Name: 敏感，大规模定量代谢组学的策略 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-27T13:45:00.000+00:00
Duration: 14 min 18 s
Description: 学习使用液相色谱-高分辨质谱联用技术从培养细胞中提取和分析极性代谢物的方法。该方案为代谢组学研究提供了可靠的框架，可应用于血清和组织等多种生物样本，有助于深入理解健康和疾病状态下的代谢变化。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

作者谨此感谢 Detlef Schumann、Jennifer Sutton（Thermo Fisher Scientific）和 Nathaniel Snyder（宾夕法尼亚大学）在质谱校准和数据处理方面的宝贵讨论。&#160; 本研究由美国国立卫生研究院下属的国家癌症研究所资助，资助编号为 R00CA168997。本内容完全由作者负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。

1. 液相色谱-质谱试剂的准备、色谱方法的建立以及仪器操作程序的建立
<ol>
	<li>LC溶剂的制备
	<ol>
		<li>配制500 ml流动相。A相为含20 mM乙酸铵和15 mM氢氧化铵的3%乙腈/水溶液，最终pH为9.0；&#160;B相为100%乙腈。</li>
		<li>将瓶盖松开，放入水浴超声仪中，超声10分钟，不额外加热。（此步骤旨在确保所有铵盐完全溶解，并无残留气泡。）</li>
		<li>将250 ml溶剂转移至250 ml玻璃瓶中用于LC-MS，其余部分在4 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制低质量数范围校准溶液。在代谢组学应用中，使用定制的低质量数范围校准混合物至关重要，以确保在低分子量范围内准确检测质量数。
	<ol>
		<li>称取氟乙酸钠和高香草酸各5 mg，溶于5 ml水中，配制成终浓度为1 mg/ml的溶液。将二嗪农溶于甲醇中，配制成终浓度为10 mg/ml的溶液。</li>
		<li>配制1 ml负离子模式低质量数校准溶液：将960 ml赛默飞负离子校准溶液与20 ml氟乙酸钠和高香草酸溶液混合。配制1 ml正离子模式低质量数校准溶液：将990 ml赛默飞正离子校准溶液与10 ml二嗪农溶液混合。（低质量数校准溶液应于4 °C保存，每2&#160;个月新鲜配制一次。）</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在低质量数范围内对QE-MS进行校准
	<ol>
		<li>在进行低质量数范围校准前，根据仪器制造商的说明，在正负两种模式下完成标准质量校准（m/z范围为150–2,000）。</li>
		<li>标准质量校准通过后，在仪器控制面板中将扫描范围调整为60–900 m/z，并设置电离源碰撞诱导解离（CID）能量：正离子模式为25 eV，负离子模式为35 eV。（此设置可获得咖啡因碎片离子和硫酸根离子的强信号。此处扫描范围固定，因为末尾m/z值不应超过起始m/z值的15倍&#160;。）</li>
		<li>待离子源稳定后，执行定制化校准。注：离子源稳定定义为正离子模式下总离子流变化小于10%，负离子模式下小于15%。定制化校准所用离子及其对应的m/z值见表1。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>建立用于极性代谢物分析的LC-MS仪器系统。液相色谱（LC）与QE-MS联用，用于代谢物的分离与检测。
	<ol>
		<li>为QE-MS配备加热电喷雾电离探针（H-ESI）。设置探针相关调谐参数如下：加热器温度120 °C；鞘气30；辅助气10；吹扫气3；喷雾电压：正离子模式3.6 kV，负离子模式2.5 kV。毛细管温度设为320 °C，S透镜设为55。</li>
		<li>建立全扫描方法如下：全扫描范围：60–900（m/z）；分辨率：70,000；最大注入时间：200 msec，典型注入时间约为50 msec；自动增益控制（AGC）：3,000,000离子。这些参数设置可实现约550 msec的循环周期，用于在正负两种模式下进行扫描。</li>
		<li>建立色谱方法。采用酰胺柱（100 × 2.1 mm内径，3.5 µm）在室温下进行化合物分离13,15。流动相A如上所述，流动相B为乙腈。采用以下线性梯度：0 min，85% B；1.5 min，85% B；5.5 min，35% B；10 min，35% B；10.5 min，35% B；14.5 min，35% B；15 min，85% B；20 min，85% B。流速设置为：0–10 min和15–20 min期间为0.15 ml/min，10.5–14.5 min期间为0.3 ml/min。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 代谢物样品的制备
<ol>
	<li>配制提取溶剂。在50 ml离心管中混合40 ml甲醇（LC-MS级）和10 ml水（LC-MS级），使用前于-80 °C冰箱中预冷至少1小时。注意：本步骤及以下步骤可根据生物组织和体液样本的提取需求进行适当调整。
