糖肽捕获的细胞表面蛋白组学
2014年5月9日
细胞表面蛋白的生物学上重要的和广泛的糖基化。我们在这里介绍一个糖肽捕获的方法来溶解，丰富，并且这些去糖基化蛋白质浅显的LC-MS基础的蛋白质组学分析。
该程序的总体目标是富集低丰度细胞表面膜蛋白。这是通过首先变性和消化膜蛋白来实现的。第二步是氧化聚糖并在树脂表面捕获糖基化肽。
然后将非糖肽从树脂上洗掉。最后一步是从树脂中释放 N-连接糖肽，用于 LC MS 分析。最终，鉴定出的肽序列可以定位回蛋白质，用于鉴定和定量目的。
今天，我将向您展示 Geico 多肽捕获法的工作原理。这种技术的主要优点是过量，例如糖蛋白捕获，是膜蛋白首先被消化，并且可以在一个容器中捕获糖肽。该技术的应用可以扩展到疾病生物标志物的发现。
由于鳄鱼蛋白可以在血液和其他体液中脱落，而血液中的循环糖蛋白是病理过程特有的，因此可以用作预后和诊断生物标志物。首先，制备 4 mL 低渗缓冲液和 1 至 100 蛋白酶抑制剂混合物。在含有大约 10 至第 8 个细胞的细胞沉淀物上加入 1 毫升低渗缓冲液，并将混合物孵育 15 至 30 分钟。在冰上，将细胞转移到 2 毫升小瓶中，并通过注射器针头将样品传 5 至 10 次来虱子细胞。
然后使用血细胞仪和 trian 蓝染色。为了检查裂解效率，将 1 mL 裂解物与 3 mL 剩余的低渗缓冲液混合。在 4 摄氏度下以 3000 倍 G 离心试管 15 分钟。
将超级上清液转移到超速离心管中，并将沉淀储存在负 80 摄氏度的冰箱中。在 4 摄氏度下以 100， 000 倍 G 的速度旋转超速离心管 2 小时。接下来，将微粒体组分溶解在 200 μL 变性缓冲液中，然后将溶液在 100 摄氏度下煮沸 10 分钟。
将加热的溶液冷却至室温后，加入超高纯度尿素粉末，得到 8 摩尔的最终浓度，并将样品在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。孵育后，加入 500 毫摩尔。我向样品中加入乙酰胺储备液，得到最终浓度为 15 毫摩尔。
然后将溶液在室温下避光孵育 30 分钟，以烷基化样品中的游离硫醇。然后，向样品中加入 1 摩尔 DTT 储备液，得到最终浓度为 10 毫摩尔的溶液，并在室温下再孵育 10 分钟。为了淬灭过量的乙酰胺，在 PH 值为 8 时用 40 毫摩尔 tris 缓冲液将获得的溶液稀释 10 倍，然后以胰蛋白酶与总蛋白量的 1 比 20 的比例向样品中加入胰蛋白酶。
使用 Bradford 测定法获得总蛋白的量。将消化反应在 37 摄氏度的烘箱中维持过夜，以确保反应完成。完成后，用 10 毫摩尔盐酸将样品溶液酸化至 pH 值 1 来终止消化，这种情况的降解速度也最快。
然后，洗涤剂在培养箱中以 37 摄氏度的速度以最快的速度降解 1 小时。孵育后，离心后通过离心去除显影的沉淀。用 C 18 固相萃取柱清洁含有样品肽的 SUP natin，并通过 speed vac 干燥获得的样品。
在行程和消化之前和之后对样品进行 SDS 页面分析，以确认消化效率。此时，将清洁后的肽溶解在 200 μL 偶联缓冲液中。将纯化钠加入肽溶液中后，得到 10 毫摩尔的最终浓度。
在室温下避光孵育样品 30 分钟孵育完成后，在室温下孵育 10 分钟后，用亚硫酸钠淬灭过量的 prate，得到最终浓度为 20 毫摩尔和 pH 值为 5，加入 200 μL 水细胞衍生物树脂溶液，pree 平衡并偶联缓冲液到肽溶液中。将反应物在 37 摄氏度下孵育 1 至 2 天，并端到端旋转以实现完全偶联。完成后，用 1 毫升去离子水、1 毫升 1.5 摩尔氯化钠、1 毫升甲醇和 1 毫升 80% 乙酰腈洗涤树脂两次，以去除未结合的肽。
接下来，收集上清液和洗涤液以分析未结合的肽。将样品储存在零下 80 摄氏度的冰箱中，直到分析。然后用 1 毫升 100 毫摩尔碳酸氢铵在 pH 值为 8 的情况下洗涤树脂 3 次。
最后，向样品瓶中加入 300 μL 碳酸氢铵。从树脂中释放 N 糖肽。加入 PNG ACE F 并在 37 摄氏度下以端到端旋转孵育样品。
然后，通过离心收集释放的肽，然后用 1 毫升 80% 乙酰丁腈洗涤树脂。将洗涤液与先前收集的混合。最后，在 VAC 速度中干燥获得的溶液以进行 lc MS 分析。
富集方法后提取的非典型糖肽光谱在此处显示于获得的糖肽中。去除 n 糖，并通过 P-N-G-A-F 将糖基附着的贬值转化为斯巴达酸。因此，任何蛋白质组学搜索引擎都可以很容易地针对常见的蛋白质序列数据库搜索光谱。
非典型 lc MS。此处显示了捕获的 n 糖肽的结果，其中可以从细胞微粒体组分的单次 lc MS 运行中鉴定出 100 多种糖蛋白。对糖蛋白和糖肽的富集选择性通常均超过 90%使用 SCX 色谱柱和阶梯梯度进一步分级分离，成功的分析可以具有 95% 的富集选择性。LCMS 分析前的样品通常会使糖蛋白鉴定的数量增加一倍。
有时，当获得的糖肽量较低时，可以在最终样品中观察到从样品瓶中积累的杂质。这些污染物可以通过 MCX 色谱柱去除。所以，在观看了这个视频之后，我希望您对如何使用我们的糖肽捕获方法研究自助膜蛋白有一个很好的了解。
在尝试此协议时，为每个步骤留出样本以进行故障排除也很重要。试剂的体积也可以针对您的特定研究进行优化。
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概述
本研究提出了一种糖肽捕获方法来富集低丰度的细胞表面膜蛋白。该方法包括变性和消化膜蛋白，氧化糖链，以及捕获糖基化肽用于LC-MS分析。
研究的关键组成部分
科学领域
- 蛋白质组学
- 细胞生物学
- 糖生物学
背景
- 细胞表面蛋白对于各种生物功能至关重要。
- 这些蛋白通常是糖基化的，影响其稳定性和相互作用。
- 传统方法可能无法有效地分离低丰度的糖基化蛋白。
- LC-MS是分析蛋白质组成的强大技术。
研究目的
- 开发一种富集糖基化细胞表面蛋白的方法。
- 促进这些蛋白的鉴定和定量。
- 改善蛋白质组学研究中低丰度蛋白的分析。
使用的方法
- 膜蛋白的变性和消化。
- 糖链的氧化以准备捕获。
- 使用树脂捕获糖基化肽。
- 释放N-连接糖肽用于LC-MS分析。
主要结果
- 成功富集了来自膜蛋白的糖基化肽。
- 鉴定了与特定蛋白对应的肽序列。
- 基于捕获的糖肽对蛋白进行定量。
- 证明了该方法在蛋白质组学分析中的有效性。
结论
- 糖肽捕获方法增强了细胞表面蛋白的研究。
- 该方法可以应用于各种蛋白质组学分析。
- 未来的研究可能会扩展这一技术的应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Cell surface proteomics faces challenges due to low abundance, hydrophobicity, and complex post-translational modifications, limiting biomarker discovery and drug target validation. This glycopeptide-capture method leverages prevalent N-glycosylation to enrich and analyze surface proteins, enabling improved target confidence and mechanistic de-risking in early discovery. The approach supports translational biomarker identification and portfolio triage by providing quantitative, site-specific glycoproteome data from disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by clarifying surface protein expression and glycosylation patterns.
