一种用于高灵敏度、大规模定量代谢组学的策略

本实验的总体目标是研究培养细胞中的代谢谱。首先从细胞中提取极性代谢物，以实现这一目标。第二步是将细胞提取物重悬于水中，并将样品转移至液相小瓶中。

接下来，将样品注入已校准的液相色谱-QE-MS仪器中，并在最后一步将原始数据记录在计算机中。使用商业软件从原始数据中提取代谢物峰，并将未知峰与高分辨质谱数据库进行比对。尽管该方法可用于分析SARS中代谢物的相对水平，也可应用于其他体系，如血清或组织。

首先，配制 500 毫升流动相 A，其中含 20 毫摩尔醋酸铵和 15 毫摩尔氢氧化铵，溶剂为 3% 乙腈和水。将溶液装入瓶中，瓶盖稍松，置于水浴超声仪中，不加热超声 10 分钟。随后，将五毫克氟乙酸钠和酸分别溶解于五毫升水中，配制成终浓度为一毫克每毫升的溶液。

然后将二嗪农溶于甲醇中，配制成终浓度为10微克每毫升的溶液。为制备1毫升负离子低质量校准溶液，将960微升Thermo负离子校准溶液与20微升氟乙酸钠和高香草酸溶液混合。为制备1毫升正离子低质量校准溶液，将990微升Thermo正离子校准溶液与10微升二嗪农溶液混合。

在正离子模式下完成标准质谱校准后，在仪器控制面板中将扫描范围调整为质荷比60至900，并设置源内碰撞诱导解离为25电子伏特。输入自定义校准离子，待离子源稳定后，在调谐页面启动自定义校准。在负离子模式下完成标准质谱校准后，将极性切换至负离子模式，在仪器控制面板中将扫描范围调整为质荷比60至900，并设置源内碰撞诱导解离为35电子伏特。

输入自定义的校准离子，待离子源稳定后，启动自定义校准。在调谐页面中，将 Q-Exactive 质谱仪配备加热电喷雾电离（HESI）探针，将其固定在 C 级位置，然后连接氮气入口、汽化器电缆和电压电缆。在计算机调谐页面中，设置探针相关的调谐参数。

将毛细管温度设置为 320 摄氏度，S 透镜设置为 55。接下来在方法程序中，使用以下参数建立全扫描方法。通过输入线性梯度信息来建立色谱方法。

在室温下使用酰胺柱进行化合物分离。此时，通过手动混合40毫升甲醇和10毫升水，在50毫升离心管中配制提取溶剂。当先前培养的结肠癌H CT eight细胞达到80%融合度时。

迅速吸除培养基，将六孔板置于干冰上。立即向每孔加入一毫升提取溶剂，并将六孔板转移至-80摄氏度冰箱中。15分钟后从冰箱中取出六孔板，置于干冰上，将细胞刮入溶剂中。

将每个孔中的溶液转移至三个1.7毫升的einor管中，并在4°C条件下以20,000 × g离心10分钟。离心后，将上清液转移至两个新的einor管中。随后在真空浓缩仪中干燥样品。

样品干燥后，将其保存于负80摄氏度的冰箱中。分析前从冰箱中取出样品，待其温度降至冰点温度后，加入20微升冰水，并涡旋振荡样品以溶解代谢物。

接下来，在 4°C 条件下以 20,000 × g 离心样品 2 分钟。将上清液转移至液相色谱小瓶中，取 5 µL 样品注入液相色谱-QE-MS 仪器进行分析。在 Q-Exactive 质谱仪完成正确校准后，以流动相 B 占 85%、流速为 0.15 mL/min 的条件平衡液相色谱柱 5 分钟。

接下来，将样品序列设置为随机顺序，以将液相色谱-质谱联用（LCMS）引入的波动均匀分布到每个样品中，确保不同样品之间的比较更加准确。每分析六个样品后，加入一次清洗运行，随后运行一个空白样品，以评估系统背景和残留水平。保存序列并开始运行序列。

当液相色谱柱的压力在序列前两个样品运行后稳定接近 400 PSI 时，检查这些色谱图中的峰，确认是否存在未知代谢物，以确保样品序列运行顺利。待序列中所有样品完成后，在另一台计算机上进行数据分析。选择商业软件中适用于小分子的峰对齐和谱峰提取方法。