	<ol>
		<li>在三个10 cm培养皿或6孔板中，使用完全培养基RPMI 1640（添加10%热灭活胎牛血清以及100,000单位/L青霉素和100 mg/L链霉素）培养结肠癌HCT 8细胞。</li>
		<li>当细胞融合度达到80%时，迅速吸除培养基，并将培养皿或孔板置于干冰上13,15。立即加入1 ml提取溶剂（80%甲醇/水），并将孔板转移至-80 °C冰箱。对于10 cm培养皿，每个孔加入3 ml提取溶剂。（应尽可能彻底去除培养基，以避免培养基中残留盐分导致的离子抑制效应。）</li>
		<li>将孔板静置15分钟，取出后在干冰上刮取细胞至溶剂中。将溶液转移至1.7 ml Eppendorf离心管，于4 °C以20,000 × g离心10分钟。（从三个独立培养皿中分别制备细胞代谢物，以获得三个重复样本。保留两管样本的目的是作为备份。）</li>
		<li>将上清液转移至两个新的Eppendorf离心管中，并在真空浓缩仪中干燥。干燥时间约为3–6小时&#160;，具体时间取决于所用真空浓缩仪的性能。（样本也可在氮气环境下过夜干燥。）</li>
		<li>干燥完成后，将每份样本的离心管保存于-80 °C冰箱中。使用时，将其中一份样本溶解于20 µl水（LC-MS级）中，取5 µl注入LC-QE-MS进行分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 样品序列的设置
<ol>
	<li>在QE-MS上完成校准后，以0.15 ml/min的流速用85% A相平衡液相色谱柱5分钟，此为液相梯度的起始条件。</li>
	<li>将样品序列设置为随机顺序。注意：此方式可将液相-质谱系统引入的波动均匀分布至每个样品，确保不同样品间的比较更加准确。每运行6个样品后插入一次清洗进样，该清洗进样采用相同的质谱方法，但液相梯度为95% A相持续10分钟，随后在85% A相、流速0.15 ml/min条件下平衡色谱柱5分钟。每次清洗进样后加入空白样品（100%水），以评估系统背景信号和样品残留水平。</li>
	<li>保存序列，待液相色谱柱压力稳定至约400 psi后，启动序列运行。若该序列之后无其他样品运行，则在序列末尾添加一个终止进样，其梯度结束时流速为0 ml/min，并在序列完成后选择“待机”模式。</li>
	<li>在校准完成12小时后，重新运行同一样品集。（此步骤用于评估校准后质量误差的波动情况。）</li>
</ol>
4. 分析后仪器清洁与维护
<ol>
	<li>序列结束后，以 0.2 ml/min 的流速用 95% A 溶液冲洗色谱柱 2 小时，必要时在冲洗前将色谱柱反接。</li>
	<li>拆下液相色谱柱，通过接头将液相系统直接连接至离子源。配制清洗溶剂（水/甲醇/甲酸，v:v:v，90:10:0.2），将质谱调至待机模式，以 0.1 ml/min 的流速清洗液相-质谱系统 1 小时，以去除残留的沉淀盐分或其他杂质。若系统压力过高，应降低流速。</li>
	<li>将毛细管温度设为 50 °C，待温度降至 50 °C 后，小心拆下离子阱，并取出离子扫集锥和离子传输管。使用粗糙表面材料（如砂纸）清除离子扫集锥表面残留的杂质。</li>
	<li>将离子传输管放入含有 10 ml 含 0.1% 甲酸的 90% 水/甲醇溶液的 15 ml Falcon 管中。在水浴超声仪中于 20 分钟内超声清洗后，倾去管内溶剂，更换为 10 ml 纯甲醇，再超声清洗 20 分钟。（如有需要，可于 40 °C 或更高温度下进行超声，以获得更佳清洗效果。）</li>
</ol>
5. LC-MS 数据分析
<ol>
	<li>为确保样品序列运行顺利，在完成序列中的前两个样品后，检查未知代谢物的峰形。使用包含代谢物名称、中性化学式及检测模式（正离子或负离子模式）的 csv 文件作为输入文件，输出文件将包含提取的峰及以 ppm 为单位的质量误差。如果峰形异常或质量误差超过 5 ppm，则需停止后续序列运行并进行故障排查。</li>
	<li>在商业软件中选择“峰对齐与峰组提取”方法。导入液相色谱-质谱（LC-MS）的原始数据并进行分组。选取运行序列中间的样品作为色谱参考样品用于峰对齐。上传包含已知代谢物的峰组种子文件，用于靶向代谢物分析，并关联采集的数据及相应的峰组种子。</li>
	<li>分别在正离子和负离子模式下进行数据分析。其他参数使用默认设置。关闭数据库搜索功能并运行工作流程。将处理后的数据导出为 Excel 表格，其中包含每个峰组的峰面积。前若干个峰组对应靶向列表中的代谢物。注：对于靶向代谢物分析，代谢物信息基于先前的研究13,15。</li>
	<li>对于非靶向代谢物分析，选择“组分提取”方法。加载空白样品以进行背景扣除。设置峰强度阈值为 105，m/z 宽度为 10 ppm，信噪比为 3。</li>
	<li>使用人类代谢组数据库（Human Metabolome Database）对未知化合物进行鉴定。利用变异系数（CV）过滤器剔除在重复样品中 CV 值过大的组分。手动检查每个组分，挑选峰形清晰或在不同样品类型间差异相对较大的组分进行数据库搜索。导出在数据库中有匹配结果的数据。（若峰对齐评分过低，可跳过峰对齐步骤。）</li>
</ol>

