Name: 成像在细胞水平上通过3DISCO清除完整生物系统 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: 了解3DISCO组织透明化技术用于完整生物样本成像，无需切片即可在细胞水平观察神经元连接。该方法结合激光扫描显微镜和Amira软件分析，可追踪脊髓和大脑中的长距离神经通路，为神经退行性疾病研究提供新工具。

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我们感谢 C. Hojer 对手稿的审阅，感谢 B. Bingol（Genentech）参与脚本旁白录制，感谢 N. Bien-Ly 分享通过尾静脉注射 Lectin 染料改进血管成像的经验，感谢 M Solloway（Genentech）提供用于胰腺成像的小鼠。GFP-M 小鼠系由 J. Sanes（圣路易斯华盛顿大学）构建，CX3CR1-GFP 小鼠由 R. Littman（纽约大学）提供。本工作由 Genentech 公司资助。

所有动物实验均按照机构动物护理和使用委员会（IACUC）的规定对约3至5个月大的小鼠进行。作者声明不存在竞争性财务利益。
1. 动物灌注与组织制备
时间：每只小鼠 30–60 分钟，加上固定后处理（数小时至过夜）。
<ol>
	<li>称量动物体重，并使用氯胺酮（80-200 mg/kg）和赛拉嗪（7-20 mg/kg）或2.5%阿佛丁（腹腔注射，0.5 ml/25 g体重）进行麻醉。</li>
	<li>等待数分钟，使麻醉完全起效。</li>
	<li>轻捏动物的脚趾和尾巴，确认动物已完全麻醉。</li>
	<li>首先在室温下用0.1 M磷酸缓冲液（PB）或0.1 M磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）灌注动物5-10分钟，直至组织中的血液完全清除。</li>
	<li>切换至固定液：将灌注液换为含4%多聚甲醛（PFA）的0.1 M PB（或0.1 M PBS），以3 ml/min的速度继续灌注30-40分钟。</li>
	<li>小心解剖目标器官，避免造成损伤，例如，避免穿刺或挤压待解剖的组织。</li>
	<li>在盛有PBS的培养皿中去除器官周围多余的组织（如结缔组织、软脑膜或硬脑膜）。</li>
	<li>将器官在4% PFA中后固定数小时或过夜&#160;，置于4 ºC环境中。避免长时间后固定，因为PFA可能随时间推移淬灭信号或增强自发荧光10，尤其是在GFP通道中（而在红色和远红通道中该问题较轻）。</li>
	<li>在开始透明化处理前，于室温下用PBS洗涤器官2-3次&#160;。</li>
</ol>
2. 组织透明化
时间：小器官需 2-3 小时，大器官需 1-4 天。
注意事项：应在组织透明化之前完成通过转基因表达、病毒转染、染料示踪或抗体标记实现的组织荧光标记。所有组织透明化步骤均在室温下进行。四氢呋喃（THF）、二苯醚（DBE）、BABB（1份苯甲醇与2份苯甲酸苄酯的混合物）和二氯甲烷均为有毒试剂，应避免吸入（实验需在通风良好的通风橱中进行）以及避免与皮肤直接接触（请使用腈类手套）。
<ol>
	<li>分别在不同的玻璃瓶中，按以下方法用蒸馏水配制50%（体积/体积）、70%和80%的THF溶液：对于50% THF， 例如，将25 ml THF与25 ml蒸馏水在体积大于50 ml的玻璃瓶中混合。</li>
	<li>轻轻摇动瓶子 1 至 2 分钟以混合溶液。</li>
	<li>清晰标记玻璃瓶。</li>
	<li>将瓶子牢固密封，并将工作液存放在避光的柜子中。为获得最佳效果，工作液使用时间不应超过1–2周。因此，建议订购最小规格的透明化试剂，以确保使用新鲜的储备液。</li>
	<li>填充玻璃小瓶（例如，用2-3 ml第一透明化溶液（50% THF）将器官从PBS转移至玻璃小瓶中以开始透明化处理。</li>
