成像在细胞水平上通过3DISCO清除完整生物系统

以下实验的总体目标是在没有组织学切片的情况下对荧光标记的完整生物样品进行成像。这是通过将固定的组织在有机溶剂中连续孵育直至达到完全透明来实现的。作为第二步。

使用激光扫描显微镜对透明组织进行 3D 成像。接下来，分析成像结果，可以从收集的三个迪斯科图像中以 3D 重建未切片脊髓和大脑中的神经元结构。这种方法可以帮助回答神经科学领域关于如何绘制整个大脑和脊髓中的神经元和 GAL 连接的关键问题。

这项技术的影响延伸到神经退行性疾病的治疗，因为我们现在可以可视化整个神经系统的神经完整性。虽然这种方法可以深入了解神经系统的组织，但它也可以应用于其他器官，例如肺或肿瘤组织。一旦掌握，这项技术对于脊髓或肺等小器官只需要几个小时，对于大脑大约需要一到两天。通过在每个收获的组织向一个玻璃瓶中加入两到三毫升新鲜制备的 50%THF 来开始该程序。

然后将固定的器官转移到透明溶液中并牢固地关闭样品瓶。将样品瓶放在旋转器上，用铝箔覆盖，以 30 RPM 的恒定速度搅拌样品适当的时间。然后去除透明溶液，并使用新的 PE 或移液管将组织悬浮在下一个溶液中。

如表所示，在最后的清除步骤中，将样品保存在溶液中，直到它们对于多光子或共聚焦显微镜完全透明。一旦完全清除，就将样品安装在成像载玻片上以达到此目的。使用牙科粘结剂在组织周围做一个边界。

在牙科水泥完全硬化之前，用最终的清除溶液填充池，然后立即将清除的样品放在池的中间，并用盖玻片盖住。一旦完全清除安装，立即按下盖玻片，直到它被牙科水泥完全密封并接触用于光片显微镜的透明器官的表面，然后手动转动样品架的螺丝以固定样品。接下来，将样品浸入光片显微镜的成像室中，该成像室中装有适合成像组织的最终透明化溶液。

然后以显微镜可以提供的最佳分辨率收集覆盖整个透明化组织的 Z 扫描，放大感兴趣区域以收集更高分辨率的图像。收集图像后，使用 resolve RT 模块在 Amira 软件中加载图像系列。加载序列后，在图像读取参数窗口中输入正确的体素大小，然后单击确定。

接下来，选择 multiplanar view 子应用程序。然后使用主滑块和粗细滑块为灰度值选择最佳投影厚度和阈值。最后，使用 crop corner 模块浏览不同 3D 方向的切片。

为了可视化样本，绘制神经元的结构组织图谱对于了解它们在健康和疾病中的功能极为重要。虽然三个迪斯科可以用于各种器官，但它对于追踪脊髓和大脑中的长神经元连接特别有用。例如，使用大的透明脊髓节段的超显微镜扫描，可以跟踪啮齿动物脊髓中超过厘米的轴突连接，如这些图像所示。

以类似的方式，可以对整个清除的小鼠大脑和海马体进行成像，以跟踪大脑中的神经元连接。当使用共聚焦或多光子显微镜时，成像分辨率可以显著提高，尤其是在 Z 维度上。例如，对 GFPM 线小鼠清除的脊髓进行多光子成像，可在脊髓的整个 1.5 至 2 毫米深度内实现无缝成像。

对透明脊髓进行共聚焦显微镜检查以类似的方式提供更高的分辨率。透明化大脑的多光子显微镜成像可提供非常高分辨率的图像，以可视化神经元结构的精细细节，包括树突棘。三个迪斯科舞厅的样本可以用各种方式进行标记。

例如，可以使用凝集素偶联荧光示踪剂标记大脑和脊髓的整个脉管系统，这可用于研究健康和疾病中的血脑屏障。在大组织中使用三个 disco 较小的细胞也可以成像。例如，小胶质细胞和星形胶质细胞都与神经退行性疾病的病理学高度相关，包括阿尔茨海默病和创伤性损伤。

使用三个迪斯科，可以研究它们在脊髓中的密度和分布。也可以对非神经元组织进行成像。例如，整个啮齿动物肺中的 Clara 细胞可以用抗体进行免疫标记，并在不切片单个细胞水平的情况下进行成像。

同样，可以清除和成像未经批准的胰腺组织中的细胞。例如，在这些胰腺图像中清除后，对荧光标记的 α 细胞进行成像。这种方法的可视化演示很重要，因为虽然透明化和成像步骤很简单，但数据分析可能很复杂。

在应用此程序时，重要的是在达到完全透明后立即对透明组织进行成像，因为荧光信号在透明化溶液中会随着时间的推移而降低。这项技术的发展为研究人员探索细节和完整器官铺平了道路，例如绘制大脑中的神经元网络。观看本视频后，您应该对如何清除和成像整个器官中的细胞和亚细胞结构，并随后对其进行可视化和分析有很好的了解。