Name: 激光诱导击穿光谱:对于纳米粒子的映射和定量的器官组织的新方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: 了解激光诱导击穿光谱技术如何用于生物组织中的元素映射和定量分析。该方法可实现100微米分辨率的高灵敏度检测，并与常规光学显微镜兼容，适用于纳米粒子分布研究。

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作者们衷心感谢 Labex-Imust 提供的经费支持。

1. 生物样本制备
本研究中描述的所有实验均经法国里昂动物护理与使用委员会（CECCAPP，法国里昂）批准（许可号：LYONSUD_2012_004），实验在授权人员（L. Sancey，DDPP 授权号：38 05 32）的监督下进行。
<ol>
	<li>加入1 ml H2O 至&#160;100 µmol 钆（Gd）基纳米颗粒，静置15分钟，加入20 µl 50 mM HEPES，&#160;NaCl 1.325 M&#160;CaCl2 20 mM 至 100 µl 的 H2O 和 80 µl 钆基纳米颗粒的初级溶液，以获得 200 µl 浓度为 40 mM 的即用型注射溶液（地点：Villeurbanne，实验室）。</li>
	<li>静脉注射200 µl钆基纳米颗粒溶液&#160;进入麻醉的荷瘤啮齿类动物体内（城市：里昂南区（乌兰），距离实验室15公里）</li>
	<li>注射后1-24小时处死小鼠，将生物样本置于液氮冷却的异戊烷中。于-80 °C保存样本（地点：里昂南区（乌兰），距实验室15公里）。</li>
	<li>将样本（通常来自格勒诺布尔市，距实验室100公里；我将尝试使用里昂南部的设备）切成100 µm厚的切片，并将生物切片置于专用塑料培养皿（Petri dish）中。于-80 °C保存。 
	注意：塑料培养皿本质上是一种纯度很高的聚合物样品，用于避免组织中所含元素的干扰。</li>
</ol>
2. 校准样品的制备
<ol>
	<li>准备含有不同浓度钆（Gd）基纳米颗粒的水溶液小瓶（0 nM、100 nM、500 nM、1 µM、5 µM、10 µM、50 µM、100 µM、500 µM、1 mM 和 5 mM）。</li>
	<li>在培养皿上以 3 mm 间隔均匀放置每种溶液 5 µl 的液滴。</li>
	<li>室温下干燥 20 分钟。</li>
</ol>
3. LIBS 实验
<ol>
	<li>初始化 LIBS 装置
	<ol>
		<li>激光器设置。开启仪器后，等待&#160;10–20 分钟，使激光脉冲能量稳定，并将 ICCD 相机冷却至 -20 °C。使用衰减器调节脉冲能量。 
		注意：用于组织成像的最优激光参数为 5 nsec 脉冲持续时间、1,064 nm 波长，以及约 4 mJ 的脉冲能量。所用激光器为典型的 Nd:YAG 纳秒激光器。</li>
		<li>LIBS 设置。调节激光聚焦位置（相对于样品表面），以获得最小的凹坑直径（约 50 µm 或更小）。 
		注意：这对应于激光脉冲聚焦在样品表面下方 100 µm 处。</li>
		<li>光谱仪设置。使用配备 1,200 线/mm 光栅和高时间分辨率 ICCD 相机的切尔尼-特纳光谱仪。通过计算机控制所有这些设备。将入射狭缝值设为 40 µm。根据待分析元素设定光谱范围。使用覆盖 325 至 355 nm 的光谱范围，以高灵敏度检测 Gd，以及 Na、Cu 和 Ca。将 ICCD 参数设置为延迟 300 nsec、门宽 2 µsec、增益 200。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>成像测量
	<ol>
		<li>将生物样品放置在 LIBS 电动样品台上。</li>
		<li>根据激光聚焦位置调节样品高度。</li>
		<li>拍摄样品切片的高分辨率照片。</li>
		<li>设置 LIBS 采集软件中的成像模块，通常以约 100 µm 的分辨率，进行包含 100 × 100 个测量点的成像扫描。</li>
		<li>开始采集。此后所有步骤自动进行，包括移动序列、光谱记录与保存。完成 10,000 个点的成像（相当于分辨率为 100 µm 时的 1 cm2&#160;）需要 40 分钟。将所有记录的光谱整合到同一个文件中。</li>
		<li>完成后，再次拍摄样品切片的照片</li>
	</ol>
	</li>
	<li>校准测量</li>
</ol>
在相同的实验参数下，测量校准样品（制备细节见第2节）。在每个校准液滴中，进行映射或记录25个光谱（来自液滴中心区域的测量位点）。
4. LIBS 光谱分析：化学成像的构建
<ol>
	<li>记录组织成像的所有激光诱导击穿光谱（LIBS）数据，并将其载入LIBS软件进行分析。对每条光谱进行基线校正，并使用伪彩色以相对强度尺度构建化学图像。 
	注意：算法可提取特定谱线强度，例如钆（Gd）、铜（Cu）、钠（Na）或钙（Ca）。</li>
	<li>对从校准样品测得的光谱执行相同操作，以获得校准曲线（强度与浓度之间的关系），并构建钆（Gd）或其他目标元素的定量分布图或图像。</li>
	<li>对化学图像进行适当的处理，例如插值或平滑。将强度或浓度分布图以图像格式（位图）保存。</li>
</ol>

