛋白）参与细胞生长、分化和增殖等各种主要的细胞过程与功能。对这些蛋白进行全面表征，可为生物标志物发现、细胞类型鉴定和药物靶点筛选提供丰富信息，同时有助于深入理解细胞生物学与生理学。然而，由于表面蛋白本身丰度低、疏水性强且存在大量翻译后修饰，给分析带来显著挑战。我们利用表面蛋白普遍存在的糖基化特性，提出一种高通量糖肽富集方法，整合了多种现有N-糖蛋白质组学技术的优势。该方法可富集来源于表面蛋白的糖肽，并去除其糖链，从而便于通过液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）进行蛋白质组学分析。所解析的N-糖蛋白质组包含蛋白质的身份信息、表达量及其糖基化位点信息。该方法已成功应用于癌症、干细胞及药物毒性等多个领域的系列研究。该方法的局限性在于表面膜蛋白丰度较低，因此与以胞质蛋白为中心的研究相比，本分析需要相对更多的样本量。

实验流程的代表性流程图见图1。标记及进一步分级步骤为可选步骤，相关细节已在近期一篇文献中描述18。另一种选择是分析未修饰的肽段，即未与树脂发生反应的肽段。分析未修饰肽段的优势包括可能鉴定出非糖基化肽段和蛋白质，例如紧密连接中的claudin蛋白；另一个优势是可实现更准确的定量。基于这些优势，我们将该方法命名为glycocapture-assisted-global quantitative proteomics（gagQP），并在近期的出版物中详细阐述了该分析方法18。
采用富集方法后获得的典型糖肽质谱图如图2所示。在获得的糖肽中，N-糖链已被去除，糖链连接的天冬酰胺（N）经PNGase F酶解转化为天冬氨酸（D）；因此，该质谱图可直接使用任何蛋白质组学搜索引擎，在常用蛋白质序列数据库中进行检索。
在将捕获方法应用于复杂且珍贵的生物样本之前，可使用...

细胞表面蛋白在生物学上具有重要意义，且普遍存在糖基化修饰。本文介绍一种糖肽富集方法，用于溶解、富集并去糖基化这些蛋白，从而便于进行基于液相色谱-质谱的蛋白质组学分析。

