Name: 组织化学染色拟南芥次生壁元素 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-13T23:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: 学习组织化学染色技术用于拟南芥次生壁元素的可视化分析。该方法通过包埋、切片和多种染色程序，帮助研究人员在细胞水平上区分木质素、纤维素等细胞壁成分。

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感谢 Sabin Russell 提供的编辑协助。本工作是美国能源部联合生物能源研究所（http://www.jbei.org）项目的一部分，由美国能源部科学办公室、生物与环境研究办公室通过劳伦斯伯克利国家实验室与美国能源部之间的合同 DE-AC02-05CH11231 资助支持。

1. 茎部包埋
<ol>
	<li>制备7%的琼脂糖水溶液（7 g电泳级琼脂ose溶于100 ml蒸馏水中）。通过高压灭菌20分钟或在最低功率下微波加热20分钟以溶解琼脂糖。例如，1,250 瓦功率的 10% 强度&#160;微波炉）。</li>
	<li>使用塑料离心管制备用于包埋茎段的自制模具。
	<ol>
		<li>使用剃须刀片切下2 ml螺口离心管（A部分）的圆锥形底部。用注射器针头在管盖上穿刺一个孔，孔径略大于待包埋茎段的直径。接着，从0.6 ml离心管底部切下0.5 cm（B部分）。</li>
		<li>将0.6 ml微量离心管预先切去0.5 cm的管段插入已切开的2 ml微量离心管中。用Parafilm密封两部分连接处。图1）。注意：需将管底剪掉，以便在琼脂糖凝固后取出包埋的样品。管盖上的孔有助于在将茎部包埋于琼脂糖中时固定茎部。模具用于承载琼脂糖，并在包埋过程中保持茎部直立。Parafilm 将用于固定 A 和 B 两部分，直至琼脂糖凝固且茎部完成包埋。</li>
		<li>使用剃须刀片从目标区域切取一段茎组织，（例如 第一茎节间中段）。注意：理想情况下，应在包埋前立即切割茎组织，以避免因脱水造成损伤。 alternatively，可将茎暂时存放于含有经水浸湿的滤纸的培养皿中，并将培养皿置于冰上，直至准备包埋，以防止组织脱水和变形。若在无高湿度条件下存放超过30分钟，茎组织将会干燥。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在微波炉中以低功率融化琼脂糖。注意：盛有琼脂糖的瓶子可能很烫，取用时应佩戴手套。将融化的琼脂糖在室温（20 °C 至 25 °C）下静置，冷却至约 50 °C。</li>
	<li>缓慢将5 ml琼脂糖移液至预制的塑料模具中，以填满小瓶。注意：确保模具中无气泡。气泡会导致琼脂糖模具出现空隙，无法完全覆盖茎段样品，最终导致样品切片不均匀。
	<ol>
		<li>让琼脂糖冷却30至60秒，直至呈半固态。用一根小牙签测试，确保牙签能够刺入并在琼脂糖中直立不倒，但不会漂浮。注意：若琼脂糖仍过热时即放入茎段，会导致茎部皱缩，破坏样本，损毁细胞形态。</li>
		<li>将茎放入此装有琼脂糖的小瓶中。确保茎保持笔直。将带孔的瓶盖放置妥当，使茎的顶端被瓶盖固定。切勿拧紧螺旋瓶盖。有时可在同一小瓶中包埋多个同类型的茎；但在此情况下，请勿使用瓶盖。注意：若拧动螺旋瓶盖，会导致茎扭曲。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将小瓶置于室温或4 °C条件下10-30分钟，直至凝固。</li>
	<li>轻轻将模具从管中滑出以取出模具。打开封口膜。用拇指轻推模具B部分的底部，使凝固的琼脂糖从A部分脱开并释放到载玻片上。</li>
	<li>将包埋在琼脂糖中的茎切成三段，每段长约1.2 cm。切除未包埋在琼脂糖中的茎段部分并弃去。
	<ol>
		<li>将含有茎段的琼脂糖块置于避光盒中的密封2 ml微量离心管内，于4 °C保存，直至准备切片。或者，可将离心管在4 °C下最多保存一周。注意：虽然可以保存，但实验人员需注意嵌入的茎段仍具有活性，根据具体实验情况，可能会引入潜在的人为假象。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 茎切片
<ol>
	<li>警告：请仔细阅读振动切片机使用手册，并严格遵守所有安全操作规程。</li>
	<li>确保样品盘清洁且完全干燥（无任何固体或液体残留）。使用刀片刮除样品盘上先前实验残留的胶水，并用水清洗，然后用纸巾擦干。注意：此步骤可确保粘合剂有效附着于琼脂糖样品。若此步骤操作不当，可能导致样品无法牢固粘附于样品盘，在切片过程中脱落。
	<ol>
		<li>使用软纸巾擦去含有样品的琼脂糖块表面的水分。</li>
		<li>在样品盘上滴加少量组织粘合剂，用粘合剂瓶的瓶尖将粘合剂涂抹至盘中央区域。迅速将琼脂糖块放置于盘上，使样品方向与盘面垂直或平行，分别用于获取横切面或纵切面。在室温或4 °C条件下静置10–30分钟，使粘合剂充分固定样品。注意：此步骤需在规定时间内完成。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将样品盘固定于缓冲槽或缓冲托盘中。琼脂糖块应与刀片保持平行。向缓冲槽中加入室温蒸馏水，直至样品完全浸没。</li>
	<li>将刀片剪成两半，再用坚固的剪刀修剪两端，确保刀片保持完全平整。将其中一半预切割的刀片安装至刀架上。
	<ol>