<ol><li>Smith, M. A., Harris, P. L., Sayre, L. M., Perry, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+accumulation+in+Alzheimer+disease+is+a+source+of+redox-generated+free+radicals%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Iron accumulation in Alzheimer disease is a source of redox-generated free radicals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 9866-9868 (1997).</li>
<li>Wang, Y., Zhu, S., Weisman, G. A., Gitlin, J. D., Petris, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+knockout+of+the+Menkes+disease+copper+transporter+demonstrates+its+critical+role+in+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Conditional knockout of the Menkes disease copper transporter demonstrates its critical role in embryogenesis.</a> PloS one. 7, (2012).</li>
<li>Reske-Nielson, E., Lou, H. O., Andersen, P., Vagn-Hansen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-copper+concentration+in+Menkes%27+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Brain-copper concentration in Menkes' disease.</a> Lancet. 1, 613 (1973).</li>
<li>Hayashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Various+copper+and+iron+overload+patterns+in+the+livers+of+patients+with+Wilson+disease+and+idiopathic+copper+toxicosis%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+molecular+morphology%22%5BJournal%5D)">Various copper and iron overload patterns in the livers of patients with Wilson disease and idiopathic copper toxicosis.</a> Medical molecular morphology. 46, (2013).</li>
<li>Lobinski, R., Moulin, C., Ortega, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+and+speciation+of+trace+elements+in+biological+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Imaging and speciation of trace elements in biological environment.</a> Biochimie. 88, 1591-1604 (2006).</li>
<li>Devès, G., Bouhacina, T., Ortega, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STIM+mass+measurements+for+quantitative+trace+element+analysis+within+biological+samples+and+validation+using+AFM+thickness+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Spectrochimica+Acta+B%22%5BJournal%5D)">STIM mass measurements for quantitative trace element analysis within biological samples and validation using AFM thickness measurements.</a> Spectrochimica Acta B. 59, 1733-1738 (2004).</li>
<li>Twining, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+trace+elements+in+individual+aquatic+protist+cells+with+a+synchrotron+X-ray+fluorescence+microprobe%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantifying trace elements in individual aquatic protist cells with a synchrotron X-ray fluorescence microprobe.</a> Analytical chemistry. 75, 3806-3816 (2003).</li>
<li>Guerquin-Kern, J. L., Wu, T. D., Quintana, C., Croisy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+analytical+imaging+of+the+cell+by+dynamic+secondary+ion+mass+spectrometry+%28SIMS+microscopy%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">Progress in analytical imaging of the cell by dynamic secondary ion mass spectrometry (SIMS microscopy).</a> Biochimica et biophysica acta. 1724, 228-238 (2005).</li>
<li>Binet, M. R., Ma, R., McLeod, C. W., Poole, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+characterization+of+zinc-+and+cadmium-binding+proteins+in+Escherichia+coli+by+gel+electrophoresis+and+laser+ablation-inductively+coupled+plasma-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Detection and characterization of zinc- and cadmium-binding proteins in Escherichia coli by gel electrophoresis and laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry.</a> Analytical biochemistry. 318, 30-38 (2003).</li>
<li>Becker, J., Gorbunoff, A., Zoriy, M., Izmer, A., Kayser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+near-field+laser+ablation+inductively+coupled+plasma+mass+spectrometry+%28NF-LA-ICP-MS%29+at+nanometre+scale+for+elemental+and+isotopic+analysis+on+gels+and+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anal.+Atom.+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Evidence of near-field laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry (NF-LA-ICP-MS) at nanometre scale for elemental and isotopic analysis on gels and biological samples.</a> J. Anal. Atom. Spectrom. 21, 19-25 (2006).</li>
<li>Seeley, E. H., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+imaging+by+mass+spectrometry%3A+a+new+frontier%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">3D imaging by mass spectrometry: a new frontier.</a> Analytical chemistry. 84, 2105-2110 (2012).</li>
<li>Pornwilard, M. -M., Weiskirchen, R., Gassler, N., Bosserhoff, A. K., Becker, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+bioimaging+techniques+of+metals+by+laser+ablation+inductively+coupled+plasma+mass+spectrometry+for+diagnosis+of+fibrotic+and+cirrhotic+liver+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Novel bioimaging techniques of metals by laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry for diagnosis of fibrotic and cirrhotic liver disorders.</a> PloS one. 8, (2013).</li>
<li>Cremers, D. A., Radziemski, L. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCremers%2C+DA+%22Handbook+of+laser-induced+breakdown+spectroscopy%22">Handbook of laser-induced breakdown spectroscopy</a>. , Wiley. (2006).</li>
<li>Miziolek, A. W., Palleschi, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiziolek%2C+AW+%22Laser-Induced+Breakdown+Spectroscopy%3A+Fundamentals+and+Applications%22">Laser-Induced Breakdown Spectroscopy: Fundamentals and Applications</a>. , (2006).</li>
<li>Motto-Ros, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+nanoparticles+injected+into+a+biological+tissue+using+laser-induced+breakdown+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Spectrochimica+Acta+Part+B%22%5BJournal%5D)">Mapping nanoparticles injected into a biological tissue using laser-induced breakdown spectroscopy.</a> Spectrochimica Acta Part B. , (2013).</li>
<li>Motto-Ros, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+native+inorganic+elements+and+injected+nanoparticles+in+a+biological+organ+with+laser-induced+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">Mapping of native inorganic elements and injected nanoparticles in a biological organ with laser-induced plasma.</a> Applied Physics Letters. 101, (2012).</li>
<li>Mignot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+top-down+synthesis+route+to+ultrasmall+multifunctional+Gd-based+silica+nanoparticles+for+theranostic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry%22%5BJournal%5D)">A top-down synthesis route to ultrasmall multifunctional Gd-based silica nanoparticles for theranostic applications.</a> Chemistry. 19, 6122-6136 (2013).</li>
<li>Lux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasmall+rigid+particles+as+multimodal+probes+for+medical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Ultrasmall rigid particles as multimodal probes for medical applications.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 50, 12299-12303 (2011).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

