Name: 使用α-银环蛇毒素结合位点标记来研究GABA A受体膜定位和贩运 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-28T15:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: 学习使用α-银环蛇毒素结合荧光Alexa染料标记海马神经元表面GABA_A受体，通过共聚焦显微镜分析受体内吞动态与膜定位变化。该方法为研究突触可塑性和抑制性神经传递机制提供可靠技术。

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本研究得到了匹兹堡大学医学院药理学与化学生物学系启动资金的支持。感谢为本视频投稿做出贡献的Jacob实验室成员：Nicholas Graff。

以下所述所有方案均符合匹兹堡大学医学院机构动物照护与使用委员会（IACUC）及机构审查委员会（IRB）的规定。
1. 在组织培养罩中制备海马神经元培养物
注意：整个实验方案中均需使用无菌技术和无菌试剂&#160;1.
<ol>
	<li>制备聚-D-赖氨酸（0.1 mg/ml，溶于H2以O型涂层玻璃盖玻片作为神经元培养的基质。
	<ol>
		<li>在每个3.5 cm培养皿中放入4-5片圆形玻璃盖玻片&#160;厘米组织培养皿</li>
		<li>70号点样位 &#956;将聚-D-赖氨酸涂布于每个12&#160;毫米盖玻片。注意：对于活体成像，可使用玻璃底的3.5厘米组织培养皿（点样200 &#956;将聚-D-赖氨酸涂覆于嵌入的14&#160;毫米玻璃盖玻片</li>
		<li>将制备好的培养皿放置于组织培养罩内过夜。为减少多聚-D-赖氨酸的蒸发并保持组织培养罩内表面无菌，需关闭罩窗并关闭吹风机过夜。注意：过夜孵育期间不使用紫外灯。</li>
		<li>次日早晨，用 2 ml H 洗涤培养皿 3 次2O.</li>
		<li>去除最后一个H后2O洗涤，向每个3.5&#160;cm 培养皿，并将培养皿置于培养箱中孵育，直至准备进行步骤 1.4 的神经元接种。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>海马神经元取自胚胎第18-19天（E18-19）的大鼠（改良自&#160;Goslin22).</li>
	<li>在培养当天，将1-4转染至新分离的神经元 &#956;微克级大量制备的构建体DNA。 
	注：通常为3 &#956;将 g 级别的 DNA 转染至 100–200 万神经元中，细胞存活率为 50%，转染效率为 60%（例如&#160;从200万个神经元开始：((2 x&#160;106 神经元 x&#160;0.5）0.6）可提供约100万个神经元，其中约60万个被转染1在排查过表达潜在问题时，可转染不同量的构建体DNA，随后对构建体的定位和功能进行适当的表征。</li>
	<li>将转染后的神经元接种到聚-D-赖氨酸包被的盖玻片上，终密度约为每3.5 cm² 200,000个神经元&#160;cm 培养皿。注意：对于玻璃底培养皿，将 40,000–50,000 个神经元接种于 14&#160;毫米玻璃区域。</li>
	<li>更换培养基，4-24 小时&#160;神经元培养制备完成后，将神经元置于培养箱中培养至第14-17天 体外 （体外培养天数）或目标阶段。</li>
</ol>
2. 胞吞作用检测
注意：关于α-银环蛇毒素和筒箭毒碱的废弃物处理与操作注意事项：
<ol>
	<li>建议在生物安全二级（BL-2）研究规程的指导下操作所有肽类神经毒素。必须穿戴适当的个人防护装备。冻干毒素粉末应按照生产商说明书进行重悬。毒素废弃物应根据所在机构的环境健康与安全指南进行处理。</li>
	<li>为去除在储存过程中可能形成的肽类聚集体，使用前应对α-银环蛇毒素（α-bungarotoxin）分装样品进行短暂离心，并取上清液用于实验。</li>
	<li>α-银环蛇毒素（Bgt）储备液用无菌H2O&#160;重悬至浓度为1 mg/ml，分装为10 μl每份，于-20 °C保存。荧光标记的Bgt储备液使用浓度为3 μg/ml。筒箭毒碱（Tubocurarine）的终浓度为150 μM。</li>
</ol>
<ol>
	<li>在冷室中将台式加热块设置为 16 °C，并在其顶部放置薄铝板或不锈钢板。或者，如果有条件，可使用台式冷却/加热装置完成每个需要 16 °C 的步骤。</li>
	<li>将细胞外 HEPES 缓冲盐溶液（HBS，成分（单位：mM）：135 NaCl、4.7 KCl、10 HEPES、11 葡萄糖、1.2 MgCl2 和 2.5 CaCl2，pH 7.4）在水浴中冷却至 16 °C。</li>
	<li>将神经元培养皿转移至 16 °C 的铝板上，冷却 5 分钟。</li>
	<li>移除培养基（保留条件培养基并置于培养箱中，用于步骤 2.8 的内吞实验时间点），并加入 1 ml 16 °C 的 HBS + 箭毒（150 μM），孵育 2 分钟。</li>
	<li>移除 HBS + 箭毒，更换为 1 ml 16 °C 的 HBS + 箭毒（150 μM）+ α-银环蛇毒素 Alexa 594 [3 μg/ml]，在 16 °C 下孵育 15 分钟。</li>
	<li>移除 HBS + 箭毒 + α-银环蛇毒素 Alexa 594 至标记的废液容器中，并用 2 ml 16 °C 的 HBS 洗涤培养皿 3 次（洗涤液可通过真空抽滤收集至含有 50 ml 50% 漂白液的真空瓶中）。</li>
	<li>对于使用玻璃底 3.5&#160;cm 培养皿进行的受体内吞活细胞成像时间序列实验，执行步骤 2.1–2.6 后，将培养皿转移至显微镜的加热载物台（帕尔贴装置）上，并使用共聚焦或全内反射荧光（TIRF）显微镜系统开始成像。</li>
	<li>将 T = 0 时间点的盖玻片转移至含有室温（RT）4% 多聚甲醛 / 4% 蔗糖的培养皿中固定 20 分钟，同时继续将其他盖玻片进行至步骤 2.9。</li>
	<li>对于其他时间点，将 HBS 替换为已平衡的 37 °C 条件培养基（步骤 2.4 中保留的），并放回培养箱中在 37 °C 下进行内吞。注意：建议额外设置 T = 15、30 和 60 分钟的时间点。</li>
	<li>在所需时间点，从培养箱中取出培养皿，用 2 ml 室温 DPBS（无钙、镁的 DPBS）快速洗涤两次，然后在 4% 多聚甲醛 / 4% 蔗糖中固定 20 分钟。</li>
	<li>固定 20 分钟&#160;后，将 4% 多聚甲醛 / 4% 蔗糖移至废液容器中，并用 2 ml 室温&#160;DPBS 洗涤培养皿两次。</li>
	<li>在含有 0.2% Triton X-100 的免疫荧光封闭液（封闭液 = DPBS 中含 5% 马血清和 0.5% BSA）中室温孵育盖玻片 10 分钟，以通透神经元，便于对细胞内受体池进行抗-GFP 免疫染色和/或标记其他目标蛋白。</li>
	<li>移除含 0.2% Triton X-100 的封闭液，将盖玻片在不含 Triton X-100 的免疫荧光封闭液中室温孵育 20–30 分钟。</li>
	<li>在封闭液中进行一抗孵育，室温孵育数小时或 4 °C 过夜&#160;。注意：盖玻片在 4 °C 过夜&#160;孵育通常可获得更佳的免疫荧光结果。</li>
	<li>用 DPBS 洗涤盖玻片 3 次（每次洗涤 5 分钟）。</li>
	<li>在封闭液中加入二抗，室温孵育盖玻片 1 小时。</li>
	<li>用 DPBS 洗涤盖玻片 3 次（每次洗涤 5 分钟）。</li>
	<li>逐个处理盖玻片进行封片：用实验纸巾吸去盖玻片背面多余液体，然后将其倒置在载玻片上 4 μl 封片介质中。</li>
	<li>将载玻片在室温下避光干燥 30 分钟，随后于 4 °C 保存，直至进行显微镜观察。</li>
	<li>使用共聚焦显微镜进行实验图像采集与分析（对实验条件设盲）。使用 60X 油镜 NA 1.49 浸油物镜，配备以下激光器：氩离子气体 488 nm、561 二极管、640 二极管。
	<ol>
		<li>使用相同的图像采集参数，获取神经元胞体及数个树突突起处于焦平面的单层 Z 轴图像。</li>
		<li>对每个神经元的 3–4 个近端树突中 20 μm 长度范围内的 α-银环蛇毒素 Alexa 荧光信号和 GFP 免疫染色信号进行定量分析，所有内吞数据的分析使用相同的阈值。</li>
		<li>对每个时间点的 10–12 个神经元进行数据分析，并使用多个独立的神经元培养重复实验。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Jacob, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gephyrin+regulates+the+cell+surface+dynamics+of+synaptic+GABAA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Gephyrin regulates the cell surface dynamics of synaptic GABAA receptors.</a> J. Neurosci. 25, 10469-10478 (2005).</li>
<li>Bogdanov, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+GABAA+receptors+are+directly+recruited+from+their+extrasynaptic+counterparts%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Synaptic GABAA receptors are directly recruited from their extrasynaptic counterparts.</a> EMBO J. 25, 4381-4389 (2006).</li>
<li>Thomas, P., Mortensen, M., Hosie, A. M., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+mobility+of+functional+GABA%28A%29+receptors+at+inhibitory+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dynamic mobility of functional GABA(A) receptors at inhibitory synapses.</a> Nat. Neurosci. 8, 889-897 (2005).</li>
<li>Wilkins, M. E., Li, X., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+Cell+Surface+GABAB+Receptors+Using+an+%CE%B1-Bungarotoxin+Tag%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Tracking Cell Surface GABAB Receptors Using an α-Bungarotoxin Tag.</a> J. Biol. Chem. 283, 34745-34752 (2008).</li>
<li>Saliba, R. S., Pangalos, M., Moss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin-like+protein+Plic-1+enhances+the+membrane+insertion+of+GABAA+receptors+by+increasing+their+stability+within+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin-like protein Plic-1 enhances the membrane insertion of GABAA receptors by increasing their stability within the endoplasmic reticulum.</a> J. Biol. Chem. 283, 18538-18544 (2008).</li>
<li>Bannai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-Dependent+Tuning+of+Inhibitory+Neurotransmission+Based+on+GABAAR+Diffusion+Dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Activity-Dependent Tuning of Inhibitory Neurotransmission Based on GABAAR Diffusion Dynamics.</a> Neuron. 62, 670-682 (2009).</li>