		<li>将刀架角度设置为84°，切片速度设为0.90 mm/sec（振动切片机位置8），频率设为50 Hz（振动切片机位置5），切片厚度为100 µm。使用连续切片模式。注意：选择此厚度是为了确保组织能够耐受某些染色方案中使用的酸性和碱性处理。设定切片区间后，以连续模式运行振动切片机15–20分钟，可完成一个约1.2 cm的琼脂糖块的切片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在切片过程中，使用一次性塑料移液器从缓冲槽中收集切片。或者，可先将切片转移至玻璃烧杯，再转移至透明培养皿中。将少量切片转移至2.0 ml 微量离心管中。注意：切片通常从培养皿中收集，因其透明背景便于观察；同时可使缓冲槽为下一个样品的切片做好准备。</li>
	<li>切片可暂时存放于50 ml 离心管中，或收集后置于1.5 至2 ml 微量离心管中，在4 °C条件下保存30至60分钟。注意：长时间存放将导致图像质量下降。</li>
</ol>
3. 成像用显微镜和相机设置
<ol>
	<li>调整显微镜的科勒照明。选择一个物镜。首先聚焦样本。将光强调至一半或更低。关闭视场光阑（FD）和孔径光阑（AP），或将其调节至该物镜允许的最低设置。
	<ol>
		<li>放大倍数越高，环的尺寸越大。使用聚光镜调焦旋钮，将视场光阑的图像尽可能清晰地聚焦。</li>
		<li>使用聚光镜居中调节钮（围绕聚光镜周围的针状螺钉），缓慢将视场光阑（呈六边形的小环）移至视野中心。缓慢增大视场光阑（FD），使光阑图像刚好到达视野边缘。当视场光阑刚越过边缘时，立即停止增大FD。</li>
		<li>缓慢增加孔径光阑（AP）以调节对比度。根据需要调整光照强度。注意：每次更换物镜或每次实验日均需重新调整科勒照明。记录当日调整后得到的数值，这些数值在当天反复切换物镜时可重复使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照表1中所述调整孔径、光强、曝光时间、增益和滤光片。此信息仅作为参考。</li>
	<li>使用配备大尺寸面阵CCD芯片且无机械快门的高分辨率数字相机采集荧光图像；使用高分辨率、高速相机采集明场图像。</li>
	<li>使用标准软件处理载玻片图像。启动软件，点击“采集”和“设置相机/板卡”，然后选择要使用的相机，点击“确定”。点击“采集”，然后点击“颜色”选项卡。在“颜色”选项卡下，选择“拜耳法”，然后选择“四点平均”。根据表1建议设置增益值（红、绿、蓝）。选择“设置保存”选项卡，并点击图像存储目录。根据表1的建议设置“曝光时间”。将“像素合并”（Binning）设为“1”，“实时合并”（Live binning）设为“1”。聚焦目标区域后，点击“保存实时图像”。</li>
	<li>相机软件输出的图像格式为“TIF”。对细胞类型的组织化学图像进行分析。使用标准计算机软件进行后续的展示和发表用途。</li>
</ol>
4. 紫外光与明场成像
<ol>
	<li>使用1 ml移液器，并将移液器吸头剪去一端，以便于移取组织切片。轻柔地将切片吸入吸头并转移至显微镜载玻片上。用盖玻片覆盖切片。在紫外光或明场照明下观察切片。</li>
</ol>
5. 间苯三酚-盐酸（Wiesner）染色12
<ol>
	<li>将 0.3 g 间苯三酚溶解于 10 ml 无水乙醇中，配制 3% 间苯三酚溶液。取一份体积的浓盐酸（37 N）与两份体积的 3% 乙醇间苯三酚溶液混合，所得溶液即为间苯三酚-盐酸（Ph-HCl）或维斯纳染液。注意：该溶液需在染色当天新鲜配制，不可储存，因溶液会随时间降解而导致染色效果失效。警告：盐酸具有强腐蚀性，操作 Ph-HCl 染液时务必格外小心。</li>
	<li>将茎段转移至 2.0 ml 微离心管中。向装有茎段的管中加入 1 ml Ph-HCl 溶液，并立即盖紧管盖，因为 Ph-HCl 染液中的盐酸具有强腐蚀性。轻轻晃动管子，确保所有茎段均被染色。此步骤的替代方法是保持管盖打开，以便用移液枪反复吹打 Ph-HCl 溶液，最好不扰动茎段。注意：操作时需小心，避免将茎段吸入移液枪吸头内，否则可能损伤这些茎段。
	<ol>
		<li>使用 1 ml 移液枪，并将移液枪吸头末端剪去一部分，使茎段能够无损地被移取。轻柔地将茎段吸入吸头并转移至显微镜载玻片上，盖上盖玻片。在明场照明下观察茎段。注意：Ph-HCl 溶液在 5–10 分钟内会干燥，导致样本质量下降。因此，成像必须在此时间段内完成。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 口腔染色13,14
<ol>
	<li>将0.2 g高锰酸钾溶解于40 ml蒸馏水中，配制0.5%高锰酸钾溶液。置于室温下避光瓶中保存，最多保存7&#160;天。
	<ol>
		<li>通过将1 ml浓盐酸（37 N）加入9 ml蒸馏&#160;水中（1:10）配制3.7% HCl溶液。实验当天新鲜配制3.7% HCl溶液。确保所用37 N HCl储备液不过期。浓氨水溶液（14.8 M）应于4 °C保存，以防止饱和溶液的摩尔浓度下降。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将茎段转移至2.0 ml微量离心管中。向含有茎段的管中加入1 ml 0.5%高锰酸钾溶液。
	<ol>
		<li>用移液器轻轻吹打0.5%高锰酸钾溶液上下混合，最好避免扰动茎段。孵育2 min后重复吹打操作。让微量离心管静置，直至所有茎段沉降到底部。注意：小心不要将茎段吸入移液器吸头中，以免造成损伤。由于溶液颜色较深，可能难以观察茎段，因此请将装有茎段的管子放在试管架上，静置2 min使其充分沉降。</li>
		<li>使用1 ml移液器吸出700 µl 0.5%高锰酸钾溶液。加入700 µl蒸馏水以冲洗残留的高锰酸钾溶液。重复3–4次，或直至洗涤液保持澄清。</li>