	<li>用瓶盖将玻璃小瓶牢固密封，并使用旋转仪（例如，用于搅拌的轮式搅拌器）</li>
	<li>用铝箔覆盖玻璃小瓶并避光保存。启动旋转仪，按照指定时间对玻璃小瓶中的样品进行搅拌。表1以恒定速度（约30 rpm）旋转。</li>
	<li>移除透明溶液，并根据方案中的时间要求加入下一步所用的溶液 表1 完成。</li>
	<li>将透明化废液收集到置于通风橱内的玻璃废液容器中。 
	按照方案中的每种透明化溶液依次重复上一步骤，直至完成。每次更换新的透明化溶液时，均需使用新的巴斯德吸管。例如，从 THF 更换为 DBE。</li>
	<li>在使用BABB或DBE进行最终透明化步骤时，可根据样本在可见光下是否完全透明（或对于脑等较大组织，呈现黄褐色/透明状态）来适当延长或缩短孵育时间。</li>
	<li>在所有步骤中，包括成像阶段，均需将已透明化的器官始终保存在最终的透明化溶液中。</li>
</ol>
3. 准备受清除器官以进行成像
时间：5-15 分钟。
注意：在完成组织透明化后，应立即对透明化器官进行成像。为此，请按照以下步骤准备样本，以进行光片显微镜（例如，超显微镜）或共聚焦/多光子显微镜成像。
注意：透明化处理的器官会随着时间推移逐渐减弱荧光强度（尤其是荧光蛋白） 例如，GFP；抗体标记更稳定，即使延长孵育时间也可能获得更好的结果）。在成像时，只要妥善处理透明化溶液中的器官，可采用多种荧光显微镜技术。
<ol>
	<li>用于光片显微镜
	<ol>
		<li>将样本正确放置或安装。</li>
		<li>通过手动旋转样品架上的螺丝来固定已透明化的器官4。</li>
		<li>将样本浸入光片显微镜的成像室（建议使用玻璃材质）中，成像室内应充满BABB或DBE，具体使用哪种试剂取决于最终透明化步骤所用的溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于双光子/共聚焦显微镜
	<ol>
		<li>将样本置于成像载玻片（或成像室）上，并加入最终成像溶液，以便使用双光子或共聚焦显微镜进行成像，此类显微镜通常采用油镜或水镜物镜。</li>
		<li>使用牙科水泥在组织周围构建一圈围堰。</li>
		<li>在牙科水泥完全固化前，立即用BABB或DBE填充围堰形成的凹槽。 
		注意：牙科水泥固化迅速，建议先进行数次练习以熟悉操作，再用于实际样本。</li>
		<li>立即将透明化后的样本置于凹槽中央，并加盖盖玻片。</li>
		<li>轻压盖玻片，直至其被牙科水泥完全密封，并与透明化器官表面接触，这有助于在共聚焦/双光子显微镜下达到最大成像深度。 
		注意：此步骤可确保成像过程中透明化溶液不会溢出。应避免将成像物镜直接浸入透明化溶液中，除非物镜耐受BABB/DBE或配有保护罩，否则可能造成镜头损伤。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 透明化器官的成像
时间：15–45 分钟。
<ol>
	<li>使用显微镜在能够达到的最佳分辨率下，对整个透明化组织进行 z 扫描（如果所用物镜允许）。</li>
	<li>放大至感兴趣区域，以采集更高分辨率的图像。</li>
</ol>
5. 使用软件 Amira 对数据进行分析
<ol>
	<li>使用 Amira 软件中的 ResolveRT 模块加载图像序列。</li>
	<li>在“Image Read Parameter”窗口中输入正确的体素尺寸，然后点击确定。</li>
	<li>选择“Multi Planer View”子应用程序，然后使用“Thickness”滑块为灰度值选择最佳阈值，并调整 2D 和 3D 的显示效果。</li>
	<li>通过在不同 2D 方向上浏览切片，并在 3D 视图中使用裁剪角模块来可视化样品。 
	注意：本实验方案的详细故障排除指南可参见 Ertürk et al4。</li>
</ol>