<li>Muir, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptors+regulate+GABAA+receptor+lateral+mobility+and+clustering+at+inhibitory+synapses+through+serine+327+on+the+gamma2+subunit%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">NMDA receptors regulate GABAA receptor lateral mobility and clustering at inhibitory synapses through serine 327 on the gamma2 subunit.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 16679-16684 (2010).</li>
<li>Katchalski-Katzir, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+synthesis+of+peptides+that+bind+alpha-bungarotoxin+with+high+affinity+and+mimic+the+three-dimensional+structure+of+the+binding-site+of+acetylcholine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Design and synthesis of peptides that bind alpha-bungarotoxin with high affinity and mimic the three-dimensional structure of the binding-site of acetylcholine receptor.</a> Biophys. Chem. 100, 293-305 (2003).</li>
<li>Scherf, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+beta+-hairpin+structure+in+a+13-mer+peptide+that+binds+alpha+-bungarotoxin+with+high+affinity+and+neutralizes+its+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A beta -hairpin structure in a 13-mer peptide that binds alpha -bungarotoxin with high affinity and neutralizes its toxicity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 6629-6634 (2001).</li>
<li>Wilkins, M. E., Li, X., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+cell+surface+GABAB+receptors+using+an+alpha-bungarotoxin+tag%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Tracking cell surface GABAB receptors using an alpha-bungarotoxin tag.</a> J. Biol. Chem. 283, 34745-34752 (2008).</li>
<li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394, 192-195 (1998).</li>
<li>Jacob, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benzodiazepine+treatment+induces+subtype-specific+changes+in+GABAA+receptor+trafficking+and+decreases+synaptic+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Benzodiazepine treatment induces subtype-specific changes in GABAA receptor trafficking and decreases synaptic inhibition.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 18595-18600 (2012).</li>
<li>Anderson, M. J., Cohen, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+staining+of+acetylcholine+receptors+in+vertebrate+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent staining of acetylcholine receptors in vertebrate skeletal muscle.</a> J. Physiol. 237, 385-400 (1974).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosslinkage+and+visualization+of+acetylcholine+receptors+on+myotubes+with+biotinylated+alpha-bungarotoxin+and+fluorescent+avidin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Crosslinkage and visualization of acetylcholine receptors on myotubes with biotinylated alpha-bungarotoxin and fluorescent avidin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 4823-4827 (1980).</li>
<li>Axelrod, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+motion+of+fluorescently+labeled+acetylcholine+receptors+in+membranes+of+developing+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Lateral motion of fluorescently labeled acetylcholine receptors in membranes of developing muscle fibers.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 4594-4598 (1976).</li>
<li>Sekine-Aizawa, Y., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+receptor+trafficking+by+using+alpha-bungarotoxin-binding-site-tagged+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Imaging of receptor trafficking by using alpha-bungarotoxin-binding-site-tagged receptors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17114-17119 (2004).</li>
<li>Jacob, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAA+receptor+membrane+trafficking+regulates+spine+maturity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">GABAA receptor membrane trafficking regulates spine maturity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 12500-12505 (2009).</li>
<li>Hannan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAB+receptor+internalisation+is+regulated+by+the+R2+subunit%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">GABAB receptor internalisation is regulated by the R2 subunit.</a> J. Biol. Chem. , (2011).</li>
<li>Saliba, R. S., Kretschmannova, K., Moss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+phosphorylation+of+GABAA+receptors+regulates+receptor+insertion+and+tonic+current%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent phosphorylation of GABAA receptors regulates receptor insertion and tonic current.</a> EMBO. 31, 2937-2951 (2012).</li>
<li>Beqollari, D., Betzenhauser, M. J., Kammermeier, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+G-Protein+Coupling+in+an+mGluR6+Point+Mutant+Associated+with+Congenital+Stationary+Night+Blindness%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Altered G-Protein Coupling in an mGluR6 Point Mutant Associated with Congenital Stationary Night Blindness.</a> Mol. Pharmacol. 76, 992-997 (2009).</li>
<li>Terunuma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+activation+of+NMDA+receptors+promotes+dephosphorylation+and+alters+postendocytic+sorting+of+GABAB+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Prolonged activation of NMDA receptors promotes dephosphorylation and alters postendocytic sorting of GABAB receptors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 13918-13923 (2010).</li>
<li>Goslin, K. G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+Nerve+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Culturing Nerve Cells.</a> , 2nd ed, MIT Press. (1998).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述基于BBS的固定和活细胞技术可用于追踪细胞系、神经元及其他原代细胞中受体或其他质膜蛋白的转运过程。该方法已成功用于研究配体门控离子通道和G蛋白偶联受体（GPCR）的膜插入与清除，并评估受体激动剂和调节剂存在时转运过程的变化。关键技术要点包括将标签准确定位于细胞外区域，以及进行对照实验，以确保BBS的添加（如同其他报告分子如GFP的标准操作）在功能上无干扰。对于表达烟碱型乙酰胆碱（nAChR）受体的细胞，在整个实验流程中必须按指示使用nAChR拮抗剂筒箭毒碱。若未使用额外的GFP标签，则可在固定和通透后，通过另一种荧光团偶联的α-银环蛇毒素染色来测定总BBS标记蛋白的水平。选择测定受体/目标蛋白内吞速率的时间点时，需结合对该受体/蛋白转运特性的现有认知，并在初期实验中设置较多的时间点进行探索。该技术也可方便地与常规免疫染色联合使用。我们还描述了一种通过活细胞共聚焦成像实验追踪受体内吞的替代方法。设备可用性、活细胞实验所需时间及其他实验限制条件将决定方法的选择，两种方法均为可行且已有文献报道。未来BBS技术的应用包括将活细胞或固定细胞成像与早期内体和溶酶体标记物结合，以追踪受体的命运，i.e. 受体向再循环内体的靶...