		<li>弃去水相。迅速加入1 ml 3% HCl，直至茎段中的深棕色褪去。此过程可能在3–5 min内完成，也可能需要每次5 min、共2&#160;次洗涤。用移液器吸除全部3% HCl溶液后，立即进入下一步。</li>
		<li>加入1 ml浓氨水溶液。使用1 ml移液器，其吸头应剪裁成便于无损转移茎段的形状。轻柔地将茎段吸入吸头并转移至显微镜载玻片上。盖上盖玻片，在明场照明下观察茎段。注意：由于氨水具有极强腐蚀性，需格外小心，避免腐蚀显微镜载物台或物镜。提示：氨水挥发的气体可能导致盖玻片起雾，影响样品观察，因此在加盖玻片前需特别谨慎。溶液会在5–10 min内干燥，因此成像必须在此时间段内完成。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 刚果红染色11,15
<ol>
	<li>将0.5 g刚果红溶解于100 ml蒸馏水中，配制0.5%刚果红溶液。</li>
	<li>将茎段转移至2.0 ml微量离心管中。向管中加入1 ml 0.5%刚果红溶液。轻轻吹打0.5%刚果红溶液上下混合，避免扰动茎段。注意：请小心操作，避免将茎段吸入移液器吸头内，以免损伤茎段。
	<ol>
		<li>室温孵育10分钟，重复吹打，随后再于室温继续孵育3分钟。</li>
		<li>使用1 ml移液器吸出700 µl 0.5%刚果红溶液。加入700 µl蒸馏水以冲洗残留溶液。重复洗涤3–4次，直至洗涤液澄清。</li>
		<li>使用剪去尖端的1 ml移液器吸头，使茎段可被轻松转移而不受损。轻柔地将茎段吸入吸头并转移至显微镜载玻片上，加盖盖玻片。在显微镜下使用激发蓝光、带通560/40滤光片观察样品。注意：显微观察前请勿将茎段长时间存放于水中，因水会在10–30分钟内洗脱刚果红染料。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 荧光增白剂染色9
<ol>
	<li>将 0.02 g 荧光增白剂 28（Calcofluor White M2R）溶解于 10 ml 蒸馏水中，配制 0.2% 的储备液。0.2% 溶液可置于 4 °C 暗瓶中保存六个月。用蒸馏水将 0.2% 储备液稀释 10 倍&#160;，配制 0.02% 的工作液。</li>
	<li>将茎段转移至 2.0 ml 微离心管中。向管中加入 1 ml 0.02% Calcofluor White 溶液。轻轻吹打 0.02% Calcofluor White 溶液数次。注意：请勿将茎段吸入移液器吸头内，以免损伤组织。
	<ol>
		<li>室温孵育 5 分钟，重复吹打。再于室温孵育 3 分钟。注意：让茎段沉降至管底，以便更安全地移除溶液而不损伤组织。</li>
		<li>用 1 ml 移液器吸出 700 µl 0.02% Calcofluor White 溶液，加入 700 µl 蒸馏水；静置 5 分钟以清洗残留染料。重复洗涤 3–4 次。使用剪去尖端的 1 ml 移液器吸头，使茎段易于转移且不被损伤。</li>
		<li>轻轻将茎段吹打至移液器吸头中，并转移至显微镜载玻片上，加盖盖玻片。在紫外光下观察茎段。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
9. 甲苯胺蓝O染色16,17
<ol>
	<li>将0.02 g甲苯胺蓝O溶解于100 ml蒸馏水中，配制0.02%的溶液。注意：甲苯胺蓝O溶液可在室温下避光保存两周。</li>
	<li>将茎段转移至2.0 ml微量离心管中。向管中加入1 ml 0.02%甲苯胺蓝O溶液。轻轻吹打0.02%甲苯胺蓝O溶液数次。然后在室温下孵育5分钟，并再次吹打一次。注意：吹打时需小心，避免将茎段吸入移液枪头内，以免损伤组织。将微量离心管静置，直至茎段沉降。由于溶液颜色较深，可能难以观察沉降情况，因此请将装有茎段的离心管置于试管架上，在室温下静置2分钟以确保充分沉降。
	<ol>
		<li>使用1 ml移液器吸出700 µl 0.02%甲苯胺蓝O溶液。加入700 µl蒸馏水以洗涤残留染液。重复此步骤3–4次，或直至洗涤液变得澄清。使用经剪切处理的1 ml移液枪头（枪头末端剪去一部分），以便茎段能顺利被吹打转移而不受损伤。</li>
		<li>轻轻吹打使茎段进入枪头，转移至显微镜载玻片上，并加盖盖玻片。在明场照明下观察茎段。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Fagard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PROCUSTE1+Encodes+a+Cellulose+Synthase+Required+for+Normal+Cell+Elongation+Specifically+in+Roots+and+Dark-Grown+Hypocotyls+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell+Online%22%5BJournal%5D)">PROCUSTE1 Encodes a Cellulose Synthase Required for Normal Cell Elongation Specifically in Roots and Dark-Grown Hypocotyls of Arabidopsis.</a> The Plant Cell Online. 12, 2409-2423 (2000).</li>
</ol>