应用于生物样品时，该技术可实现化学成像， 即 对注射的基于钆的纳米颗粒在不同器官中的钆（Gd）和硅（Si）进行定位与定量分析。在主要关键参数中，激光特性（波长、脉冲能量、聚焦和稳定性）的控制对于实现精确而精细的组织消融至关重要（即 空间分辨率和灵敏度。高能量工作可提供更好的灵敏度，但会降低空间分辨率。此外，必须仔细选择所使用的光谱仪类型。通常情况下，宽带检测（例如使用埃歇尔光谱仪）可实现多种元素的选择，但灵敏度较低；而使用切尔尼-特纳光谱仪（配备ICCD或PMT）则可检测的元素种类较少，但灵敏度显著更高。所选的探测波长范围及其各项参数设置均应根据具体研究目的进行调整。
关于生物样本本身，其厚度和硬度也可能影响质谱信号的质量。若样本过薄，会完全被喷雾化，导致样本载体也被激光脉冲攻击；而若样本过厚，则可能因其内部结构的不均一性，导致喷雾物质数量的不均一（如大血管的存在） 等等。）。根据元素分析，可预判支撑材料的选择；例如，若研究的元素为 Si，则样品应置于纯塑料上，而应避免使用玻璃，因为玻璃含有大量 Si。同样，样品的制备和固定需在...

