单病毒原子力显微镜和超分辨率荧光成像的样品制备
January 2nd, 2014
通过超分辨率荧光成像或原子力显微镜 （AFM） 将病毒附着在表面上是单一病毒成像的要求。在这里，我们演示了一种样品制备方法，用于控制将病毒粘附到适合用于 AFM 和超分辨率荧光成像的玻璃表面。
该程序制备带有病毒的玻璃盖玻片，用于原子力显微镜和超分辨率显微镜，例如荧光光激活定位显微镜。首先，清洁玻璃基板，在玻璃上涂上一层接枝到聚 L 赖氨酸上的部分生物素化聚乙二醇薄膜。接下来，用 avadon 处理表面，以增加生物素化膜的结合亲和力。
现在用对目标病毒具有特异性的生物素化抗体处理表面。然后用感兴趣的病毒处理抗体制备的表面。与旋涂不同，这种技术的优点是沿表面均匀分布变体。
为了优化显微镜检查，将盖玻片垂直放入适当尺寸的 Teflon 盖玻片架中，并将其浸入装满过滤乙醇超声处理物的烧杯中 30 分钟。然后用超纯水彻底冲洗盖玻片。接下来，将盖玻片放入单独的干净特氟龙架和烧杯中，放入装有一摩尔氢氧化钠超声处理液的烧杯中 30 分钟，然后用超纯水充分冲洗。
现在在氮气流下擦干冲洗过的盖玻片，然后将它们转移到干净干燥的特氟龙架上。验证每个盖玻片上没有任何可见的薄膜或颗粒。在氮气流中水平干燥后，立即将一张盖玻片放入盖玻片移液管中心的无菌培养皿中，加入适量的生物素化聚赖氨酸接枝聚乙二醇的 PBS 溶液。
以夹心法将另一个干净的盖玻片放在液体上。确保两个盖玻片的活动面之间的体积完全充满流体。盖上培养皿，在室温下孵育 45 至 60 分钟。
接下来，用镊子夹起三明治，不要捏出多余的液体。现在用拇指和食指轻轻水平捏住三明治。沿相反方向滑动盖玻片并将它们分开，而不接触活动面。
用 25 毫升超纯水冲洗两个活跃的面部。现在用氮气流干燥盖玻片，并注意哪些盖玻片面在无菌培养皿中是活跃的。将处理过的盖玻片，活性面朝上移液，将适量解冻的证据溶液移液到活性面的中间。
将另一张活性面朝下的盖玻片放入液体夹层，然后在室温下孵育 25 至 30 分钟。接下来，如前所述，将两个盖玻片分开。确保不要触摸活动面。
现在用 25 毫升超纯水冲洗两个活性面，然后用氮气流擦干盖玻片。重要的是要记住哪些盖玻片面处于活动状态。为了将来参考，立即将 Avid 且经过处理的盖玻片活性面朝上放入无菌培养皿中，将适量解冻的生物素化抗体移液到活性面的中间。
以夹心法将另一个活性面朝下的盖玻片放在液体顶部。然后在室温下孵育 45 至 60 分钟将两个盖玻片分开后，用 25 毫升 PBS 冲洗两个活性面。然后将抗体处理的盖玻片，活性面朝上放入无菌培养皿中，并将适量的病毒移液到活性面的中间。
现在用第二个活性盖夹在中间，滑行，盖上，然后孵育。现在将两个盖玻片分开。用 25 毫升 PBS 冲洗两个活性面，然后将它们转移到装满 PBS 的特氟龙架和烧杯中。
立即使用制备的样品，或在 4 摄氏度下储存最多三天。这里。将水泡性口炎病毒的野生型变体锚定在玻璃表面并通过原子力显微镜进行分析。病毒粒子的宽度和长度为 80 纳米 x 180 纳米，与病毒粒子的原始大小相比，扭曲最小。
在本实验中，通过荧光光激活定位显微镜对单个病毒粒子进行成像。使用 Alexis 6 47 标记的 VSVG 抗体。蓝色等值面显示了使用 FOM 显微镜恢复的病毒粒子表面。
看完这个视频后，您应该对如何制备带有病毒的玻璃盖玻片有一个很好的了解，以便用于原子力显微镜或超分辨率显微镜。重要的是要始终记住盖玻片的哪个面上有活性化学物质。
概述
本文介绍了一种用于制备用于原子力显微镜（AFM）和超分辨率荧光成像的带病毒的玻璃盖片的方法。该技术确保了病毒粒子的可控粘附，从而促进了病毒结构的高分辨率成像。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物物理学
- 显微镜技术
背景
- 病毒粒子的附着对于AFM和超分辨率显微镜等成像技术至关重要。
- 可控粘附提高了成像结果的质量。
- 以前的方法可能无法提供病毒粒子的均匀分布。
- 本研究引入了一种新的样品制备方法。
研究目的
- 开发一种可靠的病毒粒子粘附到玻璃表面的方法。
- 提高AFM和超分辨率显微镜的成像质量。
- 使用水疱性口腔炎病毒证明该方法的有效性。
使用的方法
- 用生物素化聚乙二醇清洁和涂覆玻璃盖片。
- 用亲和素和针对病毒特异的生物素化抗体处理表面。
- 将盖片夹在一起以促进均匀的液体分布。
- 使用超声波处理和冲洗技术确保清洁。
主要结果
- 病毒粒子成功地锚定在玻璃表面以进行成像。
- 单个病毒粒子可以使用荧光显微镜进行成像，且失真最小。
- 该方法展示了病毒粒子在表面上的有效分布。
- 结果证实了该制备方法对于高分辨率成像的可行性。
结论
- 开发的方法为病毒粒子粘附提供了可靠的方法。
- 该技术提高了显微镜应用中的成像质量。
- 未来的研究可以在此方法的基础上进行各种病毒成像应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables controlled, homogeneous virion adhesion to glass surfaces, supporting high-resolution imaging for mechanistic studies of viral structure and host interactions. By ensuring reproducible sample preparation, it reduces variability in downstream biophysical assays, improving data reliability for target validation and lead optimization efforts. The technique is applicable to enveloped viruses relevant to antiviral discovery programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct visualization of virion morphology and surface protein distribution to inform target accessibility and epitope exposure.