利用荧光标记的α-银环蛇毒素（α-bungarotoxin）研究受体定位与动态特性的方法最初应用于其内源性靶点——烟碱型乙酰胆碱受体的研究中13-15。随后，该方法通过引入最小Bgt结合肽（BBS），被广泛用于兴奋性和抑制性配体门控离子通道以及G蛋白偶联受体的转运研究2,10,16-21。基于BBS的技术相较于其他用于转运研究的方法具有多项优势，例如细胞表面生物素化、利用针对细胞外表位的抗体对活细胞进行标记，以及光漂白后荧光恢复（FRAP）等技术。在细胞表面生物素化过程中，游离胺基会发生共价修饰，可能影响细胞活性；基于抗体的研究常受到表面抗原聚集或帽状分布的限制，这可能改变转运过程；而FRAP实验由于涉及光漂白步骤，一个重要顾虑是可能损伤细胞内部结构。此外，BBS标记的构建体还可与生物素偶联的银环蛇毒素结合，用于生化方法检测受体转运，进一步拓展了该技术的应用价值。该技术可广泛适用于细胞系和原代细胞。对于表达烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）的细胞，在整个实验流程中必须按照说明使用nAChR拮抗剂筒箭毒碱（tubocurarine）。在未转染的细胞中，在不添加筒箭毒碱的情况下进行简单的表面Bgt标记（相当于内吞实验中T=0时间点），可作为内源性nAChR存在的证据。
使用该技术时需考虑的一个重要因素是 BBS 的适当插入位置，以确保目的蛋白被递送至质膜时，BBS 位于细胞外区域。例如，GABAAR 亚基的 N 末端结构域在运输过程中位于囊泡腔内，当受体插入质膜后则转变为胞外区域，从而可实现对细胞表面受体的特异性标记，并评估内吞事件介导的受体从细胞表面的移除。我们先前已证实，在 GABAAR 亚基的该结构域上添加 GFP、myc 或 BBS 表位不会影响其功能。应进行标准对照实验，以确保标记蛋白的表达水平与未标记构建体相似，定位正确，且不影响受体功能。对转染构建体的这一表征&#160;也将有助于解决过表达相关问题。

