促进微生物在造纸厂废液流中生长的方法及培养微生物降解潜力的表征

以下实验的总体目标是确定一种微生物或多种微生物组成的群落利用制浆废液黑液进行生长的能力、微生物生长所利用的黑液成分，以及微生物代谢该制浆废液所产生的代谢产物。该目标通过收集制浆废液黑液并将其制备为培养基组分来实现。第二步是提取木质纤维素组分，用于确定微生物对碳源的需求。

接下来制备培养基，接种微生物并分析其生长情况，以确定微生物在黑液及其组分上生长的能力。结果表明，该环境分离的微生物能够利用黑液作为唯一碳源进行生长并合成代谢产物，这一结论基于其在最低培养基琼脂平板上的生长情况观察以及气相色谱-质谱（GCMS）分析得出。我们最初产生该方法的想法，是在讨论微生物是否可能在制浆废料上生长时提出的，并认为或许能够直接从造纸厂中分离出这类微生物。

与当前现有的方法（如氢氧化钠漂白法）相比，zignal 纤维素提取技术的主要优势在于氯化钠漂白能够提供更高且更优的纯度。该方法的可视化演示至关重要，因为纤维素的制备以及气相色谱-质谱（GCMS）样品前处理步骤较难掌握，这不仅由于所需步骤较多，还因为需要通过视觉判断来确认工艺是否完成。

该方法不仅能为微生物降解黑液提供研究依据，还可应用于含有木质纤维素材料的工业废液，例如农作物残渣、森林残渣和城市固体废弃物。开始该实验时，从制浆蒸煮器连接的出口阀处用无菌玻璃瓶采集黑液样品，并使其冷却至室温后再进行下一步操作。然后将100毫升黑液样品加入装有搅拌子的500毫升烧杯中，并以中等速度搅拌样品。

逐滴加入磷酸，中和黑液，直至其变得黏稠。随后将全部黑液溶液分装至50毫升锥形管中，在9,300 G下离心30分钟。为分离碳水化合物，将5克粒径为1毫米或更小的磨碎柳枝稷和一根搅拌子放入500毫升的烧瓶中。

然后向烧瓶中加入 200 毫升蒸馏水、7.5 克亚氯酸钠和 2.5 毫升冰醋酸。将烧瓶置于搅拌加热仪上的油浴中，于 80 摄氏度反应 1 小时。随后再向烧瓶中加入额外的 7.5 克氯化钠和 2.5 毫升冰醋酸。

重复上一步骤两次后，在80摄氏度下继续搅拌30分钟。让溶液冷却至室温，然后在减压条件下通过布氏漏斗过滤，以分离出固体物质。

用100毫升蒸馏水洗涤固体材料三次。然后，取一克固体材料置于一张洁净的滤纸上，于50摄氏度下放置过夜干燥。

次日从烘箱中取出样品后，将其转移至标记为“空心细胞”的储存小瓶中。将剩余的固体材料加入一个含有250毫升10%氢氧化钠的500毫升烧瓶中，并用塞子密封烧瓶。将溶液置于70摄氏度的摇床培养箱中，以250转/分钟的转速振荡孵育1小时。

随后，将溶液冷却至室温。30分钟后，使用布氏漏斗通过减压过滤分离出固体物质。将固体残留物在50摄氏度的烘箱中干燥过夜后，放入标记为纤维素的储存瓶中。将滤液转移至500毫升的烧瓶中，加入30毫升乙酸和250毫升异丙醇，盖紧瓶盖，并将所得溶液在室温下静置于实验台至少8小时。

完成后，将全部溶液转移至50毫升离心管中，在9,300 ×g条件下离心30分钟。离心结束后，小心用移液器吸出管中的溶液并弃去。接着，用30毫升蒸馏水重悬沉淀，涡旋混匀后再次在9,300 ×g条件下离心30分钟。

重复此步骤15次，以彻底清洗沉淀物。离心后，去除上清液，分离沉淀物用于冷冻干燥。样品冷冻干燥后，将其放入标记为半纤维素的小瓶中。

为分离木质素，将五克粒径为一毫米或更小的粉碎柳枝稷加入到500毫升含0.25摩尔氢氧化钠和30%乙醇的溶液中。将混合物置于75摄氏度的摇床中，以250转/分钟振荡反应两小时。过滤冷却后的溶液后，向烧瓶中加入搅拌子，并将其放置在调至中等转速的搅拌台上。