<ol><li>Fiehn, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+genomics%2C+metabolome+analysis%2C+and+biochemical+modelling+to+understand+metabolic+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+and+Functional+Genomics%22%5BJournal%5D)">Combining genomics, metabolome analysis, and biochemical modelling to understand metabolic networks.</a> Comparative and Functional Genomics. 2 (3), 155-168 (2001).</li>
<li>Mulleder, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+prototrophic+deletion+mutant+collection+for+yeast+metabolomics+and+systems+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A prototrophic deletion mutant collection for yeast metabolomics and systems biology.</a> Nature Biotechnology. 30 (12), 1176-1178 (2012).</li>
<li>Patel, V. R., Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P., Baldi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CircadiOmics%3A+Integrating+circadian+genomics%2C+transcriptomics%2C+proteomics+and+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CircadiOmics: Integrating circadian genomics, transcriptomics, proteomics and metabolomics.</a> Nature Methods. 9 (8), 772-773 (2012).</li>
<li>Ideker, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+genomic+and+proteomic+analyses+of+a+systematically+perturbed+metabolic+network%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Integrated genomic and proteomic analyses of a systematically perturbed metabolic network.</a> Science. 292 (5518), 929-934 (2001).</li>
<li>Jonsson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+strategy+for+identifying+differences+in+large+series+of+metabolomic+samples+analyzed+by+GC%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A strategy for identifying differences in large series of metabolomic samples analyzed by GC/MS.</a> Analytical Chemistry. 76 (6), 1738-1745 (2004).</li>
<li>Jonsson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+data+analysis+for+detecting+and+identifying+differences+between+samples+in+GC%2FMS-based+metabolomic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">High-throughput data analysis for detecting and identifying differences between samples in GC/MS-based metabolomic analyses.</a> Analytical Chemistry. 77 (17), 5635-5642 (2005).</li>
<li>Weljie, A. M., Newton, J., Mercier, P., Carlson, E., Slupsky, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+profiling%3A+Quantitative+analysis+of+1H+NMR+metabolomics+data%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Targeted profiling: Quantitative analysis of 1H NMR metabolomics data.</a> Analytical Chemistry. 78 (13), 4430-4442 (2006).</li>
<li>Wiklund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+GC%2FTOF-MS-based+metabolomics+data+for+identification+of+biochemically+interesting+compounds+using+OPLS+class+models%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Visualization of GC/TOF-MS-based metabolomics data for identification of biochemically interesting compounds using OPLS class models.</a> Analytical Chemistry. 80 (1), 115-122 (2008).</li>
<li>Xia, J., Bjorndahl, T. C., Tang, P., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MetaboMiner--semi-automated+identification+of+metabolites+from+2D+NMR+spectra+of+complex+biofluids%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MetaboMiner--semi-automated identification of metabolites from 2D NMR spectra of complex biofluids.</a> BMC Bioinformatics. 9, 507(2008).</li>
<li>Lu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((13C+NMR+isotopomer+analysis+reveals+a+connection+between+pyruvate+cycling+and+glucose-stimulated+insulin+secretion+%28GSIS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">13C NMR isotopomer analysis reveals a connection between pyruvate cycling and glucose-stimulated insulin secretion (GSIS).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (5), 2708-2713 (2002).</li>
<li>Shen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+rate+of+the+glutamate%2Fglutamine+cycle+in+the+human+brain+b.+in+vivo+13C+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Determination of the rate of the glutamate/glutamine cycle in the human brain b. in vivo 13C NMR.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (14), 8235-8240 (1999).</li>
<li>Kitteringham, N. R., Jenkins, R. E., Lane, C. S., Elliott, V. L., Park, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+reaction+monitoring+for+quantitative+biomarker+analysis+in+proteomics+and+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography.+B%2C+Analytical+Technologies+in+the+Biomedical+and+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Multiple reaction monitoring for quantitative biomarker analysis in proteomics and metabolomics.</a> Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 877 (13), 1229-1239 (2009).</li>