<table><tbody><tr><td>P3 原代细胞 4D 试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3024</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-布加毒素，Alexa Fluor 647 标记物</td><td>Molecular Probes</td><td>B35450</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-布加毒素，Alexa Fluor 488 标记物</td><td>Molecular Probes</td><td>B13422</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-布加毒素，Alexa Fluor 594 标记物</td><td>Molecular Probes</td><td>B13423</td><td></td></tr><tr><td>(+)-筒箭毒碱氯化物</td><td>Tocris</td><td>2820</td><td></td></tr><tr><td>封片介质&amp;nbsp;</td><td>DAKO</td><td>cS703</td><td></td></tr><tr><td>不含钙、镁的 DPBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>聚-D-赖氨酸&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>突触后支架蛋白 gephyrin 抗体</td><td>Synaptic Systems</td><td>147 011</td><td>1:300</td></tr><tr><td>VIAAT/VGAT 抗体</td><td>Synaptic Systems</td><td>131 002</td><td>1:1,000</td></tr><tr><td>抗 GFP 抗体</td><td>Life Technologies</td><td>A6455</td><td>1:2,000</td></tr><tr><td>玻璃底组织培养皿</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C - Mattek 培养皿</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片（圆形盖玻片），#1 厚度，12 mm</td><td>Warner Instruments</td><td>640-0702</td><td></td></tr></tbody></table>

