核苷三磷酸——从合成到生化表征

本视频的总体目标是演示从修饰核苷酸的合成到其完整生物化学表征的全过程。首先，通过四步一锅法将适当保护的核苷前体转化为相应的三磷酸化合物，以实现这一目标。第二步是通过沉淀法初步纯化所得的三磷酸产物，随后采用反相高效液相色谱法进行进一步纯化。

接下来，通过核磁共振（NMR）和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）对三磷酸类似物进行表征，以确保其高纯度。最后一步是引物延伸反应和末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）聚合反应。最终，通过凝胶电泳分析反应产物，从而评估三磷酸类似物的底物接受能力。

与Borge法等其他合成策略相比，该方法的优势在于副产物较少，因此纯化过程更为简便。通常，初学者会感到该技术较为困难，因为这是一个相当耗时且复杂的流程，需要具备多个领域的知识。当我们首次合成修饰磷酸盐并发现难以找到详细操作步骤时，便萌生了将该方法拍摄成视频的想法。

该方法的另一个优势在于，它可用于解决核酸修饰领域的其他问题。事实上，该方法可用于筛选能够催化多种反应的DNA酶。此外，该方法还可用于核酸的功能标记。

该方法的可视化演示至关重要，因为三磷酸盐是极性且具有活性的衍生物，操作时必须格外小心，其合成与纯化步骤难以掌握。首先，将适当保护的3'羟基核苷与2毫升无水嘌呤共蒸发两次，然后在真空下干燥过夜。同时，在第二天前将三乙胺焦磷酸盐在真空下干燥过夜，随后将核苷溶解于最少体积（200微升）的干燥吡啶中。

然后加入 400 µL 无水二氧六环作为共溶剂。最后加入环状磷三衍生物，并在室温下反应 45 分钟。接下来，将无水焦磷酸丁铵溶解于 170 µL 无水二甲基甲酰胺和 58 µL 新蒸馏的三丁胺中，配制成溶液。

将所得溶液加入反应混合物中，在室温下反应45分钟。然后配制160微摩尔碘的溶液，溶剂为980微升嘌呤和20微升水。将该溶液加入反应混合物中。

为了氧化α位磷中心，将所得深色溶液在室温下搅拌30分钟。用10%的硫代硫酸钠水溶液淬灭过量的碘。

在减压条件下除去溶剂。然后加入5毫升水，在室温下静置混合物30分钟，以水解环状三磷酸基团。在此阶段，通常会去除保护基。

随后，向粗品样品中加入30%的氢氧化咪达唑仑。室温下搅拌1.5小时，然后在减压条件下除去溶剂。接着，加入2毫升水，并将混合物分装至若干离心管中。

加入12毫升2%的过氯酸钠丙酮溶液，离心30分钟，然后重复该操作一次。从三磷酸盐合成过程中所用的试剂将沉淀形成油状残渣，从而实现溶剂的分离，因此在油状残渣经空气干燥后，可显著简化后续的反相高效液相色谱纯化步骤。

按照标准操作程序对粗产物样品进行磷-31核磁共振（P 31 NMR）谱图测定。核磁共振测定完成后，将油状残留物溶解于4毫升蒸馏水中。根据文本方案所述，开始高效液相色谱（HPLC）纯化：以超纯水配制50毫摩尔三乙基碳酸氢铵作为EENT A，以50%乙腈配制三乙基碳酸氢铵作为EENT B。将两种EENT溶液在减压条件下搅拌脱气20分钟。

通过将10微升粗三磷酸溶解于300微升蒸馏水中来制备分析样品。然后使用在40分钟内从0%B到100%B的梯度，将样品注入配备半制备型反相C18柱的高效液相色谱系统中。

根据三磷酸和二磷酸的保留时间调整高效液相色谱程序。使用这些条件纯化粗混合物，弃去可能含有二磷酸的早期馏分，合并所有含有目标产物的馏分并进行冷冻干燥。随后与超纯水多次共蒸发。

通过核磁共振（NMR）和标准实验方法检测三磷酸的纯度。采用本方案获得的典型产率范围为30%至70%，具体取决于5′端引物标记所用的底物。按照文本方案中详述的比例混合引物和试剂，并在37摄氏度下孵育标记反应30分钟。