作者没有需要披露的财务利益冲突。

A. thaliana 茎切片广泛用于研究次生细胞壁中细胞的排列结构，并对野生型与转基因植株之间的差异进行定性分析。常用的切片技术包括直接徒手切片；或者当样品包埋在琼脂糖或固定剂中时，可使用振动切片机或切片机进行切片。与徒手切片相比，后两种方法能够降低因样品厚度不均或表面不平整等制样不当所导致的假性差异风险。这些方法各有优缺点。我们选择将样品包埋于琼脂糖中，随后使用振动切片机进行切片，原因如下：琼脂糖包埋操作简便，处理时间短，无需对新鲜组织进行复杂的前处理。此外，我们自制的模具制作简单、成本低廉，能够固定茎秆保持笔直，可长期重复使用，并有助于样品轻松脱模而不造成混乱。溶解高浓度琼脂糖并获得均一溶液（如100 ml水中完全溶解7 g琼脂糖而不形成团块颗粒）的最佳方法是高压灭菌或以最低功率微波加热。茎组织应尽快新鲜切割，或 alternatively 将其置于冰上并用加水润湿的滤纸包裹的培养皿中保存，以防止组织脱水和变形。若茎组织在湿度不足的条件下存放超过30分钟，会导致茎秆干燥。在将茎包埋前，琼脂糖的温度应控制在约50 °C。琼脂糖倒入小瓶后必须检查是否存在气泡，因为气泡会在模具中形成空隙，从而导致切片不均匀。可在倾倒前...