使用α-银环蛇毒素结合位点标签研究gaba a受体的膜定位与转运

Using an &#945;-Bungarotoxin Binding Site Tag to Study GABA A Receptor Membrane Localization and Trafficking

越来越多的证据表明，神经递质受体（包括离子型 γ-氨基丁酸 A 受体（GABAAR））表现出高度动态的转运和细胞表面移动性1-7。为了研究受体在细胞表面的定位和内吞作用，本文所述技术结合使用荧光标记的α-银环蛇毒素（α-bungarotoxin）与表达含α-银环蛇毒素（Bgt）结合位点（BBS）构建体的细胞。该BBS序列（WRYYESSLEPYPD）基于肌肉型烟碱性乙酰胆碱受体的α亚基，可高亲和力地结合Bgt8,9。引入BBS位点后，可通过外源性荧光Bgt的应用来实现受体在细胞表面的定位，并检测受体的插入或移除，此前已在GABAA受体和代谢型GABAB受体的追踪研究中应用此方法2,10。除BBS位点外，我们还通过标准分子生物学与PCR克隆策略，在成熟GABAAR亚基第4和第5个氨基酸之间插入了一个pH敏感型绿色荧光蛋白（pHGFP11）（见图1）12。BBS位于pH敏感型GFP报告基因的3'端，两者之间由一段含13个氨基酸的丙氨酸/脯氨酸连接肽隔开。在本研究中基于固定样本的转运实验中，pHGFP可作为总标记GABAAR亚基蛋白水平的报告分子，使Bgt标记的受体群体可相对于总受体群体进行归一化处理，从而最小化因不同细胞中标签标记的GABAAR亚基基础表达水平高低不一所导致的Bgt染色信号差异。此外，pHGFP标签还可便于在活细胞或固定样本的成像实验中快速识别出表达该构建体的细胞。