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</ol>

无任何披露内容。

组织透明化方法旨在通过匹配透明化器官中不同组织层的折射率，减少成像光线的散射。因此，成像光线可深入组织内部，激发被标记的细胞或分子。这一组织透明化的古老概念17，在Dodt及其同事首次将该技术成功应用于完整小鼠大脑后2，逐渐受到越来越多的关注。自那以后，一系列新的透明化方法迅速发展，包括3DISCO、Sca/e、ClearT2、CLARITY和SeeDB3,4,7,18-20。本质上，这些方法均旨在保持荧光标记的同时，使器官呈现透明状态，以实现深层组织成像。其中，3DISCO因其操作简便且可重复性高而尤为突出。与其他上述透明化方法相比，该方法相对较快（分别需1-5天与成年鼠脑的2-3周相比）21。该方法已成功应用于多种器官，如大脑、脊髓、淋巴结、脾脏、肺、实体瘤、胰腺和乳腺组织3,4,9。此外，已有多个独立研究团队发表的研究利用该方法获得了成像结果22,23。然而，不同的组织透明化方法在不同条件下可能各有优势。例如，Sca/e和SeeDB最适合用于胚胎组织6,7，且为基于水的透明化方法，在成像过程中操作更为简便。相比之下，CLARITY是一种复杂且成本较高的透明化方法，但在抗体标记方面具有优势，尤其适用于大脑等大体积组织8。
获得3DISCO最佳成像效果最关键的步骤是组织标记，该步骤需在组织透明化之前完成。必须尽可能从最强的荧光信号开始，这可通过多种方式实现，包括荧光蛋白的转基因表达、合成染料示踪、病毒转染或抗体标记。需要注意的是，任何透明化处理都会减弱组织的荧光信号。因此，如果初始荧光信号不够强——即 在组织透明化之前，该信号难以被检测到；若对未透明化的组织进行成像，将导致结果不理想。
透明化方法存在一些尚待改进的局限性。其中一个关键局限在于，由于透明化试剂会改变被处理器官的结构，因此无法用于活体组织。因此，诸如使用光激活型mEos2的实验24 应在固定和透明化之前进行。透明化后，可实现对明亮且光稳定性强的荧光蛋白信号的超分辨率成像。此外，由于透明化流程会减弱荧光蛋白的信号强度，透明化后的器官无法长期保存。需要注意的是，某些器官更难实现透明化，尤其是当分离的器官中残留大量血细胞时（例如脾脏、肝脏）等组织相对难以进行透明化处理和成像。对于成年啮齿类动物脑等较大组织，实现完全透明化尤为困难，通常需要更长的孵育时间，而这可能反过来导致荧光信号减弱。此外，尚需发展能够对大型透明器官进行一次性高分辨率成像的显微技术。该技术另一重要局限在于组织标记。尽管通过基因或病毒表达实现强荧光标记是最理想的方式，但并非所有细胞或分子均可通过遗传或病毒手段进行标记。另一方面，对厚组织进行抗体标记通常并非易事，在大多数情况下甚至无法实现，往往需要特殊的通透化方案以及长时间孵育（数天至数周）。3还需注意，组织在透明化后每个维度会收缩约20%（以脊髓组织测量为准），这主要是由于脱水和去脂作用所致。这种收缩呈比例性，因此在定量分析步骤中应予以校正。如本文结果所示，荧光标记的结构保持完整，表明透明化组织中的蛋白质完整性得以保留。由于最终透明化组织具有疏水性，无法再用抗体进行染色，也不能嵌入含水溶液中。 例如，Focusclear（在CLARITY中使用）或80%甘油。最后，分析海量的成像数据也是一大挑战。例如，当以细胞分辨率扫描整个小鼠脑时，追踪和定量目标结构将非常困难（例如，神经元或胶质细胞网络），并以自动化方式在不同样本间进行比较。总之，在研究人员致力于开发新型透明化方法的同时，上述各项挑战（不同组织透明化的难度、大范围高分辨率成像，以及复杂的数据分析）也需同步改进。
总之，近年来开发的组织透明化技术（如3DISCO）有力地证明，对完整器官进行高分辨率三维成像已成为可能。利用这些方法，科学家可以获得完整器官中细胞和分子的解剖学信息。这些针对透明器官的开创性三维成像研究，正激励着越来越多的研究人员去解析健康与疾病状态下组织/器官中复杂的解剖与分子结构。