植物细胞壁的各个组分中蕴含着大量信息，这些组分包括：木质素、纤维素、半纤维素（木聚糖、葡萄糖醛酸木聚糖、木葡聚糖、阿拉伯木聚糖、混合连接葡聚糖或甘露葡聚糖）以及果胶。组织学技术在研究次生细胞壁在组织和细胞水平上的差异时，提供了重要的可视化线索。尽管文献中已开发出多种组织学技术，但对于初学者而言，这些技术往往具有挑战性且耗时，因为极少有提供详细步骤和简单图示说明的实验方案。本研究的目的是提供组织学染色技术的简易指南，以获得高质量的图像。
对茎组织进行切片是观察细胞壁和细胞形态的第一步。尽管徒手切片成本较低且制备时间较短，但使用振动切片机（vibratome）可提供更高的重复性，并获得高质量的图像。利用振动切片机能够生成厚度均匀的切片，从而提高数据质量，获得清晰的图像，并显著降低因样品制备不佳而导致样本间出现假性差异的风险。使用树脂固定新鲜样品对于初学者而言可能具有挑战性，即使对于专家，在需要快速完成分析时也可能耗时较长。此外，一旦样品被包埋在树脂中，便无法再检测其任何生物学活性。一种采用琼脂糖和自制模具的简易技术可用于茎组织的包埋，该方法也可应用于其他需要解剖软组织的实验场景。与树脂包埋法相比，该方法的优势在于能够保持组织的活性，并减少对样品的操作。通过振动切片机对组织进行切片具有高度精确性，可产生均一的切片，根据研究目的的不同，这些切片可进一步结合多种不同的染色技术进行使用。
可视化木质素及其他芳香族化合物的最简单方法是使用紫外光（UV）。基于芳香族分子在紫外光激发下的发光特性是一种古老的技术，至今仍是观察木质素最快的方法之一。然而，紫外光可视化实际上并不理想，因为紫外光会激发其他芳香族化合物。木质素主要由三种基本单元构成，即单木质醇（羟基肉桂醇类：松柏醇、&#160;芥子醇，&#160;和 p-香豆醇1-3. 间苯三酚染色可提供有关木质部、纤维和导管组织中肉桂醛分布程度的线索4间苯三酚是检测肉桂醛类化合物的良好指示剂，可区分肉桂醛类与其他芳香族化合物。通过使用Mäule染色法可检测并区分芥子醇单体。甲苯胺蓝O是一种多色性染料，因此能够以不同颜色对细胞壁的不同组分进行染色。5,6甲苯胺蓝O主要用于检测果胶和木质素5,6使用甲苯胺蓝O的优点在于，细胞壁的多种组分可在一步染色中同时显现。荧光增白剂和刚果红操作简便，均可用于纤维素的可视化观察。荧光增白剂可特异性染色纤维素、胼胝质以及其他未取代或弱取代的β-葡聚糖。6-9，而刚果红则直接染色β-(1→4)-葡聚糖，尤其是纤维素10,11本研究的目的是提供使用上述染色技术的简单指南，以获得高质量的图像 A. thaliana 茎

<table><tbody><tr><td>琼脂糖</td><td>EMD</td><td>MERC2125</td><td>CAS 编号: 9012-36-6</td></tr><tr><td>间苯三酚</td><td>Sigma</td><td>P 3502</td><td>1,3,5-三羟基苯 [CAS 编号: 108-73-6]</td></tr><tr><td>盐酸</td><td>EMD</td><td>HX0603-75</td><td>CAS 编号: 7647-01-0</td></tr><tr><td>氢氧化铵</td><td>EMD</td><td>AX1303-6</td><td>CAS 编号: 1336-21-6</td></tr><tr><td>甲苯胺蓝 O</td><td>Sigma</td><td>T3260</td><td>布吕特蓝氯化物，甲苯胺氯化物 [CAS 编号 92-31-9]&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>高锰酸钾</td><td>Sigma</td><td>223468</td><td>CAS 编号 7722-64-7&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>190 证明乙醇</td><td>KOPTEC</td><td>V1401</td><td>CAS 编号: 64-17-5</td></tr><tr><td>刚果红</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>C6277</td><td>二钠 3,3'-[[1,1'-联苯]-4,4'-二基双(偶氮)]双(4-氨基萘-1-磺酸盐) [CAS 编号 573-58-0]</td></tr><tr><td>荧光增白剂 28 / 卡尔科弗卢尔白染色剂</td><td>Sigma</td><td>F3543&amp;nbsp;</td><td>4,4'-双[[4-[双(2-羟乙基)氨基]-6-苯胺基-1,3,5-三嗪-2-基]氨基]二苯乙烯-2,2'-二磺酸 [CAS 编号 4404-43-7]&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>振动切片机</td><td>Leica</td><td>Leica 振动刀片切片机 VT1000S</td><td>http://www.leicabiosystems.com/products/sectioning/vibrating-blade-microtomes/details/product/leica-vt1000-s/</td></tr><tr><td>剃刀</td><td>American Safety Razor 公司</td><td>货号 # 60-0139-0000&amp;nbsp;</td><td>不锈钢双刃刀片（Personna Super）</td></tr><tr><td>螺帽微量离心管（2 ml）</td><td>VWR</td><td>16466-044</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管（0.6 ml）</td><td>Axygen Scientific</td><td>MCT-060-C</td><td></td></tr><tr><td>隔热手套</td><td>Bel-Art</td><td>380000000</td><td>SCIENCEWARE&amp;nbsp; 热手防护手套</td></tr><tr><td>组织粘合剂</td><td>Ted Pella 公司</td><td>10033</td><td>4 &amp;deg;C 或 20 &amp;deg;C 下保存 3 个月或更长时间</td></tr><tr><td>微波炉</td><td>Panasonic</td><td>NN-SD762S</td><td>PELCO Pro CA 44 即时组织粘合剂&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>无机械快门的 CCD 芯片相机&amp;nbsp;</td><td>Hamamatsu</td><td>C4742-95</td><td></td></tr><tr><td>高速彩色相机&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>QImaging</td><td>MicroPublisher 5.0 RTV</td><td></td></tr><tr><td>相机软件&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;Molecular Devices</td><td>MetaMorph 版本 7.7.0.0</td><td></td></tr><tr><td>图像分析&amp;nbsp;</td><td>Adobe&amp;nbsp;</td><td>Photoshop CS4</td><td></td></tr><tr><td>方形显微盖玻片，1 号</td><td>VWR</td><td>48366-067</td><td>22 x 22 mm (7/8 x 7/8&quot;) — 盖玻片耐腐蚀，厚度均匀且平整。1 号厚度为 0.13 至 0.17 mm。</td></tr><tr><td>磨砂显微载玻片，1 mm</td><td>VWR</td><td>48312-003</td><td>75 x 25 mm - 1 mm</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Alcan 包装公司</td><td>BRNDPM998</td><td></td></tr><tr><td>TX2 滤光立方体</td><td>Leica</td><td>11513851/11513885</td><td>用于刚果红分析的滤光片，带通为 560/40。</td></tr></tbody></table>