<li>Locasale, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+of+human+cerebrospinal+fluid+identifies+signatures+of+malignant+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics+%3A+MCP%22%5BJournal%5D)">Metabolomics of human cerebrospinal fluid identifies signatures of malignant glioma.</a> Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 11 (6), 10-1074 (2012).</li>
<li>Wolf-Yadlin, A., Hautaniemi, S., Lauffenburger, D. A., White, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+reaction+monitoring+for+robust+quantitative+proteomic+analysis+of+cellular+signaling+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Multiple reaction monitoring for robust quantitative proteomic analysis of cellular signaling networks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (14), 5860-5865 (2007).</li>
<li>Yuan, M., Breitkopf, S. B., Yang, X., Asara, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+positive%2Fnegative+ion-switching%2C+targeted+mass+spectrometry-based+metabolomics+platform+for+bodily+fluids%2C+cells%2C+and+fresh+and+fixed+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A positive/negative ion-switching, targeted mass spectrometry-based metabolomics platform for bodily fluids, cells, and fresh and fixed tissue.</a> Nature Protocols. 7 (5), 872-881 (2012).</li>
<li>Ramanathan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((It+is+time+for+a+paradigm+shift+in+drug+discovery+bioanalysis%3A+From+SRM+to+HRMS%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mass+Spectrometry+%3A+JM%22%5BJournal%5D)">It is time for a paradigm shift in drug discovery bioanalysis: From SRM to HRMS.</a> Journal of Mass Spectrometry : JM. 46 (6), 595-601 (2011).</li>
<li>Lu, W., Clasquin, M. F., Melamud, E., Amador-Noguez, D., Caudy, A. A., Rabinowitz, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomic+analysis+via+reversed-phase+ion-pairing+liquid+chromatography+coupled+to+a+stand+alone+orbitrap+mass+spectrometer%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Metabolomic analysis via reversed-phase ion-pairing liquid chromatography coupled to a stand alone orbitrap mass spectrometer.</a> Analytical Chemistry. 82 (8), 3212-3221 (2010).</li>
<li>Michalski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra+high+resolution+linear+ion+trap+orbitrap+mass+spectrometer+%28orbitrap+elite%29+facilitates+top+down+LC+MS%2FMS+and+versatile+peptide+fragmentation+modes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics+%3A+MCP%22%5BJournal%5D)">Ultra high resolution linear ion trap orbitrap mass spectrometer (orbitrap elite) facilitates top down LC MS/MS and versatile peptide fragmentation modes.</a> Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 11 (3), 10-1074 (2012).</li>
<li>Michalski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+proteomics+using+Q+exactive%2C+a+high-performance+benchtop+quadrupole+orbitrap+mass+spectrometer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics+%3A+MCP%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based proteomics using Q exactive, a high-performance benchtop quadrupole orbitrap mass spectrometer.</a> Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 10 (9), (2011).</li>
<li>Snyder, N. W., Khezam, M., Mesaros, C. A., Worth, A., Blair, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Untargeted+Metabolomics+from+Biological+Sources+Using+Ultraperformance+Liquid+Chromatography-High+Resolution+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22UPLC-HRMS%29.+J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry.</a> UPLC-HRMS). J. Vis. Exp. (75), (2013).</li>
<li>Gika, H. G., Theodoridis, G. A., Wingate, J. E., Wilson, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Within-day+reproducibility+of+an+HPLC-MS-based+method+for+metabonomic+analysis%3A+Application+to+human+urine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Within-day reproducibility of an HPLC-MS-based method for metabonomic analysis: Application to human urine.</a> Journal of Proteome Research. 6 (8), 3291-3303 (2007).</li>
<li>Want, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+metabolic+profiling+procedures+for+urine+using+UPLC-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Global metabolic profiling procedures for urine using UPLC-MS.</a> Nature Protocols. 5 (6), 1005-1018 (2010).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

