使用α-银环蛇毒素结合位点标签研究GABA A受体的膜定位与转运

本实验的总体目标是测量海马神经元中 GABAA 受体的表面定位及其内吞作用。首先，将带有标签的 GABAA 受体亚基转染至海马神经元，并将培养的神经元置于培养箱中使其发育。第二步，使用与荧光 Alexa 染料偶联的 α-苯二氮䓬毒素标记细胞表面的 GABAA 受体。

接下来，将神经元在不同时间点进行孵育，以允许标记的受体发生内吞。最后一步是在适当的时间点固定样本，并使用抗GFP抗体进行免疫染色，以观察总的标记受体池。最终，通过共聚焦显微镜结合固定样本或活体成像方法，观察标记的GABAA受体在细胞表面定位及内吞过程中的变化。

该方法有助于我们解答受体转运领域的关键问题，例如配体结合对受体的内吞和插入速率有何影响，以及不同配体和调节剂是否会影响受体的再循环与降解。尽管该方法主要用于研究神经系统背景下配体门控离子通道和G蛋白偶联受体，但它也可应用于研究多种组织的细胞培养体系及原代细胞中其他膜蛋白的动态定位与转运过程。通常，初次接触该方法的研究人员会面临两个主要困难。

首先，构建功能性表达载体；其次，练习并掌握同时处理多个时间点所需的操作经验。开始实验时，按照文本方案中的描述，在每个3.5厘米的组织培养皿内放置四至五个圆形多聚赖氨酸包被的玻璃盖玻片。随后，在原代神经元分离培养当天，使用一至四微克经大提纯化的构建质粒DNA对神经元进行转染。

将转染的神经元接种于多聚赖氨酸包被的盖玻片上，最终密度约为每3.5厘米培养皿200,000个神经元。在神经元培养制备后4至24小时内更换培养基。随后将神经元置于培养箱中培养，直至体外培养14至17天或达到进行内吞实验所需的特定阶段。

首先将台式冷却加热装置设定为 16 摄氏度。将细胞外液堆、缓冲盐溶液或 HBS 在水浴中冷却至 16 摄氏度。将神经元培养皿转移至 16 摄氏度的铝板上，冷却 5 分钟。

吸去培养基，加入1 mL 16 °C的HBS，同时加入150 µM的2-Bo-Rine，孵育2分钟。随后将培养基移至带标签的废液容器中，并更换为1 mL 16 °C的HBS，同时加入2-Bo-Kerine和α-Bungalow毒素，在16 °C下用Alexa 594孵育15分钟。

孵育结束后，将培养基转移至已标记的废液容器中，并用2毫升16摄氏度的HBS对培养皿清洗三次，用于后续受体胞吞作用的活细胞成像时间序列实验，实验使用底部为玻璃的3.5厘米培养皿。将培养皿转移至显微镜的加热载物台上，使用共聚焦显微镜或turf显微镜开始成像。准备用于固定盖玻片的实验步骤。

将时间点为零的盖玻片转移至含有室温4%多聚甲醛、4%蔗糖的培养皿中，固定20分钟；对于其他时间点，用预平衡的37摄氏度培养基替换HBS，并将样品放回37摄氏度培养箱中进行内吞作用，在所需时间点取出培养皿，用两毫升室温的Dulbecco磷酸盐缓冲液（DPBS）快速洗涤两次。

然后用 4% 多聚甲醛、4% 蔗糖固定样本 20 分钟。固定 20 分钟后，将 4% 多聚甲醛、4% 蔗糖移至废液容器中，并用两毫升室温 DPBS 洗涤培养皿两次。接着，将盖玻片在室温下孵育 10 分钟。

使用含有 0.2% Triton X-100 的免疫荧光封闭液对神经元进行透化处理，以实现对细胞内受体池的抗 GFP 免疫染色，或对其他目标蛋白进行标记。随后去除含透化剂的封闭液，将盖玻片在不含 Triton X-100 的免疫荧光封闭液中孵育 20 至 30 分钟。在封闭条件下，于室温孵育数小时或 4°C 过夜，进行盖玻片的一抗孵育。

将盖玻片浸入DPBS中，每次浸泡5分钟，共洗涤3次。随后在室温下用封闭液中的二抗孵育盖玻片1小时。之后再次用DPBS洗涤盖玻片3次，方法同前。

接下来，用实验室纸巾擦去盖玻片背面多余的液体，然后将盖玻片倒置在载玻片上4 µL封片剂中，完成每个盖玻片的封片。使用60倍油镜（数值孔径1.49）在共聚焦显微镜下盲法采集图像，避免知晓实验分组条件。

采用相同的图像采集参数，获取包含神经元胞体及数个树突过程的单个Z轴层面图像，针对每个神经元的3至4个近端树突中各20微米的区段，使用统一的分析阈值，定量分析α-bungarotoxin、Alexa荧光信号以及GFP免疫染色信号，以进行所有内吞作用数据的比较。每个时间点分析10至12个神经元的数据。通过多批独立的神经元培养重复实验。

GABA能轴突在锥体神经元树突上形成抑制性突触连接。突触前抑制性终末通过囊泡抑制性氨基酸转运体进行识别，该转运体负责将GABA和甘氨酸装载至突触囊泡中。GABAa受体紧密地位于神经递质释放位点的对侧，该位点由突触后抑制性支架蛋白gein锚定。图中所示为表达α2-pHGFP-BPB-S的神经元，其表面GABAa受体用Alexa 594标记的bungeo毒素进行标记，随后使用抗GFP抗体对总受体群体进行免疫染色（绿色），并同时标记突触后抑制性支架蛋白gein或囊泡抑制性氨基酸转运体。

此处展示了体外培养15天的海马神经元中含α2亚基的GABAA受体的内吞作用，使用α-bungarotoxin标记。如图中各面板所示，对单个树突过程进行的荧光测量，通过GFP抗体染色对构建体表达水平进行归一化处理。各时间点的最终比较通过归一化至T=0时的测量值实现。

在60分钟内，受体内化程度的定量分析通过随时间变化的荧光信号改变来描述，最符合单指数模型。另一种方法是通过活细胞成像的时间序列共聚焦显微镜技术，在单个神经元中追踪受体的内吞过程。实验开始时可见P-H-G-F-P标记的GABA A受体与表面α-短毒素标记的受体呈现点状且重叠的荧光信号；随着时间推移，随着受体发生内吞，α-短毒素标记的GABA A受体信号逐渐减弱。

由于新受体的插入，P-H-G-F-P 信号仍保持较高水平，而 P-H-G-F-P 信号的轻微下降则是由于细胞表面受体分布的变化以及光漂白所致。在完成该操作后，还可开展其他方法，例如使用铃木毒素插入实验，以回答不同处理条件下受体插入速率等进一步的问题。该技术使得研究者能够评估细胞活动、特定蛋白质结构域、激动剂以及其他调节因子如何影响活神经元、其他细胞及组织中受体的周转过程。

观看本视频后，您应能够充分理解如何将α-鹅膏蕈碱偶联的Alexa染料与标准免疫荧光技术结合使用，以定量分析海马神经元中表面受体的定位情况。