组织化学染色 拟南芥 次生细胞壁组分

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Arabidopsis thaliana 是一种模式生物，常用于研究和调控植物中的多种细胞过程，在次生细胞壁形成的研究中被广泛使用。次生细胞壁的沉积发生在初生细胞壁构建完成之后，该过程仅由特定类型的特化细胞完成，例如导管和纤维组织中的细胞。大多数次生细胞壁由纤维素（40–50%）、半纤维素（25–30%）和木质素（20–30%）组成。已有多个影响次生细胞壁生物合成的突变体被分离获得，相应的突变体可能表现出明显的生化成分变化或可视表型，也可能不表现，因为这些突变效应可能被补偿性反应所掩盖。染色技术历来被用于在细胞水平上显示差异。这些方法完全是视觉分析手段，但其在快速而关键的分析中具有重要意义。刚果红和荧光增白剂 Calcofluor White 用于检测多糖，而 Mäule 染色和间苯三酚（phloroglucinol）染色常用于鉴定木质素的差异，甲苯胺蓝 O（toluidine blue O）则可用于对多糖和木质素进行差异染色。看似简单的切片、染色和成像技术，对初学者而言可能具有挑战性。本研究以 A. thaliana 为模型，从样品制备开始，详细描述了多种可轻松实施的染色方法，用于观察植物次生细胞壁中细胞和组织的结构与排列。

茎段包埋与切片： 
使用自制塑料模具将茎段包埋于7%琼脂糖中，操作快速且简便（图1）。包埋管系统的两个部分（A和B；图1）使得包埋在琼脂糖中的茎段易于释放，因为琼脂糖不会黏附到由惰性材料制成的管体部件上，从而保持系统清洁。这些管体可多年重复使用。包埋后茎段的储存也十分方便，有利于后续步骤的进行。为节省时间，可将相似的包埋茎段（最多3个）集中于同一张切片板上进行切片。
在紫外光下观察芳香族化合物： 
将茎段置于载玻片上的蒸馏水中，在紫外光下进行观察。细胞中的芳香族化合物（包括木质素）可通过其在紫外光下的自发荧光进行可视化。木质部（Xy）和髓间纤维（Fi）在紫外光照射下显示出自发荧光，而髓部（Pi）、皮层或表皮（Ep）则无此现象（图2），原因是木质素作为一种芳香族聚合物，是在次生细胞壁生物合成过程中沉积形成的。在某些情况下，当植物在液泡中积累大量芳香族化合物（例如，花青素）时，可在皮层细胞中观察到荧光（数据未显示）。茎横切面在5X、10X、20X和40X放...