然后加载液相色谱-质谱原始数据，并根据样本类型进行分组。从运行序列中间选取样本作为色谱参考样本用于峰对齐，另选取一组作为比率组或用于全变化量计算。接着上传包含已知代谢物的框架种子文件，用于靶向代谢物分析，并关联所收集的数据及相应的框架种子文件。

接下来，在正离子或负离子模式下选择全扫描谱图，并将此数据处理文件保存在与原始数据相同的文件夹中。关闭数据库搜索功能，运行工作流程。然后将处理后的数据导出为包含每个峰面积的 Excel 表格。

对于非靶向代谢物分析，选择组分提取方法。加载样本的原始数据以及三个空白样本用于背景扣除。随后，对原始数据进行分组，并按先前所述设置参考样本。

将组分阈值设置为10的5次方。使用人类代谢组数据库进行未知化合物鉴定。保存此处理文件后，关闭数据库搜索功能并启动工作流程。

数据处理完成后，使用变异系数（CV）筛选或CV滤波方法去除在重复样本中CV值较大的组分，并结合强度滤波。为手动去除在噪声水平检测到的组分，需逐一检查每个组分，挑选出具有明确峰形或在不同样本类型间存在相对较大差异的组分用于数据库检索。最后，导出在数据库中获得匹配结果的数据。

代谢组学数据的准确性在很大程度上取决于液相色谱-四极杆静电场轨道阱质谱（lc QEMS）仪器的性能，以评估仪器是否处于良好运行状态以及所采用的方法是否合适。如图所示，从总离子色谱图中提取了多个已知代谢物的液相色谱峰。在当前的液相色谱条件下，极性代谢物包括氨基酸、糖酵解中间产物、三羧酸循环（TCA）中间产物、核苷酸、维生素、ATP 和 NADP 在色谱柱上具有良好的保留效果和理想的峰形。

同时，在低质量校准后24小时内进行质量误差测试，如图所示。此处通过将检测到的质荷比与目标代谢物的理论质荷比进行比较，来评估质量误差。这些目标代谢物的质荷比范围为74至744。

此处的 Y 轴表示在特定质荷比误差范围内的代谢物累积百分比。蓝色曲线显示了从零到 12 小时的结果，而红色曲线则显示了校准后 12 到 24 小时采集的数据。超过 90% 的代谢物质荷比误差在百万分之五以内，这表明本文开发的低质荷比范围校准方法足以维持低质荷比范围检测时百万分之五的质荷比误差。

另一个需要解决的问题是当前方法和仪器配置下仪器的灵敏度。对来自一个10厘米培养皿的三份重复样品进行五次连续稀释，每次稀释倍数为六倍，共得到六种不同浓度的样品。通过使用靶向列表来评估在不同样品浓度下检测到的代谢物数量。

此处结果显示，检测到目标代谢物数量最适的细胞数介于 2.78 × 10⁵ 至 1.67 × 10⁶ 个细胞之间，而使用 1 × 10⁷ 个细胞时检测到的代谢物数量较少，这是由于离子抑制效应所致。该结果表明，进行此分析时提取细胞的最适数量大致相当于六孔板中一个孔的细胞量。对于非靶向代谢物分析，采用 20% 的变异系数（CV）截断值和 10⁷ 的平均强度值来筛选组分表。

可提高CV截断值，同时需要降低平均强度值，以纳入更多峰。在手动检查峰形良好的峰组分后，选择并检索人类代谢组数据库。此处列出正离子模式下采集数据的结果，负离子模式下的结果则列于此处。此处鉴定出的部分代谢物与靶向列表中的代谢物存在重叠，例如谷胱甘肽和脯氨酸。

除靶向列表中的代谢物外，还可检测一些未列入靶向列表的代谢物，例如甲基乙二醛，其可来源于糖酵解；以及一磷酸乙酯、二乙醇胺基甘油、三磷酸胆碱，其中三磷酸胆碱在正离子模式下检出，保留时间为3.2分钟。观看本视频后，您应能够充分理解如何从培养的细胞中提取多种代谢物，并利用RC-QE-MS测定不同样本中代谢物的相对含量。感谢您的观看。