使用本方案在细胞中成功进行代谢物谱分析最关键的步骤包括：1）控制培养基并谨慎地提取细胞；2）根据质谱方法设置调整液相色谱方法，以确保每个色谱峰的定量分析中包含足够数量（通常至少10个）的数据点；3）在运行样品前进行低质量校准；4）进样量不超过5 ml，以避免因水引起的保留时间偏移和峰展宽；5）将用于比较的样品在同一批次中制备和运行，以最小化批次效应。
用于低质量范围校准的标准品（表1）可相互替换。&#160;任何质荷比（m/z）落在质量扫描范围之内、在H-ESI源中电离性能良好、且可溶于水、甲醇或乙腈的已知化合物，均可作为合理的校准标准品候选物。&#160;强烈建议将所有校准溶液储存于4 °C，以稳定咖啡因并减少校准溶液中甲醇或乙腈的挥发，从而提高校准结果的可重复性。&#160;与常规质量范围（m/z 150–2,000）相比，低质量范围校准需更频繁地进行，至少每两天一次。
该流程从提取溶剂、重悬溶剂、液相色谱流动相，到低质荷比范围校准及质谱扫描范围均已优化，用于检测极性代谢物，包括氨基酸、乙...

代谢组学被定义为可同时测定多种代谢物的实验，已成为备受关注的研究领域。&#160; 代谢组学能够直接反映分子水平的生理状态，并已为发育及癌症等疾病的研究提供了重要见解1-4。&#160;核磁共振（NMR）和气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）是最常用的分析仪器之一5-9。 &#160;特别是核磁共振技术，由于重同位素标记化合物（如13C标记的代谢物）具有NMR活性，因此常用于代谢通量分析10,11。 &#160;然而，该方法对样品纯度和样品量要求较高，限制了其在代谢组学中的广泛应用。&#160;同时，NMR采集的数据需要进行复杂的分析，且对复杂NMR谱图中的化合物进行归属较为困难。&#160;GC-MS已广泛应用于极性代谢物和脂质研究，但其要求待测化合物具有挥发性，因此通常需要对代谢物进行衍生化处理，而该过程有时涉及复杂的化学反应，耗时较长，并可能引入实验噪声。
液相色谱（LC）与三重四极杆质谱联用技术利用第一个四极杆选择完整的母离子，母离子随后在第二个四极杆中发生碎裂，而第三个四极杆则用于选择特征性碎片离子或子离子。&#160;该方法记录母离子向特定子离子的转化过程，被称为多反应监测（MRM）。&#160;MRM 是一种对小分子和蛋白质定量均具有高灵敏度、高特异性和高稳健性的方法12-15,21。&#160;然而，MRM 也存在其局限性。为实现高特异性，每种代谢物均需建立独立的 MRM 方法。该方法需确定特定的碎片离子及相应的优化碰撞能量，这要求预先掌握目标代谢物的性质信息，例如化学结构数据。因此，除少数涉及常见碎片中性丢失的情况外，该方法无法用于鉴定未知代谢物。&#160;