纳米颗粒在生物应用中的广泛应用推动了用于其在生物样品中定量和成像的分析技术的同步发展。通常，器官中纳米颗粒的检测与定位依赖于荧光或共聚焦显微镜技术。然而，这些方法需要使用近红外染料对纳米颗粒进行标记，而染料的疏水性可能改变纳米颗粒的生物分布，尤其是对于尺寸非常小的纳米颗粒。因此，标记后的纳米颗粒（特别是尺寸&#60; 10 nm的纳米颗粒）的检测可能在整体动物、组织乃至细胞水平上干扰其生物分布。开发能够无需标记即可检测纳米颗粒的新设备，为研究其行为和动力学提供了新的可能性。此外，痕量元素（如铁和铜）在脑部疾病及神经退行性疾病（如阿尔茨海默病1、门克斯病2,3和威尔逊病4）中的作用，也提示了在组织中研究和定位这些元素的重要性。
已有多种技术被用于不同材料的元素分布图绘制或微区分析。在他们2006年发表的综述论文中，R. Lobinski 等 概述了生物环境中元素微分析可用的标准技术，生物环境是分析科学最具挑战性的研究对象之一5电子探针，即透射电子显微镜中的能量色散X射线微区分析，若元素浓度足够，可应用于多种研究&#62;100–1,000 μg/g）。为了达到更低的检测限，已采用以下技术：
<ul>
	<li>利用粒子诱发X射线发射的离子束显微探针 μ-PIXE (1–10 μg/g)6</li>
	<li>同步辐射显微分析 μ-SXRF (0.1–1 μg/g)7</li>
	<li>二次离子质谱法 SIMS (0.1 μg/g)8</li>
	<li>激光剥蚀电感耦合等离子体质谱法 LA-ICP-MS (低至 0.01 μg/g)9,10</li>
</ul>
上述技术可提供微米级分辨率，如 Lobinski et al. 提取的表1所示。
对连续二维图像进行三维重建也可用于深部组织的重构11。然而，所有设备和系统均需要专业技术人员、中等到高成本的仪器，以及耗时较长的实验（通常对于µ-SXRF为100 µm × 100 µm、LA-ICP-MS为10 mm × 10 mm的区域，需耗时超过4小时&#160;）12。总体而言，这些要求使得元素微区分析技术的应用受到极大限制，且无法与常规光学成像系统、荧光显微镜或非线性显微镜兼容。另一个需要指出的问题是，目前定量测量能力仍然较为有限，且依赖于基体匹配的实验室标准物质的可获得性。元素微区分析在工业流程、地质学、生物学及其他应用领域的进一步推广，将带来重大的概念和技术突破。
本文旨在提出一种利用完全兼容常规光学显微镜的台式仪器，实现生物组织中元素定量成像（或元素微区分析）的解决方案。本方法基于激光诱导击穿光谱技术（LIBS 技术）。在 LIBS 中，将一束激光脉冲聚焦于待测样品表面，使材料发生击穿并产生火花。随后通过光谱仪分析等离子体发射的原子辐射，并结合预先进行的校准测量，即可获得各元素的浓度信息13,14。LIBS 技术的优点包括高灵敏度（几乎所有元素均可达到 µg/g 级别）、设备紧凑、样品前处理极为简单、无需与样品接触、响应迅速，以及可实现精确位置的（微区）表面分析。然而，将该技术应用于组织化学成像仍具挑战性，因为必须精确控制组织的激光烧蚀过程，以同时实现高空间分辨率的成像和 µg/g 级别的检测灵敏度15,16。
使用该方法无需添加示踪剂或标记试剂，可直接在生物组织的原始环境中检测无机元素。本实验室开发的激光诱导击穿光谱（LIBS）仪器空间分辨率优于100 µm，对钆（Gd）的检测灵敏度估计低于35 µg/g，相当于0.1 mM 16，可实现对大样本的成像 mapping&#62;1 cm230分钟内完成。此外，自制软件有助于数据的采集与分析。该仪器用于检测、定位和定量分析基于钆（Gd）的纳米颗粒在组织中的分布17-18 在小型动物的肾脏和肿瘤样本中，1至24小时&#160;静脉注射颗粒后（大小 &#60;5 nm）。生物组织中固有的无机元素，如 Fe、Ca、Na 和 P，也已被检测并成像。