植物细胞壁的组成因组织类型而异，可能包含木质素、纤维素、半纤维素和果胶。已有多种染色技术被开发用于在细胞类型水平上观察这些差异。本文汇编了常用的细胞壁染色技术。

拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种常用的模式生物，广泛用于研究和调控植物中的多种细胞过程，并已被大量应用于……

本实验的总体目标是展示拟南芥 ANA 次生细胞壁结构的组织化学染色。首先将植物茎嵌入 aros 中，然后将 aros 包埋的茎脱模并转移至样品盘，再使用振动切片机将其切成茎的横切面。接下来，将切片进行各种组织化学染色处理。最终通过显微镜观察，显示由组织化学染色所获得的次生细胞壁各组分的差异性变化。该方法有助于回答细胞壁研究中的关键问题，例如植物茎中斑块组织的变化。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为本方案中提到的一些简单但关键的步骤此前未被充分记录或以简明方式呈现。首先，使用塑料离心管自制一个用于包埋茎段的模具。第一步，用剃刀片切下2毫升带螺帽的微量离心管的锥形底部。该组件称为A部分，带有一个注射器针头穿刺孔，管盖上的孔略大于待插入茎的直径。接下来，将0.6毫升微量离心管底部剪去半厘米。此组件将称为B部分。将0.6毫升微量离心管剪下的半厘米部分插入预先切好的2毫升微量离心管中。使用石蜡密封两部分。用剃刀刀片从目标区域切取一段茎，将7%琼脂溶液在微波炉中低功率加热至融化。待融化的琼脂冷却至约50摄氏度时，缓慢吸取5毫升琼脂溶液，加入预先制备的塑料模具中，以填满小瓶。在气溶胶冷却30至60秒并呈半固态后，将茎部插入装有气溶胶的小瓶中。然后以适当方式放置带孔的瓶盖，使茎的尖端被瓶盖固定。将小瓶置于室温或4摄氏度环境中10至30分钟，直至完全凝固。轻轻将模具从管中滑出以取出模具。打开封口膜，用拇指轻轻推动模具B部分的底部，使凝固的组织从A部分脱出，置于载玻片上。进行切片。将茎插入AROS中，并将其切成三段，每段长约1.2厘米。剪去未插入AROS中的茎段部分并弃去。确保样品盘清洁且完全干燥。使用软纸巾擦去含有样本的包埋块上的任何水分。在样本盘上滴一滴组织粘合剂。迅速将包埋块放置到位，使样本垂直于载板以获得横截面，或与载板平行放置。对于纵向横切面，将粘合剂在室温或4°C条件下固定样本至样品盘10至30分钟。将样品盘固定在缓冲槽或切块托盘上，确保切面与剃刀刀片平行。向缓冲槽中加入室温蒸馏水，直至样本完全浸没。将剃须刀片切成两半，然后用坚固的剪刀修剪两端，确保刀片完全平整。将预先切割好的刀片一半固定在刀架上。将刀架的角度设置为84度，速度设置为0.90毫米每秒，频率设置为50赫兹。使用连续模式将切片切成100微米厚度。在缓冲液托盘中切片时，用一次性塑料移液管收集切片。将几片切片转移至2毫升微量离心管中，用于荧光染色。将茎段转移至微量离心管中。向管中加入1毫升荧光素溶液，并立即盖紧管盖。由于荧光葡糖苷染色剂中的盐酸具有强腐蚀性，需轻轻晃动离心管，确保所有茎段均被染色。用移液枪轻轻将切片转移至已剪去尖端的移液枪头中，并移至显微镜载玻片上。用盖玻片覆盖切片，置于明场照明下观察。溶液在5到10分钟内会干燥，导致样本质量下降。因此，成像必须在此时间段内完成。对于墨汁染色，将茎切片转移至微量离心管中。向含有切片的试管中加入1毫升0.5%高锰酸钾溶液。用移液器轻轻吹打0.5%高锰酸钾溶液数次，尽量避免扰动切片。孵育2分钟后再次进行轻柔吹打，然后将微量离心管静置，直至所有切片完全沉降。使用1毫升移液器吸取700微升0.5%高锰酸钾溶液，加入700微升蒸馏水以冲洗高锰酸钾。重复三至四次，直至水溶液保持澄清。弃去水后迅速加入1毫升3%盐酸，直至组织切片中的深棕色褪去。这可能在三到五分钟内发生，也可能需要两次、每次五分钟的洗涤。用移液器吸出全部3%盐酸溶液，并立即加入一毫升浓氨水溶液。在进行刚果红染色的明场成像前，将茎段转移至微量离心管中，并加入一毫升0.5%刚果红溶液。轻轻吹打0.5%刚果红溶液，避免扰动组织切片。在按照文本方案进行孵育和洗涤步骤之前，将组织轻轻吹入剪去尖端的移液器吸头中，转移至载玻片上，随后加盖盖玻片。在显微镜下观察样品。使用560纳米发射滤光片，在蓝光激发下进行观察，以检测钙白染色。将茎段转移至微量离心管中，并加入1毫升0.02%的钙白溶液。轻轻吹打溶液。按照文本方案中所述的步骤对切片进行孵育和洗涤，然后在紫外光下观察切片。对于甲苯胺蓝O染色，将茎切片转移至微量离心管中。然后向试管中加入1毫升0.02%的甲苯胺蓝O溶液，并轻轻吹打混匀。随后按照文字版实验方案中的描述对切片进行孵育和洗涤，再在明场照明下观察。有关成像所用显微镜和相机参数设置，以及紫外和明场成像步骤的详细信息，请参见文字版实验方案。芳香族化合物，包括细胞中的木质素，可通过其在紫外光下的自发荧光进行观察。在紫外光照射下，木质部和纤维间纤维显示出自发荧光，而髓部、皮层或表皮则无此现象，因为木质素和芳香族聚合物是在次生细胞壁形成过程中沉积的。此外，荧光染色剂fluorol能与木质素的醛基末端发生反应，在紫外光观察下呈现粉红色或品红色。在木质部和纤维间纤维中可观察到品红色着色，而髓部、皮层或表皮中则无此着色现象。通常，颜色的深浅以定性方式与木质化程度相关。MALS 染色法可特异性检测木质部和纤维间纤维中的愈创木基木质素单元。红色着色表明木质素组分中存在愈创木基木质素单元。然而，与木质部组织相比，纤维呈现出更明亮的红色，这表明纤维中含有更高水平的愈创木基木质素，而木质部则富含愈创木基（gua）木质素单元。用钙黄绿素白染色的茎切片在紫外光下观察显示，表皮、皮层和髓部均被染色，因为这些组织的细胞壁中均以纤维素作为主要的多糖聚合物。刚果红染色的切片在蓝光激发下观察，同样染色了表皮、皮层和髓部。与刚果红相比，氯化钙处理后的样品在木质部和介导纤维中对多糖的染色效果更佳，且受木质素中碘存在影响较小。亮蓝O被归类为多色性染料，因其可产生多色性的标本。碘-亮蓝O是一种离子型染料，可结合带负电荷的基团并生成不同的颜色。当染料与细胞中不同的离子基团结合时，茎横切面的番红O染色显示，由于木质部和束间纤维呈现蓝绿色或蓝色，表明其已发生木质化，这与紫外光和荧光木聚糖染色结果一致。相比之下，髓部、皮层和表皮组织虽未木质化，但由于其细胞壁中含有一定量的果胶多糖，因此也呈现蓝绿色或蓝色。观看本视频后，您应能够充分掌握如何对植物茎进行切片，并利用不同的组织化学染色法对植物细胞壁中的各类组织进行特异性染色。