- Operational Value: Provides a standardized platform for comparing wild-type and mutant virions under identical imaging conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Facilitates quantitative assessment of antibody or ligand binding to immobilized virions via fluorescence readouts.
- Operational Value: Supports assay uniformity by minimizing virion clustering and orientation bias across the imaging surface.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Allows correlation of structural changes in virions with functional phenotypes such as infectivity or neutralization resistance.
- Operational Value: Enables longitudinal tracking of viral variants in preclinical models using consistent sample preparation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where structural and biophysical characterization informs target selection and lead compound screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing regarding viral entry mechanisms and antibody-mediated neutralization through direct imaging.
- Screening: Enables reproducible preparation of virion samples for high-content imaging-based screening campaigns.
- Analytics: Generates quantitative morphometric data (e.g., virion dimensions) and fluorescence intensity measurements for comparative analysis.
- Translational Research: Connects in vitro virion behavior to preclinical efficacy by preserving native structural features during imaging.
- Enterprise Reuse: Represents a adaptable surface chemistry platform applicable to multiple viral targets across discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves predictive confidence in structural biology assays by minimizing preparation-induced artifacts.
- Operational Value: Enhances reproducibility across laboratories and imaging modalities through standardized surface functionalization.
- Strategic Value: Reduces failed imaging runs due to poor virion adhesion, conserving instrument time and sample resources.
- Portfolio Impact: Enables faster go/no-go decisions in antiviral projects by providing early structural liability assessment.
Implementation Considerations
- Requires expertise in surface chemistry and fluorescence microscopy techniques.
- Depends on access to AFM and super-resolution imaging infrastructure.
- Necessitates strict adherence to active face orientation during multi-step assembly.
- Adaptation to non-enveloped viruses may require modification of anchoring chemistry.
- Storage limitations (up to 3 days at 4°C) necessitate same-week experimental planning.