近年来，已推出多种高分辨率质谱仪（HRMS），例如 LTQ-orbitrap 和 Exactive 系列、QuanTof 以及 TripleTOF 560016-18,22高分辨质谱（HRMS）可提供完整离子的质荷比（m/z），误差仅为几个 ppm。因此，通过检测所有前体离子运行的 HRMS 仪器即 全扫描模式可从分析物的精确质量及其相应的元素组成中获得直接的结构信息，这些信息可用于鉴定潜在的代谢物。&#160; 事实上，通过精确质量可以获取化合物的全部信息，直至其结构异构体水平。 &#160;此外，全扫描方法无需预先了解代谢物，也无需进行方法优化。 &#160;此外，由于所有质荷比（m/z）落在扫描范围内的离子均可被分析，与多反应监测（MRM）方法相比，高分辨质谱（HRMS）在单次运行中可定量的代谢物数量几乎不受限制。由于较短的占空周期，HRMS在全扫描模式下可获得的数据点数量与三重四极杆MRM相当，因此在定量能力上亦可与之媲美。因此，HRMS为定量代谢组学提供了一种替代方案。近年来，一种改进型高分辨质谱——Q-Exactive质谱（QE-MS）可在单一方法中实现正负离子模式的快速切换，且循环时间足够短，从而扩展了检测范围19.&#160; 本文中，我们描述了使用QE-MS的代谢组学策略。&#160; &#160;

<table><tbody><tr><td>正离子校准混合物</td><td>Thermo Scientific</td><td>#88323</td><td>对光敏感，需在 4 &amp;deg;C 下保存</td></tr><tr><td>负离子校准混合物</td><td>Thermo Scientific</td><td>#88324</td><td>在 4 &amp;deg;C 下保存</td></tr><tr><td>二嗪农</td><td>Sant Cruz Biotechnology</td><td>#C0413</td><td>可引起眼部刺激，操作时应在通风橱中进行，并在 4 &amp;deg;C 下保存</td></tr><tr><td>H-ESI 针式插入件</td><td>Fisher Scientific</td><td>#1303200</td><td>若发生堵塞，可用 5% 甲酸/水溶液清洗（需取下橡胶环）或更换新件</td></tr><tr><td>Xbridge 胺基柱</td><td>Waters</td><td>#186004860</td><td>建议使用保护柱以延长色谱柱寿命</td></tr></tbody></table>

一种用于高灵敏度、大规模定量代谢组学的策略

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

代谢物谱分析在健康与疾病状态下的代谢研究中一直具有重要价值。然而，现有平台存在多种限制因素，例如样品制备过程劳动密集、检测限较低、扫描速度慢、每种代谢物均需进行繁琐的方法学优化，以及无法在单次实验中同时检测带正电荷和带负电荷的离子。因此，一种新型代谢组学方案有望推动代谢组学研究的发展。基于酰胺的亲水色谱技术可实现极性代谢物的分析，且无需任何化学衍生化步骤。采用Q-Exactive（QE-MS）的高分辨质谱技术改进了离子光学系统，提高了扫描速度（在70,000分辨率下为256毫秒），并具备正/负离子模式切换的能力。结合冷甲醇提取策略，将酰胺色谱柱与QE-MS联用，可同时实现对168种靶向极性代谢物及数千个其他特征峰的稳健检测。&#160; 数据处理通过 commercially available software 高效完成，从质谱中提取的未知特征可通过数据库进行查询。

代谢组学数据的准确性在很大程度上取决于LC-QE-MS仪器的性能。为了评估仪器是否处于良好运行状态以及所采用的方法是否合适，需从总离子色谱图（TIC）中提取若干已知代谢物的液相色谱峰，如图1所示。在当前液相条件下，极性代谢物（包括氨基酸、糖酵解中间产物、三羧酸循环中间产物、核苷酸、维生素、ATP、NADP+等）在酰胺柱上具有良好的保留效果和理想的峰形。同时，在低质量校准后24小时内进行质量误差测试，如图2所示。校准后，对6个不同浓度的样品（每个样品设三个重复）重复运行两次，整个测试时间跨度接近24小时。通过将检测到的m/z值与目标代谢物的理论m/z值进行比较，评估质量误差。此处目标代谢物的m/z范围从74（甘氨酸）到744（NADP+）。Y轴表示在特定质量误差范围内代谢物的累积百分比。蓝色曲线显示0–12小时内的结果，而红色曲线显示12–24小时内采集的数据。图2清楚表明，超过90%的代谢物质量误差在5 ppm以内，说明本研究建立的低质量范围校准方法足以维持低质量范围检测时的质量误差在5 pp...