BBS标签构建体的表征包括若干重要对照，例如确定表达的蛋白是否正确组装（特别是由多个亚基组成的受体）、是否转运至细胞表面以及是否正确定位。抑制性突触由GABA A受体表面簇组成，这些受体簇与抑制性支架蛋白gephyrin共定位，并与突触前抑制性终末相对，后者可通过囊泡抑制性氨基酸转运体（VIAAT/VGAT）进行鉴定，该转运体负责将GABA和甘氨酸装载至突触囊泡中。如图所示 图2 表达 α2pHGFP+BBS 的神经元经 Bgt 标记表面 GABAAR 后，再使用抗 GFP 抗体对总受体群体进行免疫染色，并同时标记突触后抑制性支架蛋白 gephyrin（图2A）或 VIAAT（图 2B).
图3 显示了15天体外培养（DIV）海马神经元中含α2亚基的GABAA受体的内吞作用。各图中所示单个树突过程的Bgt荧光强度测量结果图3A通过GFP抗体染色对构建体表达水平进行归一化处理。如图所示，各时间点的最终比较通过归一化至...

本文展示了使用荧光Alexa染料标记的α-银环蛇毒素来检测海马神经元中GABA A受体在细胞表面的定位及其内吞作用。通过使用带有可结合α-银环蛇毒素的短细胞外标签的构建体，可实现对质膜蛋白内吞运输过程的分析。