<table><tbody><tr><td>纳秒激光器 Nd:YAG</td><td>Quantel</td><td>Brillant</td><td>5 纳秒脉冲宽度，波长 1,064 nm</td></tr><tr><td>光谱仪</td><td>Andor Technology</td><td>Shamrock 303</td><td>配备 1,200 线/毫米、闪耀波长 300 nm 的光栅</td></tr><tr><td>ICCD 探测器</td><td>Andor Technology</td><td>Istar</td><td>时间分辨率为 2 纳秒</td></tr><tr><td>LIBS 装置</td><td>ILM</td><td></td><td>自制仪器</td></tr><tr><td>基于钆的纳米颗粒</td><td>Nano-H</td><td></td><td>颗粒</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>用于颗粒稀释</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21108</td><td>用于颗粒稀释</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td>用于颗粒稀释</td></tr><tr><td>小鼠</td><td>Charles River</td><td>根据动物繁殖情况而定</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Coveto / Virbac</td><td></td><td>用于麻醉 — Isofluranum</td></tr><tr><td>异戊烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59060</td><td>用于缓慢冷冻样品&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>液氮</td><td>Air Liquide</td><td></td><td>用于冷却异戊烷</td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td>Leica</td><td>CM-3050S</td><td>用于切片样品</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Dutscher</td><td>353004</td><td>用于固定样品</td></tr></tbody></table>

激光诱导击穿光谱：一种用于组织中纳米颗粒成像与定量的新方法

Laser-induced Breakdown Spectroscopy: A New Approach for Nanoparticle's Mapping and Quantification in Organ Tissue

激光诱导等离子体发射光谱法应用于生物样品的元素分析。在啮齿类动物组织（肾脏和肿瘤）的薄切片上进行激光诱导击穿光谱（LIBS）分析，可检测到体内天然存在的无机元素，如（i）Na、Ca、Cu、Mg、P 和 Fe，以及在注射基于钆的纳米颗粒后检测到的元素，如（ii）Si 和 Gd。动物在实验结束后被实施安乐死&#160;至24小时&#160;静脉注射颗粒后，使用电动微米级三维载物台对样品进行二维扫描，使红外激光束以横向分辨率低于100的精度探测样品表面 μm. 获得了器官内钆元素的定量化学图像，检测灵敏度达到亚毫摩尔浓度水平。激光诱导击穿光谱法（LIBS）为研究无机材料的分布提供了一种简单且稳健的方法，无需进行特异性标记。此外，该装置与标准光学显微镜的兼容性突显了其潜力，可对同一样本生物组织获取多种响应类型的图像。&#160;元素、分子或细胞。