代谢物谱分析在健康与疾病状态下的代谢研究中具有重要价值。本文介绍了一种利用正相液相色谱联用高分辨率质谱、极性切换及快速循环周期的技术方案，可对生物材料中的极性代谢物组成进行高灵敏度、高准确性和高分辨率的分析。

代谢物谱分析在健康与疾病状态下的代谢研究中一直具有重要价值。然而，现有平台存在多种局限性，例如样品制备劳动强度大、检测限较低、扫描速度慢、每种代谢物均需进行繁琐的方法优化，以及无法在单次实验中同时检测带正电荷和带负电荷的离子。因此，一种新型代谢组学实验方案有望推动代谢组学研究的发展。基于酰胺的亲水相互作用色谱技术可实现极性代谢物的分析而无需任何化学衍生化步骤。采用Q-Exactive（QE-MS）的高分辨质谱技术改进了离子光学系统，提高了扫描速度（在分辨率70,000时为256毫秒），并具备正/负离子模式切换能力。结合冷甲醇提取策略，将酰胺色谱柱与QE-MS联用，可同时实现对168种靶向极性代谢物及数千个非靶向特征的稳健检测。数据处理通过 commercially available software 高效完成，且可从质谱数据中提取未知特征并在数据库中进行查询。

本实验的总体目标是研究培养细胞中的代谢谱。首先从细胞中提取极性代谢物，以实现这一目标。第二步是将细胞提取物重悬于水中，并将样品转移至液相小瓶中。接下来，将样品注入已校准的液相色谱-QE-MS仪器中，并在最后一步将原始数据记录在计算机中。使用商业软件从原始数据中提取代谢物峰，并将未知峰与高分辨质谱数据库进行比对。尽管该方法可用于分析SARS中代谢物的相对水平，也可应用于其他体系，如血清或组织。首先，配制 500 毫升流动相 A，其中含 20 毫摩尔醋酸铵和 15 毫摩尔氢氧化铵，溶剂为 3% 乙腈和水。将溶液装入瓶中，瓶盖稍松，置于水浴超声仪中，不加热超声 10 分钟。随后，将五毫克氟乙酸钠和酸分别溶解于五毫升水中，配制成终浓度为一毫克每毫升的溶液。然后将二嗪农溶于甲醇中，配制成终浓度为10微克每毫升的溶液。为制备1毫升负离子低质量校准溶液，将960微升Thermo负离子校准溶液与20微升氟乙酸钠和高香草酸溶液混合。为制备1毫升正离子低质量校准溶液，将990微升Thermo正离子校准溶液与10微升二嗪农溶液混合。在正离子模式下完成标准质谱校准后，在仪器控制面板中将扫描范围调整为质荷比60至900，并设置源内碰撞诱导解离为25电子伏特。输入自定义校准离子，待离子源稳定后，在调谐页面启动自定义校准。在负离子模式下完成标准质谱校准后，将极性切换至负离子模式，在仪器控制面板中将扫描范围调整为质荷比60至900，并设置源内碰撞诱导解离为35电子伏特。输入自定义的校准离子，待离子源稳定后，启动自定义校准。在调谐页面中，将 Q-Exactive 质谱仪配备加热电喷雾电离（HESI）探针，将其固定在 C 级位置，然后连接氮气入口、汽化器电缆和电压电缆。在计算机调谐页面中，设置探针相关的调谐参数。将毛细管温度设置为 320 摄氏度，S 透镜设置为 55。接下来在方法程序中，使用以下参数建立全扫描方法。通过输入线性梯度信息来建立色谱方法。在室温下使用酰胺柱进行化合物分离。此时，通过手动混合40毫升甲醇和10毫升水，在50毫升离心管中配制提取溶剂。当先前培养的结肠癌H CT eight细胞达到80%融合度时。迅速吸除培养基，将六孔板置于干冰上。立即向每孔加入一毫升提取溶剂，并将六孔板转移至-80摄氏度冰箱中。15分钟后从冰箱中取出六孔板，置于干冰上，将细胞刮入溶剂中。将每个孔中的溶液转移至三个1.7毫升的einor管中，并在4°C条件下以20,000 × g离心10分钟。离心后，将上清液转移至两个新的einor管中。随后在真空浓缩仪中干燥样品。样品干燥后，将其保存于负80摄氏度的冰箱中。分析前从冰箱中取出样品，待其温度降至冰点温度后，加入20微升冰水，并涡旋振荡样品以溶解代谢物。接下来，在 4°C 条件下以 20,000 × g 离心样品 2 分钟。将上清液转移至液相色谱小瓶中，取

a-strategy-for-sensitive-large-scale-quantitative-metabolomics

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

敏感，大规模定量代谢组学的策略

采用超高效液相色谱-质谱联用技术（UPLC-MS）进行非靶向代谢物谱型分析是研究代谢的重要手段。本文概述了用于血清非靶向代谢物谱型分析的典型工作流程，包括样本组织与制备、数据采集、数据分析、质量控制以及代谢物鉴定。...