在标记反应期间，用硅化玻璃棉堵塞一支1毫升移液枪头，并在枪头中填充G 10溶液，以制备G 10 cidex层析柱。以500微升双蒸水离心洗涤三次，最后用50微升双蒸水进行一次终末洗涤。标记反应孵育结束后，在70摄氏度加热10分钟以灭活激酶。

接下来，将反应混合物通过G 10柱。为去除游离的放射性标记物，采用压碎浸泡法纯化放射性标记的引物，并通过乙醇沉淀及G 10脱盐法回收洗脱的寡核苷酸。在引物延伸反应中，将1 PICA摩尔的放射性标记引物、P1 10 PICA摩尔的引物P1和10 PICA摩尔的模板T1加入10×反应缓冲液中，然后置于热水中孵育。

然后在45分钟内逐渐冷却至室温。将离心管置于冰上，加入核苷酸磷酸或dNTP混合物以及一单位的DNA聚合酶（冰上操作）。加水补足反应体系至总体积20 µL，在酶的最适工作温度下孵育反应体系。

然后加入20 µL终止液，将样品在95 °C下加热5分钟。将样品冷却至0 °C。在进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳之前完成上述步骤。

使用磷光成像仪观察TDT聚合反应的条带。在1微升TDT缓冲液中稀释单链未标记引物P2和放射性标记引物。将反应管置于冰上，加入dNTP混合物和TDT聚合酶，然后在37摄氏度孵育1小时。孵育结束后，加入10微升终止溶液，随后将样品在95摄氏度加热5分钟，再降温至0摄氏度。

通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品后，使用磷成像仪观察条带。此处显示的是修饰核苷三磷酸（dNTP）的典型粗品磷-31核磁共振（NMR）谱图，其中可观察到磷原子中心的特征信号。此外，还可观察到来自二磷酸和单磷酸副产物的信号。

在此阶段总是会观察到产物以及更高阶的磷酸盐。此处展示了粗混合物的反相高效液相色谱分析结果。主峰对应于5′-磷酸盐，而主要副产物5′-二磷酸盐的保留时间略短。

最后，经过充分的反相高效液相色谱纯化后，通过核磁共振（NMR）和基质辅助激光解吸电离质谱（MALDI）对修饰的dNTP进行表征。此处展示的是磺酰亚胺修饰的dUTP类似物的MALDI质谱图。在质荷比712.54处可观察到钠加合物峰，且未检测到二磷酸盐的痕迹。磷-31核磁共振（P 31 NMR）和质子核磁共振（¹H NMR）谱图对于评估修饰dNTP的纯度均至关重要。

由于不需要的染料和单磷酸盐的存在会产生明显的信号，因此在此展示了使用反式脯氨酸修饰的dUTP、组胺修饰的dATP以及戊酸修饰的dCTP进行的初级延伸反应结果，这些修饰核苷酸被单独使用、两两组合使用，或三者联合使用，并同时加入一种天然的dGTP。最后，通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析了TdT介导的聚合反应，其中以不同修饰的dUTP类似物为底物。在此背景下，顺式脯氨酸修饰的dUTP和肽修饰的dUTP是TdT最适的底物。

由于末端转移效率相当或超过天然 dTTP，因此尿素修饰的 dUTP 在此背景下是一种较差的底物。一旦掌握，若操作得当，该技术可在大约一周内完成，此时可观察到较少的多分散性、较长的寡核苷酸。在进行该操作时，需要注意核苷三磷酸是自然界中的活化结构单元，因此在处理这些物质时应格外小心。

核酸领域的研究人员使用该方法探索组合筛选，以生成修饰的适体和催化性核酸。观看本视频后，您应能充分理解如何通过四步一锅法合成并表征修饰的磷酸酯，随后进行反相高效液相色谱纯化和引物延伸反应。一些通常在实验部分中不易察觉的实验细节也将变得清晰明了。

该方法可与其他技术（如 PCR）结合使用，以回答更多问题。事实上，它可用于评估修饰的三磷酸核苷与体外筛选方法的兼容性。