方法对纸浆厂污水流和培养微生物的生物降解能力的表征促进微生物生长

以下实验的总体目标是确定微生物或微生物群落利用制浆废料黑液促进生长、用于生长的黑液成分以及这种制浆废料的微生物代谢产生的产物的能力。这是通过收集制浆废液黑液并准备用作培养基成分来实现的。作为第二步，提取木质纤维素成分，用于确定微生物的碳源需求。

接下来，制备、接种并分析培养基的微生物生长情况，以确定微生物在黑液及其成分上生长的能力。结果表明，微生物环境分离物利用黑液作为代谢产物生长和合成的唯一碳源，基于其在最小培养基琼脂平板上可视化的生长，以及 GCMS。当我们讨论微生物能够在纸浆废料上生长的可能性，并且我们可能能够直接从纸浆厂分离这些微生物时，我们第一次想到了这种方法。

与当今现有的方法（如氢氧化钠漂白）相比，锌锆锆萃取技术的主要优点是氯化钠漂白可提供高纯度和更高的纯度。这种方法的视觉演示至关重要。由于 Theo 纤维素和 GCMS 样品制备步骤难以学习，这是因为所需的步骤数量以及验证过程完成情况所需的目视测定。

该方法不仅可以深入了解黑液的微生物降解，还可以应用于含有 Magno 纤维素材料的工业废物流，例如农作物残留物、森林残留物和城市固体废物。要开始此过程，请从连接到工艺消化器的出口阀和无菌玻璃瓶中收集黑液样品，并使其冷却至室温，然后再进行下一步。然后将 100 毫升黑液样品加入装有搅拌棒的 500 毫升烧杯中，并以中速搅拌样品。

滴加磷酸至变粘稠，中和黑液。然后将所有黑液溶液分装到 50 mL 锥形管中，并以 9， 300 Gs 离心样品 30 分钟。要分离碳水化合物，将 5 克 1 毫米或更小的碾碎柳枝稷和搅拌棒放入 500 毫升烧瓶中。

然后加入 200 毫升蒸馏水、7.5 克亚氯酸钠和 2.5 毫升冰醋酸。将烧瓶放入 80 摄氏度搅拌板顶部的油浴中 1 小时。然后在烧瓶中再加入 7.5 克氯化钠和 2.5 毫升冰醋酸。

重复上一步两次后，继续在 80 摄氏度下搅拌 30 分钟。让溶液冷却至室温。然后在真空下通过 buchner 漏斗过滤以分离固体材料。

用 100 毫升蒸馏水清洗固体材料 3 次。接下来，收集一克固体材料并将其放在一张干净的滤纸上。将固体置于 50 摄氏度下晾干过夜。

第二天从烘箱中取出样品后，将其转移到标有 hollow cell 的储存瓶中。将剩余的固体材料加入含有 250 毫升 10% 氢氧化钠的 500 毫升烧瓶中，并用塞子盖住烧瓶。将溶液置于 70 摄氏度的培养箱中 1 小时，并以 250 RPM 摇动。

然后，让溶液冷却至室温 30 分钟后，使用布赫纳漏斗通过真空过滤分离固体材料。固体残留物在 50 摄氏度的烘箱中干燥过夜后，将其放入标有纤维素的储存瓶中。将滤液转移至 500 mL烧瓶中，加入 30 mL乙酸和 250 mL异丙醇帽，将所得溶液在台式上室温下放置至少 8 小时。

完成后，将所有溶液转移到 50 mL 锥形管中，并以 9， 300 Gs 离心样品 30 分钟。离心后，小心地将溶液从锥形管中移出并丢弃。接下来，用 30 毫升蒸馏水涡旋洗涤沉淀，并以 9， 300 Gs 离心 30 分钟。

重复此步骤 15 次以彻底清洗沉淀。离心后，去除上清液以分离沉淀以进行冷冻干燥。样品冻干后，将其放入标有半纤维素的小瓶中。

对于木质素分离，将 5 克 1 毫米或更小的碾碎柳枝稷加入 500 毫升的 25 摩尔氢氧化钠和 30% 乙醇溶液中。将浆液放入 75 摄氏度的培养箱中，以 250 RPM 摇动 2 小时。过滤冷却溶液后，向烧瓶中加入搅拌棒，并将其放在调节为中速的搅拌板顶部。

浓盐酸滴加到滤液中，直到 pH 值为 2。让溶液在室温下静置过夜。将溶液转移至 50 mL 锥形管中后，将样品以 9， 300 GS 离心 30 分钟。

完成后，小心地将溶液从锥形管中移出并丢弃。用 30 毫升蒸馏水涡旋洗涤沉淀，并以 9， 300 Gs 离心 30 分钟。重复此步骤 15 次以彻底清洗沉淀。

离心后，取出仰卧位纳脱剂以分离沉淀物进行冷冻干燥。冻干后，将样品放入标有木质素的小瓶中。将 50 mL 无菌 M 9 基本培养基加入无菌 125 mL 培养瓶中。