对生物组织进行组织学检查是了解分子/细胞在其天然环境中特性的基本方法。理想情况下，对整个器官进行高分辨率成像最具信息量，也最为理想。由于光在组织中会发生散射1，穿透深度有限，因此必须对固定的器官进行切片，才能实现高分辨率的显微成像。因此，大多数组织学研究仅基于少数几个组织切片，而这些切片仅代表器官的一小部分。在某些研究中，&#160;例如旨在追踪大脑或脊髓中神经元连接的研究，&#160;会收集目标器官的全部组织切片并进行成像，以实现三维重建。然而，组织切片及随后对各个切片的成像存在多种局限性，包括耗时较长，以及由于机械形变和图像拼接困难，导致组织的三维重建不完整。
近年来，透明化并成像完整透明器官的技术已被开发为解决这一缺陷的重要方案2,3。经过透明化处理后，整个器官变得透明，使成像光能够贯穿器官两端（图1），从而利用激光扫描显微镜（如双光子显微镜或光片显微镜）对未切片的器官进行高分辨率成像（图2）。多个研究团队已开发出新的组织透明化方案，以满足不同目的下对特定组织的成像需求。这些方案包括基于有机溶剂2-5、水性介质6,7以及电泳原理8的透明化方法。其中，溶剂透明化器官的三维成像（3DISCO）是一种适用于多种生物样本的便捷方案，包括中枢神经系统（CNS）器官、免疫器官和实体瘤。此外，该方法可与多种显微技术联用，如光片荧光显微镜（LSFM）、双光子显微镜和共聚焦激光扫描显微镜。3DISCO基于易于获取且成本低廉的试剂进行透明化处理，例如四氢呋喃（THF）和二苄基醚（DBE）4。整个实验流程最短可在3至4小时内完成。因此，与传统组织学方法相比，3DISCO是一种更为稳健且快速的技术，后者通常需要数周甚至数月才能完成9。

<table><tbody><tr><td>Thy-1 GFP (GFP-M) 小鼠</td><td></td><td></td><td>可从 Jackson 实验室获得。</td></tr><tr><td>CX3CR1 GFP 小鼠</td><td></td><td></td><td>可从纽约大学 Littman 实验室获得。</td></tr><tr><td>TgN(hGFAP-ECFP) 小鼠</td><td></td><td></td><td>可从 Jackson 实验室获得。</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Mallinckrodt</td><td>7917-16</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Mallinckrodt</td><td>7892-04</td><td></td></tr><tr><td>2-2-2 三溴乙醇</td><td>Sigma</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>2-甲基-2-丁醇</td><td>Sigma</td><td>152463</td><td>用于配制 Avertin 溶液。</td></tr><tr><td>生理盐水</td><td>Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>四氢呋喃</td><td>Sigma</td><td>186562-12X100ML</td><td></td></tr><tr><td>二氯甲烷</td><td>Sigma</td><td>270997-12X100ML</td><td></td></tr><tr><td>二苄醚</td><td>Sigma</td><td>Sigma, 108014-1KG</td><td></td></tr><tr><td>苯甲醇</td><td>Sigma</td><td>305197-100ML</td><td></td></tr><tr><td>苯甲酸苄酯</td><td>Sigma</td><td>B6630-250ML</td><td></td></tr><tr><td>荧光素标记凝集素（Lectin FITC）</td><td>Sigma</td><td>L0401-1MG</td><td></td></tr><tr><td>抗 CC10 抗体（anti-CC10）</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-9772</td><td>0.388888889</td></tr><tr><td>肝素</td><td>APP pharmaceuticals</td><td>504001</td><td>用于灌注。</td></tr><tr><td>玻璃小瓶</td><td>VWR</td><td>548-0554</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>FST</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>微型旋转仪（Mini Rotator）</td><td>VWR</td><td>100498-878</td><td></td></tr><tr><td>铝箔</td><td>Fisherbrand</td><td>01-213-104</td><td></td></tr><tr><td>100 ml 培养基储存瓶</td><td>Kimax 培养瓶</td><td>EW-34523-00</td><td></td></tr><tr><td>Minipuls evolution 灌注泵，配备 MF4* 中流量泵头</td><td>Gilson, Inc</td><td>F110701 和 F117606</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>FastWell</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>FW20</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Corning</td><td>2940-245</td><td></td></tr><tr><td>玻璃培养皿</td><td>Corning Pyrex</td><td>3160-101</td><td></td></tr><tr><td>牙科水泥</td><td>Lang Dental</td><td>1223PNK</td><td></td></tr><tr><td>Quantofix 过氧化物检测试纸</td><td>Sigma</td><td>37206</td><td></td></tr><tr><td>Amira 配备 RT resolve 显微成像模块</td><td>Visage Imaging</td><td>图像分析软件</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane imaging</td><td>图像分析软件</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>免费软件</td><td></td></tr></tbody></table>

