激光诱导击穿光谱：一种用于组织中纳米颗粒成像与定量的新方法

本实验的总体目标是提供一种简单且可靠的方法，利用与常规光学显微镜完全兼容的台式仪器，对生物组织中的有机和无机元素进行成像与定量分析。该方法通过将激光脉冲聚焦于待测样品表面，诱导材料发生击穿并产生火花，所生成的等离子体发射辐射，随后由光谱仪对辐射信号进行分析。

第二步是选择并识别与目标元素对应的谱线，并对样品表面进行扫描。接下来，进行校准测量，以确定元素的浓度。最后一步是利用相对强度或浓度标度，根据所有记录的光谱构建样品组织的元素分布图。

最终，激光诱导击穿光谱技术可用于在无需标记的情况下显示各种元素在组织中的分布。与其他现有方法（如微区X射线荧光或基于质谱的技术）相比，激光诱导击穿光谱（LIBS）易于实现，可在常压下运行，并且与大多数光学显微镜系统兼容。

此外，该方法在检测灵敏度上可达到 ppm 级别，空间分辨率达到微米量级。该技术有助于回答纳米技术在生物研究应用中的一个关键问题，例如在无需对纳米颗粒进行标记的情况下，确定含金属元素的纳米颗粒在组织样本中的分布情况。由于该方法具有较低的检测限，可检测铜、铁和铝等在人体不同器官（尤其是脑组织）中异常存在的金属元素，因此可拓展应用于病理学研究。该方法可为纳米颗粒的检测与鉴定提供重要信息。

该方法还可应用于其他系统，例如TCU中无机元素的检测或异质元素分布的分析。需要开展此类实验的科研人员将不得不在采集参数设置上付出努力，以在尽可能获得强信号的同时，避免对样品造成过度损伤。开始实验前，需按照本方案准备待研究的样品载玻片。

从荷瘤小鼠中获取器官，这些小鼠已注射钆纳米颗粒溶液用于制备切片。将器官切成100微米厚的切片，置于石英载玻片或培养皿上。切片应始终保存在负80摄氏度条件下。

接下来，准备用于校准的样品。标记若干个瓶管，标注浓度，从0纳摩尔开始，至5毫摩尔结束。对于每个瓶管，配制100微升相应浓度的钆水溶液。

完成此步骤后，准备一张载玻片。从第一个小瓶中量取 5 µL 液体，滴加到石英载玻片或培养皿上。务必标记该液滴，以便后续使用。

沿圆周移动三毫米，并将下一浓度的五微升溶液滴加到载玻片上。对剩余的每种溶液重复相同操作。在室温下干燥载玻片内容物20分钟。

该激光诱导击穿光谱装置使用纳秒级钕钇铝石榴石激光器，产生波长为1064纳米的激光束。将部分激光束用于同步光谱系统，其余部分经由计算机控制的衰减器引导，以在整项实验过程中调节并稳定激光脉冲能量。

接下来，将光束引导至该区域的样品处。将光束聚焦到由软件控制的平移台上，该平台用于固定样品支架，并配备一个CCD相机以监测样品表面的安装情况。

另一个用于监测等离子体羽流。使用置于负26摄氏度的ICCD相机，在转向式光谱仪中分析样品击穿产生的光。进行测量时，先启动激光器的稳定化程序，并将相机冷却至负26摄氏度。

实验开始前10分钟。准备就绪后，使用衰减器将脉冲能量锁定为5毫焦。接着，取出待研究的样品载玻片，并准备将其安装在样品台上。

将样品固定在电动样品台上。完成后，返回计算机。为定位样品，移动载物台，使样品的一部分位于激光束中。

将激光焦点调节至样品表面下方约100微米处。此时，激光形成的烧蚀坑直径为50微米或更小。通过计算机将光谱仪的入射狭缝设为40微米，并设置ICCD参数以进行 Mapping 测量。

调整支架位置以对准样品的特定区域。使用宽光谱光源拍摄样品的高分辨率全景图像。然后利用软件及所获取的图像定义激光诱导击穿光谱（LIBS）扫描区域和分辨率。

此处网格为 100 × 100，点间距为 100 微米。开始在网格的每个点上自动采集数据。每个点的光谱将被测量并记录到文件中。

当测量在约30分钟内完成后，对样品切片再拍摄一张图像，然后将所有光谱整合到一个数据文件中以供后续使用。接下来，取下样品载玻片，准备安装校准样品。将带有校准样品的石英载玻片固定在计算机端的平移台上。

将第一个校准样品的中心置于激光光路中。保持实验参数不变，记录光谱。对每种不同钆浓度的样品重复相同操作。

这些是从肾脏组织不同区域记录的单次激发光谱示例。蓝色光谱记录自肾脏的中央区域，红色光谱对应肾脏膜区域，绿色光谱则来自外周区域。

所注射的基于钆的纳米颗粒由聚乳酸基质构成，其表面通过DOCA配体螯合钆离子。在286纳米至320纳米的光谱范围内，可检测到钆、钙、铁、硅和铝元素。注意观察样品不同区域中信号强度的变化，表明这些元素在组织中的浓度存在显著异质性。利用激光诱导击穿光谱（LIBS）数据，以约100微米的分辨率，对小鼠肾脏切片中钆、硅和铁的分布进行了成像分析。

强度的刻度以任意单位表示。此为自然光图像。作为对比，肿瘤样本也获得了类似结果。

与这张钆和SQ 20 B肿瘤组织分布图一样，自然光图像上叠加了伪彩色标尺。在本实验中，纳米颗粒被直接注入肿瘤内。一小时后，切除肿瘤并制备用于分析。

请注意，大约一半的肿瘤体积中含有某些颗粒。如果操作得当，该技术可在一小时内完成每平方厘米样品、分辨率为100微米的检测。进行激光诱导等离子体光谱（LIBS）分析时，必须牢记测量数据来源于激光诱导产生的等离子体，因此在整个实验过程中严格按照操作步骤控制所有参数至关重要。

还可以对相邻切片进行其他方法检测，例如免疫组织化学，以回答更多相关问题，如参与特定生物学过程的细胞类型。该技术为纳米技术在生物学和医学领域应用的研究人员提供了新途径，使其能够探索含金属元素的化合物在生物组织中的分布情况。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用激光剥蚀电感耦合等离子体质谱技术对生物组织中的多种元素进行定位与成像。