大规模非靶向血清代谢组学分析：超高效液相色谱-质谱法（UPLC-MS）

非靶向代谢组学可提供代谢谱的假设生成式快照。本方案将演示从细胞、血清或组织中提取和分析代谢物的方法。通过液-液相萃取、微流速超高效液相色谱/高分辨质谱法（UPLC-HRMS）结合差异分析软件，对多种代谢物进行检测。...

使用超高效液相色谱-高分辨质谱法（UPLC-HRMS）对生物来源样本进行非靶向代谢组学分析

代谢组学实验结果的可靠性取决于样品制备的有效性和可重复性。本文描述了一种严格且深入的方法，能够从生物液体中提取代谢物，并可选择性地对多达数千种化合物或仅特定感兴趣的化合物类别进行后续分析。...

多步制备技术以回收多种代谢物化合物类别用于深入且信息丰富的代谢组学分析

许多神经系统和全身性疾病会改变哺乳动物大脑的神经化学特性。通过脑组织粗提物，可高效获得特征性的脑代谢物谱。为此，采用高分辨率核磁共振波谱法，能够对代谢物浓度（代谢组学）进行详细的定量分析。...

利用组织提取物的高分辨率核磁共振波谱法对大鼠脑组织进行代谢组学分析

蛋白质-蛋白质相互作用以及蛋白质-代谢物相互作用对所有细胞功能至关重要。本文介绍了一种可对目标蛋白质的这些相互作用进行并行分析的实验方案。该方案针对植物细胞培养体系进行了优化，结合了亲和纯化与基于质谱的蛋白质及代谢物检测技术。...

一步亲和纯化并行分析蛋白质-蛋白质与蛋白质-代谢物复合物的2合1方法

本方案描述了一种高通量方法，结合互补的分析技术和组学技术，最终实现对不同生态系统中天然有机质和微生物蛋白质组的全面配对表征。该方法可进行可靠的比较，有助于识别对描述温室气体产生及预测环境变化响应具有重要意义的代谢途径和转化过程。...

用于表征复杂天然有机质混合物的单通量互补高分辨率分析技术

我们提出了一种用于鉴定和定量酿酒酵母（Saccharomyces...

使用液相色谱串联质谱法对Saccharomyces cerevisiae进行定量代谢组学分析

在本实验方案中，我们介绍了一种优化的工作流程，该流程结合了高效且快速的大量样本制备方法。此外，我们还提供了逐步操作指南，以减少分析变异，实现对代谢组全基因组关联研究的高通量评估。...

大规模多组学全基因组关联研究（Mo-GWAS）：样本制备与标准化操作指南

我们构建了一个整合了XY-Meta和metaX的非靶向代谢组学工作流程。在本方案中，我们展示了如何使用XY-Meta从开放获取的谱图参考数据库中生成诱饵谱图库，随后进行错误发现率（FDR）控制，并在完成代谢组学谱图鉴定后，利用metaX对代谢物进行定量分析。...

基于FDR控制的非靶向代谢组学鉴定与定量一体化工作流程

核磁共振（NMR）波谱法用于识别多种疾病患者中代谢物的异常调节。该技术可对异常代谢物进行定量分析，揭示其病理生理学机制。本文详细描述了基于核磁共振的患者代谢特征分析的逐步操作流程。...

基于核磁共振的代谢组学在危重患者中异常代谢物的鉴定与定量

本方案旨在通过挥发性盐溶液洗涤、液氮快速淬灭、冷冻干燥以及−8 °C保存相结合的方法，实现单细胞质谱分析（SCMS）中细胞代谢物的保存。结果表明，液氮淬灭对于维持代谢物谱至关重要，而应尽量减少长时间的低温保存，以避免代谢物发生改变。...

单细胞质谱代谢组学研究的样品制备：细胞洗涤、淬灭、干燥与储存的联合操作

学习使用液相色谱-高分辨质谱联用技术从培养细胞中提取和分析极性代谢物的方法。该方案为代谢组学研究提供了可靠的框架，可应用于血清和组织等多种生物样本，有助于深入理解健康和疾病状态下的代谢变化。

一种用于高灵敏度、大规模定量代谢组学的策略

探索更多视频