通过3disco技术在细胞水平上对完整生物系统进行成像

Imaging Cleared Intact Biological Systems at a Cellular Level by 3DISCO

组织透明化及对透明器官进行后续成像，是一种在完整器官中以三维方式分析荧光标记细胞和分子的有力方法。与传统组织学方法不同——后者需将目标组织切片后进行荧光成像——对透明化组织进行三维成像可实现对整个样本中标记细胞和分子的全面观察。为此，需通过匹配组织内部的折射率，使原本光学不透明的组织变为透明。随后，可利用激光扫描显微镜对组织整体进行一次性成像，获得样本完整的高分辨率三维图像。目前已有越来越多的组织透明化方案，包括3DISCO、CLARITY、Sca/e、ClearT2和SeeDB，为研究人员提供了 Whole-mount 成像其目标组织的新途径。其中，3DISCO是一种高度可重复且操作简便的方法，适用于多种类型组织的透明化处理，并可与多种显微成像技术联用。本方案详细描述了该方法的简便操作流程，并展示了其多种应用。同时，也讨论了该方法的局限性、可能遇到的困难及其解决方案。

神经元是具有极长形态的高度极化细胞，其功能依赖于神经元之间以及与其他组织之间形成的连接。因此，解析神经元的结构组织对于理解其在健康和疾病状态下的功能至关重要。然而，追踪整个神经系统中如此庞大的神经元连接——这一领域最近被称为连接组学（connectomics）11——仍然是神经科学领域最具挑战性的难题之一。为此，欧盟12和美国13均已启动大型项目，旨在绘制人脑的连接图谱。
尽管3DISCO可应用于多种器官，但在追踪脊髓和大脑中的长距离神经元连接方面尤为有用。例如，利用对大段透明化脊髓进行的超显微成像扫描，可在啮齿类动物脊髓中连续追踪轴突连接达数厘米（图2）。类似地，可对完整透明化的小鼠全脑（图3a）和海马体（图3b）进行成像，以追踪大脑中的神经元连接。
当对透明化器官使用共聚焦显微镜或多光子显微镜成像时，成像分辨率可显著提高，尤其是在 z 轴方向。例如，对来自 GFP-M 系小鼠的透明化脊髓进行多光子成像（图 4a），可在整个脊髓深度（约 1.5–2 mm）实现无缝图像。对透明化脊髓进行共聚焦显微成像同样可获得分辨率提升的效果（图 4b 和 图 4c）。对透明化脑组织进行多光子显微成像可获得极高分辨率的图像，用于观察神经元结构的精细细节，包括树突棘（图 5）。3DISCO 样本可通过多种方式标记，包括转基因表达、病毒转染、染料示踪和抗体标记。例如，可利用与荧光示踪剂偶联的凝集素对脑（图 6a 和 图 6b）和脊髓（图 6c 和 图 6d）的整个血管系统进行标记4，从而用于研究健康和疾病状态下的血脑屏障（BBB）。
小胶质细胞和星形胶质细胞均与包括阿尔茨海默病和创伤性损伤在内的神经退行性疾病病理过程密切相关14,15。利用3DISCO技术，可研究这些细胞在脊髓（图7）或大脑中的密度与分布情况。
非神经组织也可进行成像。例如，可利用抗体对整个啮齿类动物肺部的克拉拉细胞进行免疫标记，并在单细胞水平上进行无需切片的成像图8。类似地，也可以对细胞进行透明化处理并成像 例如 未切片胰腺组织中的α细胞（图9).
<img alt="组织透明化过程的显微观察；光学透明效应；三维对比可视化。" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig1v2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. 3DISCO 组织透明化技术使未经切片的组织变得透明，从而实现深层组织成像。 未透明化（a）和透明化后（b）的脊髓组织在可见光下的图像。经过透明化处理后，可实现对深层组织的激光扫描显微成像。（c）使用双光子显微镜对未透明化和透明化的脊髓组织进行成像。a、b 中的比例尺 = 0.5 mm，c 中的比例尺 = 100 µm。