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生物学

组织化学染色<em&gt;拟南芥</em&gt;次生壁元素

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在本视频中，我们介绍用于染色植物特化细胞中紫丁香基木质素的Maule染色法。该染色技术有助于表征木质部和髓间纤维中木质素的分布情况。...

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在本视频中，我们演示了刚果红染色法，用于观察拟南芥（Arabidopsis...

刚果红染色：一种用于可视化植物茎切片中纤维素沉积的技术

在本视频中，我们介绍了一种染色方法，利用能够特异性结合β-连接葡聚糖并在紫外光下产生荧光的棉酚白（calcofluor white），对双子叶植物拟南芥（Arabidopsis...

Calcofluor White 染色：一种通过紫外诱导荧光可视化双子叶植物茎切片细胞壁中纤维素沉积的简易方法

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植物组织中阿拉伯半乳聚糖蛋白和果胶的免疫定位

我们在此提供一种高效且可靠的免疫染色和荧光检测方案 在 原位 杂交，DNA染色后对整体样本进行定量高分辨率成像 拟南芥...

一种用于整体封片胚珠中染色质修饰与细胞核结构的高效定量单细胞分析方法 拟南芥

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整体透明化与染色 拟南芥 花器官与角果

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拟南芥底部库组织中加载CFDA示踪剂的向顶运输

本方案详细描述了用于阿拉伯半乳聚糖蛋白和果胶免疫定位的植物材料如何进行固定、包埋于亲水性丙烯酸树脂中、切片并载于玻片上。我们将展示如何利用特异性抗体检测细胞壁相关的表位。...

植物组织细胞壁中阿拉伯半乳聚糖蛋白和果胶的荧光免疫定位

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基于图像的方法研究气孔谱系细胞中的膜运输事件

本实验方案描述了拟南芥（Arabidopsis...

发育和成熟胚乳细胞层显微分析用完整组织的制备 拟南芥 种子

学习组织化学染色技术用于拟南芥次生壁元素的可视化分析。该方法通过包埋、切片和多种染色程序，帮助研究人员在细胞水平上区分木质素、纤维素等细胞壁成分。

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