使用α-银环蛇毒素结合位点标签研究GABA A受体的膜定位与转运

神经递质受体（包括离子型GABA A受体（GABAAR））表现出高度动态的转运和细胞行为，这一现象正变得日益明显……

本实验的总体目标是测量海马神经元中 GABAA 受体的表面定位及其内吞作用。首先，将带有标签的 GABAA 受体亚基转染至海马神经元，并将培养的神经元置于培养箱中使其发育。第二步，使用与荧光 Alexa 染料偶联的 α-苯二氮䓬毒素标记细胞表面的 GABAA 受体。接下来，将神经元在不同时间点进行孵育，以允许标记的受体发生内吞。最后一步是在适当的时间点固定样本，并使用抗GFP抗体进行免疫染色，以观察总的标记受体池。最终，通过共聚焦显微镜结合固定样本或活体成像方法，观察标记的GABAA受体在细胞表面定位及内吞过程中的变化。该方法有助于我们解答受体转运领域的关键问题，例如配体结合对受体的内吞和插入速率有何影响，以及不同配体和调节剂是否会影响受体的再循环与降解。尽管该方法主要用于研究神经系统背景下配体门控离子通道和G蛋白偶联受体，但它也可应用于研究多种组织的细胞培养体系及原代细胞中其他膜蛋白的动态定位与转运过程。通常，初次接触该方法的研究人员会面临两个主要困难。首先，构建功能性表达载体；其次，练习并掌握同时处理多个时间点所需的操作经验。开始实验时，按照文本方案中的描述，在每个3.5厘米的组织培养皿内放置四至五个圆形多聚赖氨酸包被的玻璃盖玻片。随后，在原代神经元分离培养当天，使用一至四微克经大提纯化的构建质粒DNA对神经元进行转染。将转染的神经元接种于多聚赖氨酸包被的盖玻片上，最终密度约为每3.5厘米培养皿200,000个神经元。在神经元培养制备后4至24小时内更换培养基。随后将神经元置于培养箱中培养，直至体外培养14至17天或达到进行内吞实验所需的特定阶段。首先将台式冷却加热装置设定为 16 摄氏度。将细胞外液堆、缓冲盐溶液或 HBS 在水浴中冷却至 16 摄氏度。将神经元培养皿转移至 16 摄氏度的铝板上，冷却 5 分钟。吸去培养基，加入1 mL 16 °C的HBS，同时加入150 µM的2-Bo-Rine，孵育2分钟。随后将培养基移至带标签的废液容器中，并更换为1 mL 16 °C的HBS，同时加入2-Bo-Kerine和α-Bungalow毒素，在16 °C下用Alexa 594孵育15分钟。孵育结束后，将培养基转移至已标记的废液容器中，并用2毫升16摄氏度的HBS对培养皿清洗三次，用于后续受体胞吞作用的活细胞成像时间序列实验，实验使用底部为玻璃的3.5厘米培养皿。将培养皿转移至显微镜的加热载物台上，使用共聚焦显微镜或turf显微镜开始成像。准备用于固定盖玻片的实验步骤。将时间点为零的盖玻片转移至含有室温4%多聚甲醛、4%蔗糖的培养皿中，固定20分钟；对于其他时间点，用预平衡的37摄氏度培养基替换HBS，并将样品放回37摄氏度培养箱中进行内吞作用，在所需时间点取出培养皿，用两毫升室温的Dulbecco磷酸盐缓冲液（DPBS）快速洗涤两次。然后用 4% 多聚甲醛、4% 蔗糖固定样本 20 分钟。固定 20 分钟后，将 4% 多聚甲醛、4% 蔗糖移至废液容器中，并用两毫升室温 DPBS 洗涤培养皿两次。接着，将盖玻片在室温下孵育 10 分钟。使用含有 0.2% Triton X-100 的免疫荧光封闭液对神经元进行透化处理，以实现对细胞内受体池的抗 GFP 免疫染色，或对其他目标蛋白进行标记。随后去除含透化剂的封闭液，将盖玻片在不含 Triton X-100 的免疫荧光封闭液中孵育 20 至 30 分钟。在封闭条件下，于室温孵育数小时或 4°C 过夜，进行盖玻片的一抗孵育。将盖玻片浸入DPBS中，每次浸泡5分钟，共洗涤3次。随后在室温下用封闭液中的二抗孵育盖玻片1小时。之后再次用DPBS洗涤盖玻片3次，方法同前。接下来，用实验室纸巾擦去盖玻片背面多余的液体，然后将盖玻片倒置在载玻片上4 µL封片剂中，完成每个盖玻片的封片。使用60倍油镜（数值孔径1.49）在共聚焦显微镜下盲法采集图像，避免知晓实验分组条件。采用相同的图像采集参数，获取包含神经元胞体及数个树突过程的单个Z轴层面图像，针对每个神经元的3至4个近端树突中各20微米的区段，使用统一的分析阈值，定量分析α-bungarotoxin、Alexa荧光信号以及GFP免疫染色信号，以进行所有内吞作用数据的比较。每个时间点分析10至12个神经元的数据。通过多批独立的神经元培养重复实验。GABA能轴突在锥体神经元树突上形成抑制性突触连接。突触前抑制性终末通过囊泡抑制性氨基酸转运体进行识别，该转运体负责将GABA和甘氨酸装载至突触囊泡中。GABAa受体紧密地位于神经递质释放位点的对侧，该位点由突触后抑制性支架蛋白gein锚定。图中所示为表达α2-pHGFP-BPB-S的神经元，其表面GABAa受体用Alexa 594标记的bungeo毒素进行标记，随后使用抗GFP抗体对总受体群体进行免疫染色（绿色），并同时标记突触后抑制性支架蛋白gein或囊泡抑制性氨基酸转运体。此处展示了体外培养15天的海马神经元中含α2亚基的GABAA受体的内吞作用，使用α-bungarotoxin标记。如图中各面板所示，对单个树突过程进行的荧光测量，通过GFP抗体染色对构建体表达水平进行归一化处理。各时间点的最终比较通过归一化至T=0时的测量值实现。在60分钟内，受体内化程度的定量分析通过随时间变化的荧光信号改变来描述，最符合单指数模型。另一种方法是通过活细胞成像的时间序列共聚焦显微镜技术，在单个神经元中追踪受体的内吞过程。实验开始时可见P-H-G-F-P标记的GABA A受体与表面α-短毒素标记的受体呈现点状且重叠的荧光信号；随着时间推移，随着受体发生内吞，α-短毒素标记的GABA A受体信号逐渐减弱。由于新受体的插入，P-H-G-F-P 信号仍保持较高水平，而 P-H-G-F-P 信号的轻微下降则是由于细胞表面受体分布的变化以及光漂白所致。在完成该操作后，还可开展其他方法，例如使用铃木毒素插入实验，以回答不同处理条件下受体插入速率等进一步的问题。该技术使得研究者能够评估细胞活动、特定蛋白质结构域、激动剂以及其他调节因子如何影响活神经元、其他细胞及组织中受体的周转过程。观看本视频后，您应能够充分理解如何将α-鹅膏蕈碱偶联的Alexa染料与标准免疫荧光技术结合使用，以定量分析海马神经元中表面受体的定位情况。

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使用α-银环蛇毒素结合位点标记来研究GABA A受体膜定位和贩运

通过将膜受体的胞外结构域与超 ecliptic pHluorin...