如图1所示，波长为1,064 nm的Nd:YAG激光器基频光束通过焦距为50 mm的石英透镜垂直聚焦到组织切片上。脉冲能量为4 mJ，重复频率为10 Hz。为避免空气中产生等离子体，激光束聚焦于样品表面下方约100 µm处。在此条件下未观察到空气等离子体。实验过程中，通过步进电机移动样品，使每次激光脉冲仅在样品的单一位置产生一次等离子体（单脉冲）。对基底上形成的凹坑进行显微观察，结果显示凹坑直径小于50 µm。所产生的等离子体通过一组透镜成像至一根光纤的入射端，该光纤连接至一台配备每毫米1,200条刻线（闪耀波长300 nm）光栅的切尔尼-特纳光谱仪。在光谱仪的输出焦平面上安装一个ICCD相机以记录光谱。测量过程中，利用三角测量法监测样品表面高度（相对于激光焦点位置）：将一束低功率连续波激光二极管以倾斜角度照射样品表面，并通过CCD监控相机进行观测。ICCD由激光Q开关触发，延迟和门宽参数分别设定为400 nsec和2 µsec。在进行 Mapping 测量时，每次激光脉冲后样品移动100 µm的偏移量。每次激光脉冲记录一条光谱。在LabVIEW环境中开发的自主软件控制整套设备，实现对组织样品感兴趣区域...

在薄层器官和肿瘤组织上进行的激光诱导击穿光谱成功检测到了天然元素以及人工注入的钆（Gd），后者来源于基于钆的纳米颗粒。化学元素成像的空间分辨率达到100 μm，定量检测灵敏度达到亚毫摩尔浓度水平。该装置与标准光学显微镜的兼容性突显了其在同一生物组织上提供多种图像的潜力。

激光诱导等离子体发射光谱法被应用于生物样品的元素分析。激光诱导击穿光谱法（LIBS）...