然后将 10% 体积的黑液加入培养基中。对于接种，向混合物中加入 0.1% 体积的过夜细菌培养物，在 37 摄氏度的培养箱中以 200 RPM 振荡孵育培养物。在对数中期，离心 UN 接种和接种的细菌培养物后，使用注射器将细菌转移到密封的无菌厌氧血清瓶中。

生长 450 小时后，将每种上清液 10 毫升加入单独的玻璃试管中。用滴加至 pH 值 1 至 2 的浓盐酸酸化每个上清液。对于每个样品，向 supra natant 中加入 30 毫升乙酸乙酯。

加盖试管后，通过倒置试管 4 到 6 次来混合溶液。然后将 1 至 2 克无水硫酸钠放入干净的玻璃试管中。用一次性玻璃牧场移液器移液小心地收集顶部有机层。

将有机层放入含有无水硫酸钠的试管中。通过轻轻敲击试管以逐渐混合，使无水硫酸钠上的有机层脱水。加入少量无水硫酸钠，混合至无大团块。

然后，在真空下通过 buchner 漏斗过滤溶液，然后将溶液转移到蒸发瓶中，并使用旋转蒸发器蒸发滤液。完成后，将 3 毫克乙酸乙酯提取残留物放入 2 毫升琥珀色色谱样品瓶中。用 100 微升 1 4 二恶烷和 10 微升吡啶溶解残留物。

然后向小瓶中加入 50 微升含 1% 三甲氯的 B-S-T-F-A 溶液。将溶液放入 60 摄氏度的培养箱中，摇动 15 分钟。通过 GCMS 分析样品。

收集和改性工艺制浆过程中产生的黑液将一，利用这些制浆废料来确定单个细菌分离物或混合培养物的生物降解能力。这里显示的是通过在 LB 培养基和补充有 10% 中和黑液的 LB 培养基中培养的环境菌株的光密度测量的有氧生长。这些结果表明，这种细菌在黑液存在下生长。

LB 培养基中环境分离物的生长速度比在黑液存在下生长时快，但光密度在 62 小时后开始降低。而微生物环境分离物在黑液存在下的生长光密度继续增加，直到生长 230 小时后。在黑液存在下，微生物环境分离物的生长曲线也描绘了双相生长，这表明黑液包含多个可供微生物环境分离物使用的碳源，并且细菌表现出对营养利用的偏好。

需要进一步的实验来确定其利用黑液满足生长需求的能力。还可以确定细菌在未中和的黑液上的生长，或确定黑液浓度增加对生长的影响。在证明黑液生长后，可以使用最小介质生长实验来确定碳源利用率。

构成木质纤维素成分的商业基材可用作最小介质中的碳源。此处介绍的木质素纤维素提取方案提供了一个模型，用于确定图中细菌的生长需求，这是环境微生物分离物在 M nine 上的生长。补充有木质纤维素提取的每种成分的最小培养基琼脂。

最小培养基琼脂平板上存在菌落表明环境分离物能够降解 M nine 上存在的全纤维素、纤维素、半纤维素和木质素菌落。最少的培养基可能表明环境分离物能够降解琼脂而不是平板。液体培养物的最小培养基生长曲线也可用于确定每个木质纤维素组分的特定生长速率，因此不必添加琼脂，这可能是潜在的碳源。

通过 GCMS 对提取和衍生的眼睛、细菌培养物进行分析，揭示了产生的代谢产物。此处显示的是未接种样品中存在的 TMS 衍生物的 GCMS 光谱、环境微生物分离物在厌氧生长时产生的 TMS 衍生物光谱以及含有 10% 未中和黑液的 M 9 最低培养基。两种光谱的比较揭示了培养基中存在的成分的差异，表明存在发酵产物和黑液成分的降解。

接种样品中出现保留时间为 39.34 min 的峰。在接种样品中，保留时间为 21 点 84 分钟的峰增加。接种样品中保留时间为 25.79 的峰降低。

此处显示的谱图是瓜克标准品的谱图，用于鉴定保留时间为 25.79 min 的峰。观看此视频后，您应该对如何确定微生物或微生物群是否可以降解黑液有很好的了解。此外，按照此方案，您可以使用其他方法（例如生长曲线）来回答有关微生物或微生物在各种浓度的黑液或葡子纤维素提取物成分上的生长速率的其他问题。