<img alt="脑和脊髓结构；显微图像；三维可视化；神经纤维取向分析。" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig2v2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 采用 3DISCO 成像技术追踪脊髓中的轴突延伸。 来自 Thy-1 GFP 转基因小鼠品系（GFP-M）的离体脊髓被切成较小片段（约 4 mm）。按照小组织的透明化方案（表 1）处理后，利用超显微镜对透明化的脊髓进行成像。图中展示了约 4 mm 脊髓节段的三维重建图像，分别为水平面（a）、冠状面（b）和矢状面（c）。d）在灰度透明视图中显示了代表性追踪的轴突（红色）。e）为 d 图中标示区域的高倍放大视图。a、b、c、d 中的比例尺 = 0.5 mm，e 中的比例尺 = 20 µm。
<img alt="三维脑成像，显微镜分析；灰度深度可视化和详细的解剖切片。" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig3v2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 透明化脑组织与海马体的3DISCO成像。 使用超显微镜对GFP-M小鼠的透明化全脑及海马组织进行成像。展示了整个脑组织（a）和海马（b）的三维可视化图像，清晰呈现了透明组织中的神经元网络结构。a中的比例尺 = 2 mm，b中的比例尺 = 20 µm。
<img alt="双光子与共聚焦成像对比；显微成像结果；组织结构可视化；包含比例尺。" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig4v2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. 组织透明化可提高双光子和共聚焦显微镜的成像分辨率。 来自 GFP-M 小鼠的透明化脊髓节段，通过双光子显微镜（a）或共聚焦显微镜（b, c）成像。可见透明化显著改善了分辨率和成像深度，从而揭示出轴突和树突的精细结构。图 a 中的比例尺 = 100 µm，图 b、c 中的比例尺 = 20 µm。
<img alt="神经网络结构分析、显微图像；神经元形态、高分辨率细节。" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig5v2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 5"> 
图 5. 树突棘的 3DISCO 成像。 来自 GFP-M 小鼠的透明化脑组织通过多光子显微镜成像。扫描皮层区域的三维可视化图像以垂直（a）和水平（b）视角展示。（c）来自（a、b）中标记层面的约 50 µm 投影。（d）（c）中标记区域的高倍放大图像，显示神经元结构的精细细节，包括树突棘（箭头）。标尺：a = 50 µm，b、c = 25 µm，d = 5 µm。
<img alt="大脑和脊髓血管系统的三维重建；投影图像显示了详细的血管网络。" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig6v2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图6"> 
图6. 血管系统的3DISCO成像。 为标记整个器官中的血管，如文献16所述，在灌注阶段（透明化前）使用了荧光素标记的凝集素（lectin-FITC）染料。值得注意的是，我们发现示踪剂经尾静脉注射相比心脏灌注能获得更强的信号。固定后的大脑和脊髓组织采集完成后，经透明化处理并使用超显微镜成像。全鼠脑血管系统的三维可视化图显示为热图（a）和灰度图（a'）；（b）为鼠脊髓节段血管系统的三维可视化图，分别以热图（c）和灰度图（d）呈现。热图基于凝集素染色强度生成，蓝色表示低强度（背景），红色表示高强度（血管结构）。图a中的比例尺为2 mm，图b为1 mm，图c和d为250 µm。
<img alt="CX3CR1-GFP 小鼠中小胶质细胞和星形胶质细胞的三维重建；透明化视图与投影分析。" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig7v2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 7"> 