细胞表面蛋白，包括细胞外基质蛋白，参与细胞的所有主要过程和功能，如生长、……

本实验的总体目标是富集低丰度的细胞表面膜蛋白。首先通过变性和消化膜蛋白来实现这一目标，第二步是氧化糖链，并将糖基化肽段捕获在树脂表面。随后将非糖基化肽段从树脂上洗脱。最后一步是将N-连接糖基化肽段从树脂上释放，用于液相色谱-质谱（LC-MS）分析。最终，鉴定出的肽段序列可回溯比对至蛋白质，以实现蛋白质的鉴定与定量。今天我将向您演示 Geico 肽段捕获法的工作原理。该技术相较于现有的方法（如糖蛋白捕获）主要优势在于，膜蛋白首先被消化，糖肽的捕获可在同一反应容器中完成。该技术的应用可拓展至疾病生物标志物的发现。由于gator蛋白可在血液及其他体液中脱落，而血液中循环的糖蛋白与病理过程特异性相关，可作为预后和诊断的生物标志物。首先，配制4毫升低渗缓冲液，其中加入1:100的蛋白酶抑制剂混合物。取1毫升低渗缓冲液加入含有约10⁸个细胞的细胞沉淀中，冰上孵育15至30分钟。将细胞转移至2毫升离心管中，通过注射器针头反复推注5到10次，使细胞裂解。然后使用血细胞计数板和台盼蓝染色。为检测裂解效率，将一毫升裂解液与三毫升剩余的低渗缓冲液混合。在4°C条件下，以3000 × g离心15分钟。将上清液转移至超速离心管中，并将沉淀物保存在-80摄氏度的低温冰箱中。在4摄氏度下，以100,000 ×g 的速度离心超速离心管2小时。接着，用200微升变性缓冲液溶解微粒体组分，然后在100摄氏度下煮沸溶液10分钟。将加热后的溶液冷却至室温后，加入超纯脲粉末，使其终浓度为 8 摩尔，并在 37 摄氏度孵育样品 30 分钟。孵育结束后，向样品中加入 500 毫摩尔的碘乙酰胺储备液，使其终浓度为 15 毫摩尔。然后将溶液在室温下避光孵育30分钟，以烷基化样品中的游离巯基。随后，向样品中加入1摩尔的DTT储存液，使终浓度为10毫摩尔，并将溶液在室温下再孵育10分钟。为淬灭过量的碘乙酰胺，用pH 8的40毫摩尔Tris缓冲液将所得溶液稀释10倍，然后按胰蛋白酶与总蛋白质量比1:20的比例向样品中加入胰蛋白酶。使用 Bradford 法测定总蛋白的含量。将消化反应置于 37 摄氏度的培养箱中过夜，以确保反应完全。反应结束后，用 10 毫摩尔盐酸将样品溶液酸化至 pH 1，以终止消化反应，该条件同时可降解快速酶（rapigest）。然后将去垢剂在37摄氏度下于培养箱中降解一小时。培养后，通过离心去除形成的沉淀物。使用C18固相萃取柱纯化含有样本肽段的上清液，并通过真空离心干燥获得的样本。在进行三重洗涤和消化前后，对样品进行SDS-PAGE分析以确认消化效率。此时，将纯化的肽段溶解于200微升偶联缓冲液中。向肽溶液中加入叠氮化钠，使其终浓度为10毫摩尔/升。将样品在室温下避光孵育30分钟。孵育完成后，加入亚硫酸钠淬灭过量的亚硝酸盐，使终浓度为20毫摩尔，pH为5，随后在室温下继续孵育10分钟。接着，向肽溶液中加入200微升预平衡的联结缓冲液中的羟基活化树脂溶液。在37摄氏度下孵育反应体系1至2天，并持续进行端对端旋转，以确保完全偶联。反应结束后，用1毫升去离子水、1毫升1.5摩尔氯化钠溶液、1毫升甲醇和1毫升80%乙腈各洗涤树脂两次，以去除未结合的肽。接下来，收集上清液和洗涤液，用于分析未结合的肽段。将样品置于-80摄氏度冰箱中保存，直至分析。然后用1毫升pH为8的100毫摩尔碳酸氢铵溶液洗涤树脂3次。最后，向样品管中加入 300 µL 碳酸氢铵，以将 N-糖肽从树脂中洗脱出来。加入 PNGase F，并在 37 °C 下以末端旋转方式孵育样品。随后，通过离心收集洗脱的肽段，再用一毫升 80% 乙腈洗涤树脂。将洗涤液与先前收集的溶液合并。最后将所得溶液在真空浓缩仪中干燥，用于液相色谱-质谱分析。采用富集方法后获得的糖肽样品中，展示了此处所示的非典型糖肽质谱图。N-糖链已被去除，且连接的糖基经P-N-G-A-F处理后转化为天冬氨酸。因此，该质谱图可直接使用常规蛋白质序列数据库，通过任意蛋白质组学搜索引擎进行检索。非典型的液相色谱-质谱（LC-MS）结果展示如下：在一次细胞微粒体组分的单次液相色谱-质谱运行中，可鉴定出超过100种糖蛋白。该方法对糖蛋白和糖肽的富集选择性通常高于90%；若使用强阳离子交换（SCX）柱并结合阶梯梯度进一步分级，成功的分析可使富集选择性达到95%。在进行液相色谱-质谱分析前对样品进行预处理，通常可使鉴定出的糖蛋白数量翻倍。有时，当获得的糖肽量较少时，最终样品中可能会观察到从离心管中积累的杂质。这些污染物可通过MCX柱去除。因此，在观看本视频后，希望您能充分理解如何利用我们的糖肽捕获方法来研究自服务型膜蛋白。在执行本方案时，为便于故障排查，同样重要的是为每个步骤留出样品。试剂的用量也可根据您的具体研究进行优化。

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生物学

糖肽捕获的细胞表面蛋白组学

采用凝集素偶联的POROS微珠进行高效液相色谱分析。糖肽标准品用作阳性和阴性对照。将经MARS-14去除高丰度蛋白并经胰蛋白酶消化的人血浆进行色谱分离，收集流穿组分（FT）和结合组分，用于电喷雾电离液相色谱-串联质谱（ESI-LC-MS/MS）分析。与流穿组分相比，糖肽在结合组分中得到富集。...