本实验的总体目标是提供一种简单且可靠的方法，利用与常规光学显微镜完全兼容的台式仪器，对生物组织中的有机和无机元素进行成像与定量分析。该方法通过将激光脉冲聚焦于待测样品表面，诱导材料发生击穿并产生火花，所生成的等离子体发射辐射，随后由光谱仪对辐射信号进行分析。第二步是选择并识别与目标元素对应的谱线，并对样品表面进行扫描。接下来，进行校准测量，以确定元素的浓度。最后一步是利用相对强度或浓度标度，根据所有记录的光谱构建样品组织的元素分布图。最终，激光诱导击穿光谱技术可用于在无需标记的情况下显示各种元素在组织中的分布。与其他现有方法（如微区X射线荧光或基于质谱的技术）相比，激光诱导击穿光谱（LIBS）易于实现，可在常压下运行，并且与大多数光学显微镜系统兼容。此外，该方法在检测灵敏度上可达到 ppm 级别，空间分辨率达到微米量级。该技术有助于回答纳米技术在生物研究应用中的一个关键问题，例如在无需对纳米颗粒进行标记的情况下，确定含金属元素的纳米颗粒在组织样本中的分布情况。由于该方法具有较低的检测限，可检测铜、铁和铝等在人体不同器官（尤其是脑组织）中异常存在的金属元素，因此可拓展应用于病理学研究。该方法可为纳米颗粒的检测与鉴定提供重要信息。该方法还可应用于其他系统，例如TCU中无机元素的检测或异质元素分布的分析。需要开展此类实验的科研人员将不得不在采集参数设置上付出努力，以在尽可能获得强信号的同时，避免对样品造成过度损伤。开始实验前，需按照本方案准备待研究的样品载玻片。从荷瘤小鼠中获取器官，这些小鼠已注射钆纳米颗粒溶液用于制备切片。将器官切成100微米厚的切片，置于石英载玻片或培养皿上。切片应始终保存在负80摄氏度条件下。接下来，准备用于校准的样品。标记若干个瓶管，标注浓度，从0纳摩尔开始，至5毫摩尔结束。对于每个瓶管，配制100微升相应浓度的钆水溶液。完成此步骤后，准备一张载玻片。从第一个小瓶中量取 5 µL 液体，滴加到石英载玻片或培养皿上。务必标记该液滴，以便后续使用。沿圆周移动三毫米，并将下一浓度的五微升溶液滴加到载玻片上。对剩余的每种溶液重复相同操作。在室温下干燥载玻片内容物20分钟。该激光诱导击穿光谱装置使用纳秒级钕钇铝石榴石激光器，产生波长为1064纳米的激光束。将部分激光束用于同步光谱系统，其余部分经由计算机控制的衰减器引导，以在整项实验过程中调节并稳定激光脉冲能量。接下来，将光束引导至该区域的样品处。将光束聚焦到由软件控制的平移台上，该平台用于固定样品支架，并配备一个CCD相机以监测样品表面的安装情况。另一个用于监测等离子体羽流。使用置于负26摄氏度的ICCD相机，在转向式光谱仪中分析样品击穿产生的光。进行测量时，先启动激光器的稳定化程序，并将相机冷却至负26摄氏度。实验开始前10分钟。准备就绪后，使用衰减器将脉冲能量锁定为5毫焦。接着，取出待研究的样品载玻片，并准备将其安装在样品台上。将样品固定在电动样品台上。完成后，返回计算机。为定位样品，移动载物台，使样品的一部分位于激光束中。将激光焦点调节至样品表面下方约100微米处。此时，激光形成的烧蚀坑直径为50微米或更小。通过计算机将光谱仪的入射狭缝设为40微米，并设置ICCD参数以进行 Mapping 测量。调整支架位置以对准样品的特定区域。使用宽光谱光源拍摄样品的高分辨率全景图像。然后利用软件及所获取的图像定义激光诱导击穿光谱（LIBS）扫描区域和分辨率。此处网格为 100 × 100，点间距为 100 微米。开始在网格的每个点上自动采集数据。每个点的光谱将被测量并记录到文件中。当测量在约30分钟内完成后，对样品切片再拍摄一张图像，然后将所有光谱整合到一个数据文件中以供后续使用。接下来，取下样品载玻片，准备安装校准样品。将带有校准样品的石英载玻片固定在计算机端的平移台上。将第一个校准样品的中心置于激光光路中。保持实验参数不变，记录光谱。对每种不同钆浓度的样品重复相同操作。这些是从肾脏组织不同区域记录的单次激发光谱示例。蓝色光谱记录自肾脏的中央区域，红色光谱对应肾脏膜区域，绿色光谱则来自外周区域。所注射的基于钆的纳米颗粒由聚乳酸基质构成，其表面通过DOCA配体螯合钆离子。在286纳米至320纳米的光谱范围内，可检测到钆、钙、铁、硅和铝元素。注意观察样品不同区域中信号强度的变化，表明这些元素在组织中的浓度存在显著异质性。利用激光诱导击穿光谱（LIBS）数据，以约100微米的分辨率，对小鼠肾脏切片中钆、硅和铁的分布进行了成像分析。强度的刻度以任意单位表示。此为自然光图像。作为对比，肿瘤样本也获得了类似结果。与这张钆和SQ 20 B肿瘤组织分布图一样，自然光图像上叠加了伪彩色标尺。在本实验中，纳米颗粒被直接注入肿瘤内。一小时后，切除肿瘤并制备用于分析。请注意，大约一半的肿瘤体积中含有某些颗粒。如果操作得当，该技术可在一小时内完成每平方厘米样品、分辨率为100微米的检测。进行激光诱导等离子体光谱（LIBS）分析时，必须牢记测量数据来源于激光诱导产生的等离子体，因此在整个实验过程中严格按照操作步骤控制所有参数至关重要。还可以对相邻切片进行其他方法检测，例如免疫组织化学，以回答更多相关问题，如参与特定生物学过程的细胞类型。该技术为纳米技术在生物学和医学领域应用的研究人员提供了新途径，使其能够探索含金属元素的化合物在生物组织中的分布情况。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用激光剥蚀电感耦合等离子体质谱技术对生物组织中的多种元素进行定位与成像。

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激光诱导击穿光谱：对于纳米粒子的映射和定量的器官组织的新方法

激光烧蚀电喷雾电离（LAESI）是一种用于质谱分析的常压电离源。在成像模式下，中红外激光用于探测组织切片或生物膜中分子的空间分布。该技术为在接近天然实验条件下开展多种生物分析研究提供了一种新方法。...