图 7. 透明化 CNS 组织中胶质细胞的 3DISCO 成像。 表达 GFP 的转基因小鼠（小胶质细胞表达 TgH(CX3CR1-EGFP)，星形胶质细胞表达 TgN(hGFAP-ECFP)）的脊髓组织经透明化处理后，采用多光子显微镜成像。小胶质细胞的三维重建以表面体积可视化呈现（a）和透明视图呈现（b）。（c）光学投影（约 50 µm）展示了脊髓中小胶质细胞的细节。星形胶质细胞的三维重建以表面体积可视化呈现（d）和透明视图呈现（e）。（f）光学投影（约 50 µm）展示了脊髓中星形胶质细胞的细节。图 a、b、d、e 中的比例尺 = 100 µm，图 c、f 中的比例尺 = 50 µm。
<img alt="全肺抗体标记；三维重建与投影；Clara细胞可视化；显微镜观察。" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig8v2highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图8"> 
图8. 经抗体标记Clara细胞的整装肺叶的3DISCO成像。 对肺叶进行整装抗体标记时，使用PBS经右心室灌注10周龄BALB/C雌性小鼠，以清除肺部血液。随后用4%多聚甲醛（PFA）充气膨胀肺组织，并在室温下用至少三倍于组织体积的固定液固定过夜。次日，将肺组织用PBS短暂漂洗，取右肺叶置于5 ml含1% Triton X-100的PBS中进行通透处理，持续48小时或直至组织沉底。所有染色步骤均在含5% FBS和2% BSA的0.2% Triton X-100 PBS溶液中进行，漂洗则使用含0.2% Triton X-100的PBS。抗CC10抗体染色在4 °C下持续72小时，随后进行充分漂洗约6小时。一抗的荧光标记通过在4 °C下使用Alexa Fluor-594标记的抗山羊二抗避光孵育过夜实现，随后漂洗6小时至过夜。次日，将染色后的肺叶依次在50%、70%和80%四氢呋喃（THF）中各透明化30分钟，再在100% THF中漂洗三次，每次30分钟，接着在二氯甲烷（DCM）中处理20分钟，最后在二苯醚（DBE）中处理30分钟。图a和b中的标尺=1 mm，图c中标尺=100 µm。
<img alt="显示tdTomato表达的胰腺3D重建荧光图像；显微镜结果。" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig9v2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图9"> 
图9. 胰腺的3DISCO成像。 按照上述实验方案对小鼠进行灌注后，分离胰腺并采用短时程方案进行透明化处理。荧光信号来源于ROSA26 LSL tdTomato的重组表达，该重组由他莫昔芬诱导，在携带包含内源性小鼠胰高血糖素基因座（200 kb BAC转基因）且在胰高血糖素ATG位点插入CreERT2的小鼠中发生。箭头指示胰岛中部分被荧光标记的α细胞。a、b和c中的比例尺 = 1 mm，d中的比例尺 = 500 µm。
<img alt="不同组织类型的透明化方案表格；步骤包括 THF、DCM 等溶液；持续时间。" src="/files/ftp_upload/51382/51382table1v3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="表 1"> 
表 1. 不同组织的组织透明化方案。针对不同组织类型的透明化方案示例。请注意，各步骤的透明化时间可根据需要适当缩短或延长，以优化透明效果。小型组织的近似重量为 ~20–100 mg，脑组织为 ~300–500 mg。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51382/51382table1.jpg" target="_blank">请点击此处查看本表的高清版本。</a>