成像小鼠原代培养神经元中pHluorin标记受体插入质膜的过程

本视频展示了一种通过抗体喂养的方法来研究原代海马神经元培养中谷氨酸受体的转运过程。该方法可同时观察细胞质膜和内膜系统上的受体群体。通过在细胞膜透化前后分别进行标记，使用相同的初级抗体但结合不同荧光染料的次级抗体，从而实现对这两类受体亚群的区分。...

一种用于研究海马神经元中谷氨酸受体转运的体外技术

我们在G蛋白偶联受体（GPCR）的不同特定位点处基因编码非天然氨基酸对叠氮-L-苯丙氨酸，并展示了叠氮基团在多种应用中的多功能性。这些应用包括一种靶向光交联技术，用于鉴定GPCR配体结合口袋中的残基，以及利用肽表位标签或荧光探针对GPCR进行位点特异性的生物正交修饰。...

基因编码的分子探针用于研究G蛋白偶联受体

采用一种编码C端带有GFP标签的TMEM184A的表达载体，用于真核表达，该载体被应用于相关实验，以验证TMEM184A在血管细胞中作为肝素受体的身份。...

使用GFP标记的TMEM184A构建体验证肝素受体身份

鸟苷三磷酸（GTP）结合是G蛋白偶联受体（GPCR）激活过程中最早发生的事件之一。本实验方案描述了如何通过检测放射性标记的GTP类似物[35S]鸟苷-5'-O-(3-硫代)三磷酸（[35S]GTPγS）在特定配体作用下的结合情况，来药理学表征特定的GPCR-配体相互作用。...

通过放射性标记GTP结合测量G蛋白偶联受体信号传导

本文介绍了从结合到生理学和药理学层面发现作用于GABAA受体的活性化合物的实验方案。...

调控γ-氨基丁酸A型受体神经传递的新型化合物发现方法

本实验方案的目标是促进对NMDA受体（NMDAR）的大规模研究，并允许检测小分子的调节作用及其治疗应用。...

一种高通量钙流检测法，用于研究对甘氨酸/D-丝氨酸和谷氨酸敏感的NMDA受体

神经元兴奋性可通过兴奋性离子型谷氨酸受体的内吞和外吐动态过程进行调节。本文介绍了一种简便且高通量的检测方法，用于定量分析受体在细胞表面和细胞内的分布情况。...

一种用于监测AMPA受体转运的高内涵检测方法

本文介绍了一种在分离的原代海马神经元培养物中研究谷氨酸受体（GluR）转运的方法。该方法结合使用抗体标记技术对内源性或过表达的受体进行标记，并联合药理学手段，通过调控受体的内吞或再循环过程，从而鉴定调节GluR表面表达的分子机制。...

一种通过抗体饲喂法研究分离原代海马神经元培养中谷氨酸受体转运的方法

GPCR与β-阻遏蛋白相互作用是GPCR药物发现领域的一个新兴方向。为了在活体系统中监测此类相互作用，亟需准确、精确且易于建立的方法。本文展示了一种结构互补检测法，可用于实时监测活细胞中GPCR与β-阻遏蛋白的相互作用，并且该方法可拓展应用于任何GPCR。...

实时监测活体系统中G蛋白偶联受体与β-阻遏蛋白1/2的相互作用以加速药物发现

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利用哺乳动物细胞中的定量成像技术定位质膜及细胞内神经元型烟碱乙酰胆碱受体

学习使用α-银环蛇毒素结合荧光Alexa染料标记海马神经元表面GABA_A受体，通过共聚焦显微镜分析受体内吞动态与膜定位变化。该方法为研究突触可塑性和抑制性神经传递机制提供可靠技术。

使用α-银环蛇毒素结合位点标签研究GABA A受体的膜定位与转运

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