一种利用凝集素高效液相色谱法从复杂生物样品中选择性富集糖基化肽段的方法

普遍存在的第二信使 c-di-GMP 调控多种细菌的生长和行为。我们开发了一种基于捕获化合物质谱技术的新方法，可用于在几乎所有细菌物种中生化鉴定和表征 c-di-GMP...

捕获化合物质谱法——一种鉴定新型环二鸟苷酸效应蛋白的强大工具

开发了一种高通量方案，用于血浆中蛋白质组学与糖组学联合纯化及液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）定量分析。N-连接糖基化基序的脱酰胺分析特异性针对去糖基化位点。通过将滤膜辅助的N-糖链分离与糖链肼基标签标记过程中的个体性归一化策略相结合，实现了对N-糖链的准确定量。...

一种定量糖组学与蛋白质组学结合的纯化策略

本文描述了在低温条件下通过固态研磨破碎哺乳动物细胞，从所得细胞粉末制备细胞提取物，并利用抗体偶联的微米级顺磁性珠进行亲和捕获以分离目标蛋白复合物的实验方案。...

从冷冻研磨的哺乳动物细胞中进行蛋白质复合物亲和捕获

本文描述了一种用于制备心血管组织样本以进行质谱分析的方法，该方法能够实现：（1）分析细胞外基质（ECM）蛋白质组成；（2）鉴定糖基化位点；（3）对糖链形式进行组成表征。该方法经少量修改后，亦可应用于其他组织中细胞外基质的研究。...

细胞外基质的糖蛋白质组学：一种利用质谱进行完整糖肽分析的方法

我们介绍一种从复杂的生物样品中纯化、检测和鉴定来源于泛素化蛋白质的diGly肽的方法。该方法具有良好的重复性和稳健性，在泛素化修饰组分析的深度方面优于已发表的方法。...

通过肽段富集与质谱法检测蛋白质泛素化位点

开放搜索能够鉴定出带有先前未知聚糖组成的糖肽。本文以Acinetobacter...

基于开放搜索策略在Acinetobacter baumannii O-连接糖肽鉴定中的应用

一种用于人胰腺组织中N-糖肽和磷酸化肽同步分析的旋转尖端富集策略

本文介绍了一种从干血清样本中检测低丰度生物标志物的实验方案，以胃泌素释放肽前体（ProGRP）这一生物标志物为例。采用抗体包被的磁珠对特征性ProGRP肽段进行选择性纯化与富集，捕获的肽段随后通过液相色谱-串联质谱法进行分析。...

基于质谱靶向蛋白质分析中低丰度蛋白质的微采样技术

本文介绍了一种用于表征多种细胞类型细胞表面蛋白质组的蛋白质组学工作流程。该工作流程包括细胞表面蛋白质的富集、后续样品制备、利用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）平台进行分析，以及使用专用软件进行数据处理。...

“细胞表面捕获”工作流程用于无标记定量分析细胞表面蛋白质组

本方案详细介绍了糖组学指导的糖蛋白质组学方法，这是一种整合组学技术，可全面揭示复杂肿瘤微环境中异质性糖蛋白组的特征，有助于深入理解癌症的糖生物学。...

糖组学指导的糖蛋白质组学促进复杂肿瘤微环境中糖蛋白质组的全面分析

学习糖肽捕获方法富集低丰度细胞膜蛋白的技术流程。该方法通过氧化糖链并使用树脂捕获糖基化肽段，经LC-MS分析实现蛋白质的鉴定与定量，适用于蛋白质组学和疾病生物标志物发现研究。

用于细胞表面蛋白质组学的糖肽捕获

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