为了获得大组织内荧光标记细胞的高分辨率图像，理想情况下应无需切片即可对生物样本进行成像。3DISCO 是一种基于有机溶剂逐步孵育的简便组织透明化方法。经过透明化处理后，器官变得透明，从而可对样本进行完整的激光扫描。

通过3DISCO技术在细胞水平上对完整生物系统进行成像

组织透明化及对透明器官进行后续成像，是一种在完整组织中以三维形式分析荧光标记细胞和分子的有力方法……

以下实验的总体目标是对荧光标记的完整生物样本进行成像，而无需进行组织学切片。该目标通过将固定后的组织依次浸入有机溶剂中孵育，直至实现完全透明来达成。第二步。利用激光扫描显微镜对透明化组织进行三维成像。随后，分析成像结果，即可基于采集的三幅离散图像，在未切片的脊髓和脑组织中重建神经元结构的三维形态。该方法有助于解答神经科学领域中的关键问题，例如如何绘制全脑和全脊髓的神经元及GAL连接图谱。该技术的应用前景可拓展至神经退行性疾病的治疗，因为现在我们能够可视化整个神经系统中的神经完整性。尽管该方法可揭示神经系统的组织结构，但也可应用于其他器官，例如肺或肿瘤组织。一旦掌握，该技术对于脊髓或肺等较小器官仅需数小时，而对于大脑则大约需要一到两天。开始操作时，为每份采集的组织准备一个玻璃小瓶，并向其中加入两到三毫升新配制的50% THF。然后将固定的器官转移至透明化溶液中，并 tightly 封闭管子。将管子置于旋转仪上，并用铝箔包裹，以恒定的 30 RPM 速度搅拌样品适当的时间。随后移除透明化溶液，并使用新的聚乙烯管或移液器将组织悬浮于下一种溶液中。如最终透明步骤的表格所示，将样品保留在溶液中，直至其完全透明，以便进行双光子或共聚焦显微镜观察。一旦完成完全透明，立即将样品固定于成像载玻片上，并使用牙科水泥在组织周围建立边界。在牙科水泥完全变硬之前，立即用最终透明化溶液填充样品池，然后迅速将透明化后的样品置于样品池中央，并盖上盖玻片。轻轻按压盖玻片，直至牙科水泥完全密封，且盖玻片与透明化器官表面紧密接触，以便进行光片显微成像。一旦完成透明化，应立即安装样品，并手动旋转样品架上的螺丝以固定样品。随后，将样品浸入已注入适用于成像组织的最终透明化溶液的光片显微镜成像腔中。然后采集覆盖整个透明化组织的Z轴扫描图像，针对感兴趣区域进行放大，以显微镜所能提供的最佳分辨率采集更高分辨率的图像。图像采集完成后，使用Amira软件中的resolve RT模块载入图像序列。图像序列载入后，在图像读取参数窗口中输入正确的体素尺寸，然后点击确定。接下来，选择多平面视图子应用程序。然后使用主滑块和厚度滑块选择最佳的投影厚度和灰度值阈值。最后，使用裁剪角落模块在不同的三维方向上浏览切片。为了可视化样本，绘制神经元的结构组织图对于理解其在健康和疾病状态下的功能至关重要。尽管三种透明化方法可应用于多种器官，但它们在追踪脊髓和大脑中的长距离神经元连接时尤为有用。例如，利用超显微成像技术对大范围透明化处理的脊髓节段进行扫描，可以在啮齿类动物脊髓中连续追踪轴突连接达数厘米，如图中所示。以类似方式，可以对整个透明化的小鼠脑和海马体进行成像，以追踪大脑中的神经元连接。当使用共聚焦显微镜或多光子显微镜时，成像分辨率可显著提高，尤其是在Z轴方向上。例如，对来自GFPM品系小鼠的透明化脊髓进行多光子成像，可在整个1.5至2毫米深度的脊髓范围内实现无缝图像。 对透明化脊髓进行共聚焦显微镜成像，同样可获得更高的分辨率。利用双光子显微镜对透明化脑组织进行成像，能够提供极高分辨率的图像，用于观察神经元结构的精细细节，包括树突棘。三种DISCO透明化样品可通过多种方式进行标记。例如，可以使用与荧光示踪剂偶联的凝集素来标记脑和脊髓的整个血管系统，从而用于研究健康和疾病状态下的血脑屏障。利用三种DISCO透明化技术，还可以对大组织中的微小细胞进行成像。例如，小胶质细胞和星形胶质细胞均被广泛认为与神经退行性病变的病理过程密切相关，包括阿尔茨海默病和创伤性损伤。利用三维透明化技术，可以研究脊髓中神经元的密度和分布情况。非神经组织也可进行成像。例如，可对整个啮齿类动物肺部的克拉拉细胞进行免疫标记，并在单细胞水平上无需切片直接成像。同样，也可以对未经处理的胰腺组织中的细胞进行透明化和成像。例如，在这些胰腺图像中，经过透明化处理后对荧光标记的α细胞进行成像。该方法的可视化演示非常重要，因为尽管透明化和成像步骤较为直接，但数据分析可能较为复杂。在实施该操作过程中，一旦组织完全透明，应尽快对清晰的组织进行成像，因为荧光信号在透明溶液中会随着时间推移而逐渐降解。该技术的发展为研究人员探索精细结构和完整器官（例如绘制大脑中的神经元网络）铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分掌握如何对完整器官中的细胞及亚细胞结构进行透明化处理和成像，并进一步对其进行可视化与分析。

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科研

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Neuroscience

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