大气压分子成像技术在生物组织和生物膜的激光烧蚀电喷雾电离质谱分析中的应用

来源：Hare, D. J., 等. 利用激光剥蚀-电感耦合等离子体质谱法（LA-ICP-MS）对脑组织中的金属进行成像。 J. Vis. Exp.

激光消融-电感耦合等离子体质谱法可视化小鼠脑组织中的金属元素

采用不同脉冲能量和时序参数测试了激光诱导击穿光谱（LIBS）对土壤模拟物的检测能力。利用校准曲线确定了不同参数下的检测限和灵敏度。结果总体表明，使用较低脉冲能量和非门控检测方式并未显著降低检测能力。...

激光诱导击穿光谱结果对脉冲能量和时序参数的依赖性研究：基于土壤模拟物的实验

使用激光诱导击穿光谱（LIBS）测量时间分辨的原子和双原子分子种类。在Nd:YAG激光辐射引发光学击穿等离子体后，于不同时间延迟下采集光谱。 并被用于推断电子密度和温度。...

激光诱导光学击穿后原子氢及双原子分子AlO、C2、CN和TiO光谱的测量与分析

本文描述了在扫描透射电子显微镜中使用能量色散X射线断层成像技术，对单个纳米颗粒内元素分布进行三维表征的方法。...

用于单个纳米颗粒三维元素分布的X射线能量色散断层扫描

基于分子键固有振动的相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）显微技术，能够实现无需标记的化学选择性活细胞成像。本文介绍了在基于飞秒钛宝石激光器和OPO激光器的标准多光子激光扫描显微镜上，实现一种互补显微技术的方法。...

在基于钛宝石和光参量振荡器激光器的标准激光扫描显微镜上实现相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）系统

激光常用于研究细胞对DNA损伤的响应。然而，激光产生的损伤位点之间的间距、发生频率及其与复制叉的碰撞情况很少被表征。本文中，我们描述了一种利用激光定点诱导链间交联的方法，可实现对这些参数的测定。...

单分子分析激光定位补骨脂素加合物

在真空感应熔炼过程中，采用激光诱导击穿光谱法对熔融合金主要成分元素进行实时定量分析。...

基于激光诱导击穿光谱的真空感应熔炼定量分析

冰冻圈中的碳通量目前几乎尚未得到评估，但在气候变化方面至关重要。本文展示了一种新型原型装置，该装置基于激光诱导荧光发射（L.I.F.E.）技术，在原位条件下提供高光谱和高空间分辨率的数据，用于捕捉表生冰川环境中的光合潜力。...

激光诱导荧光发射（L.I.F.E.）作为一种新型非侵入式工具用于冰冻圈生境中生物标志物的原位测量

本文介绍了光谱聚焦模块与双输出脉冲激光器的集成，实现了对金纳米颗粒和癌细胞的快速高光谱成像。本研究旨在展示在标准激光扫描显微镜上实现多模态非线性光学技术的详细方法。...

利用多模态非线性光学显微技术对细胞摄取纳米颗粒的生物分子成像

液相超快激光烧蚀是一种在液体/空气环境中精确且多功能的纳米材料（纳米颗粒[NPs]和纳米结构[NSs]）合成技术。通过激光烧蚀制备的纳米材料可与拉曼活性分子功能化结合，以增强位于纳米结构/纳米颗粒上或附近的分析物的拉曼信号。...

超快激光烧蚀纳米颗粒与纳米结构在表面增强拉曼散射传感应用中的研究

了解激光诱导击穿光谱技术如何用于生物组织中的元素映射和定量分析。该方法可实现100微米分辨率的高灵敏度检测，并与常规光学显微镜兼容，适用于纳米粒子分布研究。

激光诱导击穿光谱：一种用于组织中纳米颗粒成像与定量的新方法

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