单病毒颗粒原子力显微镜与超分辨率荧光成像的样品制备

该实验步骤用于制备载有病毒的玻璃盖玻片，适用于原子力显微镜和超分辨率显微镜观察，例如荧光光激活定位显微镜。首先，清洁玻璃基底，并在玻璃表面涂覆一层部分生物素化的聚乙二醇，该聚乙二醇接枝于聚-L-赖氨酸上形成薄膜。接着，用avidin处理表面，以增强生物素化薄膜的结合亲和力。

现在用针对目标病毒的生物素化抗体处理表面。然后用目标病毒处理已制备好抗体的表面。与旋涂法不同，该技术的优势在于能够将病毒变异体均匀地分布在表面。

为了优化显微观察，将盖玻片垂直放入适当尺寸的聚四氟乙烯（Teflon）盖玻片架中，并浸入装有滤过乙醇并进行超声处理的烧杯中，超声30分钟。随后用超纯水彻底冲洗盖玻片。接着将盖玻片转移至另一个洁净的聚四氟乙烯架中，放入盛有一摩尔氢氧化钠并进行超声处理的烧杯中，超声30分钟，再用超纯水彻底冲洗。

现在用氮气流吹干已冲洗的盖玻片，并将其转移至洁净干燥的聚四氟乙烯架中。检查每片盖玻片是否无任何可见薄膜或颗粒污染。在水平方向用氮气流吹干后立即进行操作：将一片盖玻片放入无菌培养皿中，并在盖玻片中心处用移液器加入适量溶于磷酸盐缓冲液（PBS）中的生物素化聚赖氨酸接枝聚乙二醇溶液。

采用三明治法，将另一片干净的盖玻片置于液体上方。确保两片盖玻片活性表面之间的空间完全充满液体。盖上培养皿，于室温孵育45至60分钟。

接下来，用镊子夹起三明治结构，注意不要挤压出多余的液体。然后用拇指和食指轻轻水平夹住该结构，将盖玻片向相反方向滑动，分离盖玻片时避免触碰其活性表面。

用25毫升超纯水冲洗两个活性表面。现在用氮气流吹干盖玻片，并将具有活性的盖玻片表面朝向记录后放入无菌培养皿中。取一张处理过的盖玻片，将活性面朝上放置，用移液器吸取适量解冻的样本溶液，滴加到活性面中央。

将另一张盖玻片有活性的一面朝下覆盖，夹住液体，然后在室温下孵育25至30分钟。接着，按照之前所示方法将两张盖玻片分开，注意不要触碰有活性的表面。

现在用25毫升超纯水冲洗两个活性表面，然后用氮气流吹干盖玻片。务必记住哪些盖玻片表面为活性面。为便于后续操作，立即将带有活性面的链霉亲和素修饰盖玻片正面朝上放入无菌培养皿中，并用移液器将适量解冻的生物素化抗体滴加到活性面中央。

采用三明治法，将另一张活性面朝下的盖玻片置于液体上方。然后在室温下孵育45至60分钟。分离两张盖玻片后，用25毫升PBS冲洗两个活性面。随后，将经抗体处理、活性面朝上的盖玻片放入无菌培养皿中，并用移液器将适量病毒滴加到活性面中央。

现在用第二个活性盖玻片进行夹心，插入盖玻片，覆盖并孵育。随后将两个盖玻片分开，用25 mL PBS冲洗两个活性表面，并将其转移至盛有PBS的聚四氟乙烯架和烧杯中。

立即使用制备好的样品，或在4°C下保存最多三天。此处，将野毒株型水疱性口炎病毒锚定在玻璃表面，并通过原子力显微镜进行分析。病毒颗粒的宽度和长度分别为80纳米和180纳米，与病毒颗粒的原始尺寸相比几乎无变形。

在本实验中，使用荧光光激活定位显微镜对单个病毒颗粒进行成像。采用Alexis 647标记的VSVG抗体。蓝色等值面表示通过FOM显微镜重建的病毒颗粒表面。

观看本视频后，您应能充分了解如何制备用于原子力显微镜或超分辨率显微镜观察的载玻片病毒样本。请务必始终牢记载玻片哪一面具有活性化学涂层。