用于细胞表面蛋白质组学的糖肽捕获

本实验的总体目标是富集低丰度的细胞表面膜蛋白。首先通过变性和消化膜蛋白来实现这一目标，第二步是氧化糖链，并将糖基化肽段捕获在树脂表面。

随后将非糖基化肽段从树脂上洗脱。最后一步是将N-连接糖基化肽段从树脂上释放，用于液相色谱-质谱（LC-MS）分析。最终，鉴定出的肽段序列可回溯比对至蛋白质，以实现蛋白质的鉴定与定量。

今天我将向您演示 Geico 肽段捕获法的工作原理。该技术相较于现有的方法（如糖蛋白捕获）主要优势在于，膜蛋白首先被消化，糖肽的捕获可在同一反应容器中完成。该技术的应用可拓展至疾病生物标志物的发现。

由于gator蛋白可在血液及其他体液中脱落，而血液中循环的糖蛋白与病理过程特异性相关，可作为预后和诊断的生物标志物。首先，配制4毫升低渗缓冲液，其中加入1:100的蛋白酶抑制剂混合物。取1毫升低渗缓冲液加入含有约10⁸个细胞的细胞沉淀中，冰上孵育15至30分钟。将细胞转移至2毫升离心管中，通过注射器针头反复推注5到10次，使细胞裂解。

然后使用血细胞计数板和台盼蓝染色。为检测裂解效率，将一毫升裂解液与三毫升剩余的低渗缓冲液混合。在4°C条件下，以3000 × g离心15分钟。

将上清液转移至超速离心管中，并将沉淀物保存在-80摄氏度的低温冰箱中。在4摄氏度下，以100,000 ×g 的速度离心超速离心管2小时。接着，用200微升变性缓冲液溶解微粒体组分，然后在100摄氏度下煮沸溶液10分钟。

将加热后的溶液冷却至室温后，加入超纯脲粉末，使其终浓度为 8 摩尔，并在 37 摄氏度孵育样品 30 分钟。孵育结束后，向样品中加入 500 毫摩尔的碘乙酰胺储备液，使其终浓度为 15 毫摩尔。

然后将溶液在室温下避光孵育30分钟，以烷基化样品中的游离巯基。随后，向样品中加入1摩尔的DTT储存液，使终浓度为10毫摩尔，并将溶液在室温下再孵育10分钟。为淬灭过量的碘乙酰胺，用pH 8的40毫摩尔Tris缓冲液将所得溶液稀释10倍，然后按胰蛋白酶与总蛋白质量比1:20的比例向样品中加入胰蛋白酶。

使用 Bradford 法测定总蛋白的含量。将消化反应置于 37 摄氏度的培养箱中过夜，以确保反应完全。反应结束后，用 10 毫摩尔盐酸将样品溶液酸化至 pH 1，以终止消化反应，该条件同时可降解快速酶（rapigest）。

然后将去垢剂在37摄氏度下于培养箱中降解一小时。培养后，通过离心去除形成的沉淀物。使用C18固相萃取柱纯化含有样本肽段的上清液，并通过真空离心干燥获得的样本。

在进行三重洗涤和消化前后，对样品进行SDS-PAGE分析以确认消化效率。此时，将纯化的肽段溶解于200微升偶联缓冲液中。向肽溶液中加入叠氮化钠，使其终浓度为10毫摩尔/升。

将样品在室温下避光孵育30分钟。孵育完成后，加入亚硫酸钠淬灭过量的亚硝酸盐，使终浓度为20毫摩尔，pH为5，随后在室温下继续孵育10分钟。接着，向肽溶液中加入200微升预平衡的联结缓冲液中的羟基活化树脂溶液。在37摄氏度下孵育反应体系1至2天，并持续进行端对端旋转，以确保完全偶联。反应结束后，用1毫升去离子水、1毫升1.5摩尔氯化钠溶液、1毫升甲醇和1毫升80%乙腈各洗涤树脂两次，以去除未结合的肽。

接下来，收集上清液和洗涤液，用于分析未结合的肽段。将样品置于-80摄氏度冰箱中保存，直至分析。然后用1毫升pH为8的100毫摩尔碳酸氢铵溶液洗涤树脂3次。

最后，向样品管中加入 300 µL 碳酸氢铵，以将 N-糖肽从树脂中洗脱出来。加入 PNGase F，并在 37 °C 下以末端旋转方式孵育样品。

随后，通过离心收集洗脱的肽段，再用一毫升 80% 乙腈洗涤树脂。将洗涤液与先前收集的溶液合并。最后将所得溶液在真空浓缩仪中干燥，用于液相色谱-质谱分析。

采用富集方法后获得的糖肽样品中，展示了此处所示的非典型糖肽质谱图。N-糖链已被去除，且连接的糖基经P-N-G-A-F处理后转化为天冬氨酸。因此，该质谱图可直接使用常规蛋白质序列数据库，通过任意蛋白质组学搜索引擎进行检索。

非典型的液相色谱-质谱（LC-MS）结果展示如下：在一次细胞微粒体组分的单次液相色谱-质谱运行中，可鉴定出超过100种糖蛋白。该方法对糖蛋白和糖肽的富集选择性通常高于90%；若使用强阳离子交换（SCX）柱并结合阶梯梯度进一步分级，成功的分析可使富集选择性达到95%。在进行液相色谱-质谱分析前对样品进行预处理，通常可使鉴定出的糖蛋白数量翻倍。

有时，当获得的糖肽量较少时，最终样品中可能会观察到从离心管中积累的杂质。这些污染物可通过MCX柱去除。因此，在观看本视频后，希望您能充分理解如何利用我们的糖肽捕获方法来研究自服务型膜蛋白。

在执行本方案时，为便于故障排查，同样重要的是为每个步骤留出样品。试剂的用量也可根据您的具体研究进行优化。