逐滴向滤液中加入浓盐酸，直至 pH 达到 2。在室温下静置过夜。将溶液转移至 50 毫升锥形管后，在 9,300 ×g 条件下离心 30 分钟。

完成后，小心地用移液器将溶液从锥形管中吸出并弃去。用30毫升蒸馏水重悬沉淀，涡旋混匀后在9,300 ×g 下离心30分钟。重复此步骤15次，以彻底清洗沉淀。

离心后，弃去上清液，收集沉淀用于冻干。冻干完成后，将样品放入标记为木质素的小瓶中。向无菌的125毫升锥形瓶中加入50毫升无菌M9最小培养基。

然后向培养基中加入体积分数为10%的黑液。接种时，向混合物中加入体积分数为0.1%的过夜细菌培养物，在37°C、200 rpm振荡条件下于培养箱中培养。在对数中期，将未接种和已接种的细菌培养物离心后，用注射器将细菌转移至密封的无菌厌氧血清瓶中。

培养450小时后，将每种上清液各10毫升加入不同的玻璃试管中。用浓盐酸逐滴酸化每种上清液，调节pH至1至2。对于每个样品，向上清液中加入30毫升乙酸乙酯。

盖上试管盖后，通过倒置试管4到6次来混匀溶液。然后在一支干净的玻璃试管中加入1至2克无水硫酸钠。使用一次性玻璃巴斯德吸管小心吸取上层有机相。

将有机层放入含有无水硫酸钠的试管中。通过轻轻敲击试管以逐渐混合，利用无水硫酸钠对有机层进行脱水。分次加入少量无水硫酸钠并混合，直至无明显大块结团出现。

随后，在减压条件下通过布氏漏斗过滤溶液，然后将滤液转移至蒸发瓶中，使用旋转蒸发仪蒸发滤液。完成后，取三毫克乙酸乙酯萃取残留物，置于一个两毫升棕色色谱小瓶中。用100微升1,4-二氧六环和10微升吡啶溶解残留物。

然后向小瓶中加入50 µL含有1%三甲基氯的B-S-T-F-A溶液。将溶液置于60 °C的振荡培养箱中孵育15分钟。通过气相色谱-质谱联用仪（GCMS）分析样品。

收集并处理手工制浆过程中产生的黑液，可用于评估单一细菌分离株或混合菌群对这种制浆废液的生物降解能力。图中显示的是通过光密度测定的环境菌株在LB培养基以及添加了10%中和黑液的LB培养基中的好氧生长情况。这些结果表明，该细菌能够在黑液存在条件下生长。

该环境分离菌株在LB培养基中的生长速度比在含有废液的培养基中更快，但在培养62小时后，其光密度开始下降；而在含有废液的培养基中，该微生物环境分离株的光密度持续增加，直至培养230小时后才开始下降。该微生物环境分离株在含有废液条件下的生长曲线呈现出双相生长模式，表明废液中含有多种可被该菌利用的碳源，且该细菌在营养利用上表现出优先选择性。

需要进一步的实验来确定其利用黑液满足生长需求的能力。还可以测定细菌在未中和的黑液上的生长情况，或测定黑液浓度增加对生长的影响。在证明细菌能够在黑液上生长后，可通过最小培养基生长实验来确定其对碳源的利用能力。

构成木质纤维素的商业底物可作为最小培养基中的碳源。此处提供的木质纤维素提取方案为确定图中所示细菌的生长需求提供了模型。图中显示了环境微生物分离株在M9最小培养基琼脂上生长的情况，该培养基分别添加了木质纤维素提取物的各个组分。

在最低培养基琼脂平板上出现的菌落表明环境分离株具有降解全纤维素、纤维素、半纤维素以及 M9 培养基上存在的木质素的能力。最低培养基上出现菌落也可能提示该环境分离株具有降解琼脂的能力，而非降解培养基组分。此外，可通过液体培养物的最低培养基生长曲线来测定环境分离株在每种木质纤维素组分上的特异性生长速率，从而避免添加可能作为碳源的琼脂。

通过气相色谱-质谱法（GCMS）分析提取并衍生化的细菌培养物，可揭示其产生的代谢产物。图中显示的是未接种样品中TMS衍生物的GCMS谱图，以及环境微生物分离株在厌氧条件下于M九种最小培养基（含10%未中和黑液）中生长时所产生的TMS衍生物的谱图。比较两张谱图可发现培养基中组分的差异，提示存在发酵产物及黑液组分的降解。

在接种样品中出现了一个保留时间为39.34分钟的峰。在接种样品中，一个保留时间为21.84分钟的峰增大。在接种样品中，一个保留时间为25.79分钟的峰减小。

此处所示为牛油果标准品的谱图，用于鉴定保留时间为25.79分钟的峰。观看本视频后，您应能充分理解如何判断一种微生物或微生物群落是否能够降解黑液。此外，通过遵循本方案，您还可采用其他方法（如生长曲线）进一步探究微生物在不同浓度黑液或木质纤维素提取物组分中的生长速率等相关问题。