- Operational Value: Supports biological de-risking through functional target validation via enriched glycopeptide identification.
- Predictive Value: Enhances portfolio relevance by providing quantitative data for target prioritization and preclinical decision-making.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream workflows by enriching low-abundance surface glycopeptides.
- Reproducibility: Addresses assay standardization through consistent enrichment selectivity (>90%) and quantitative LC-MS outputs.
- Scalability: Enables reliable compound evaluation via platform reuse across cancer, stem cell, and drug toxicity models.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Supports translational biomarker alignment by identifying shed glycoproteins in biofluids linked to pathological processes.
- Preclinical Continuity: Connects discovery through preclinical validation by enabling site-specific glycosylation mapping and quantification.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in target engagement and pathway modulation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification, enabling biological de-risking and predictive confidence before preclinical investment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by resolving N-glycoproteome identity, quantity, and glycosylation sites.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs through enriched glycopeptide fractions suitable for LC-MS analysis.
- Analytics: Provides measurable readouts (peptide sequences, glycosylation sites, protein abundance) that enable cross-condition comparison and target ranking.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via biomarker-relevant glycoprotein detection in disease models and biofluids.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable proteomic capability rather than a single-use technique, adaptable across multiple therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in surface protein function.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of glycopeptide enrichment for LC-MS workflows.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early target de-risking.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative surface proteome data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in proteomics, glycobiology, and LC-MS sample preparation.
- Depends on instrumentation for ultracentrifugation, resin-based capture, and nanoLC-MS/MS analysis.
- Necessitates cross-team standardization of digestion, oxidation, and capture protocols for reproducibility.
- Involves adaptation considerations for varying membrane protein abundance and glycosylation density across model systems.
- Limited by low surface membrane protein abundance, requiring larger sample quantities compared to cytosolic protein studies.
