核苷三磷酸 - 从合成到生化特征
April 3rd, 2014
本文所描述的协议旨在解释和删节的复杂路线导致修饰的三磷酸核苷的方法的许多障碍。因此，该协议有利于激活这些构建模块两者的合成及其可用性的实际应用。
本视频的总体目标是演示从合成修饰的核苷磷酸盐到其完整的生化表征的过程。这是通过首先通过应用四步一锅程序将适当保护的核苷前体转化为相应的三磷酸盐来实现的。第二步是首先通过沉淀纯化所得的三磷酸盐，然后通过反相高效液相色谱法。
接下来，通过核磁共振和基质辅助激光解吸飞行时间或 NMR 和 maloff 来表征三磷酸盐类似物，以确保高纯度。最后一步是引物延伸反应和末端脱氧核苷酸转移酶或 TDT 聚合反应。最终，通过凝胶电泳分析反应产物，从而分析三磷酸盐的底物接受度。
与 Borge 方法等其他合成策略相比，这种方法的优势在于形成的副产物更少，因此更容易纯化。一般来说，刚接触这项技术的人会很挣扎，因为这是一个相当漫长而复杂的过程，需要多个领域的知识。当我们合成改性磷酸盐时，我们第一次想到了将这种方法拍摄下来的想法，并发现找到一个详细的程序相当具有挑战性。
这种方法的另一个优点是它可以用来解决修饰核酸领域的其他问题。事实上，它可用于选择催化广泛反应的 DNA 酶。此外，该方法可用于核酸的功能标记。
这种方法的可视化演示至关重要，因为合成和纯化步骤很难学习，因为三磷酸盐是极性和活化衍生物，必须小心处理。首先，将适当的三引生羟基保护核苷与 2 毫升无水嘌呤共蒸发两次，然后在真空下干燥过夜。同时，干燥法庭焦磷酸铵在第二天真空过夜，将核苷溶解在至少 200 微升的干燥吡啶中。
然后加入 400 微升干燥的二恶烷作为 COS 溶剂。最后，加入环状磷三元物，使其在室温下反应 45 分钟。接下来，在 170 微升干燥的二甲基甲酰胺和 58 微升新鲜蒸馏的三丁基胺中制备干燥的焦磷酸丁基铵溶液。
将所得溶液加入反应混合物中，使其在室温下反应 45 分钟。然后制备 160 微摩尔碘在 980 微升嘌呤和 20 微升水中溶解的溶液。将溶液加入反应混合物中。
为了氧化 α 磷中心。让所得深色溶液在室温下搅拌 30 分钟。用 10% 硫代硫酸钠水溶液淬灭过量的碘。
在真空下去除溶剂。然后加入 5 毫升水，让混合物在室温下静置 30 分钟，以水解环状三磷酸盐。在此阶段，通常会删除保护组。
因此，向粗样品中添加 30% 氢氧化氢铵。在室温下搅拌 1.5 小时，然后在真空下去除溶剂。接下来，加入 2 毫升水，将混合物分成管中。
加入 12 毫升 2% 的每氯酸钠溶液的丙酮溶液，离心 30 分钟，然后重复该过程。再来一次。用于合成三磷酸盐的试剂将沉淀形成油性残留物并允许溶剂分离，从而在油性残留物风干后大大简化了随后的反相 HPLC 纯化。
根据标准程序记录粗样品的 P 31 NMR 波谱。NMR 后，将油性残留物溶解在 4 毫升蒸馏水中。开始 HPLC 纯化，在超纯水中制备 50 毫摩尔碳酸氢三乙基铵（EENT A）和 50% 乙酰腈（eent B），如文本方案中所述，在真空下对 EENT 进行脱气并搅拌 20 分钟。
通过将 10 微升粗磷酸三酯溶解在 300 微升蒸馏水中来制备分析样品。然后在 40 分钟内使用 0% B 至 100% B 的梯度。将样品注入配备有半制备反相 C 18 色谱柱的 HPLC 系统中。
根据三磷酸盐和二磷酸盐的保留时间调整 HPLC 程序。使用这些条件纯化粗混合物，并去除可能含有一些二磷酸的早期馏分，混合所有含有该产品的馏分并冷冻干燥。然后与超纯水共蒸发数次。
通过 NMR 评估三磷酸盐的纯度，并通过应用标准方案评估 maloff。通过应用该方案获得的典型产量在 30% 至 70% 的范围内，具体取决于五个引物的底物和引物的标记。按照文本方案中的详细说明混合引物和试剂，并在 37 摄氏度下孵育标记反应 30 分钟。
在标记反应过程中，用硅脂玻璃棉塞住 1 mL 移液器吸头，然后用 G 10 溶液填充吸头，以制备 G 10 cidex 色谱柱。离心并用 500 微升双蒸水洗涤 3 次，然后用 50 微升双蒸水最后一次洗涤。标记反应孵育后，在 70 摄氏度下加热使激酶失活 10 分钟。
接下来，将反应混合物通过 G 10 运行。为了去除游离放射性标记凝胶，纯化放射性标记的引物，并通过应用粉碎和浸泡方法进行回收，乙醇沉淀和 G 10 对逃避的寡核苷酸进行脱盐。对于引物延伸反应，将 1 个 PICA 摩尔放射性标记引物、P 1 个 10 个 PICA 摩尔引物、P 1 和 10 个 PICA 摩尔模板、T 1 在 10 x 反应缓冲液中混合，然后跪在热水中。
然后在 45 分钟内逐渐冷却至室温。将试管放在冰上，加入磷酸核苷或 DNTP 混合物和一个单位的 DNA 聚合酶冰。用水完成反应，总体积为 20 μL，在酶的最佳工作温度下孵育。
然后加入 20 微升终止液，在 95 摄氏度下加热样品 5 分钟。凉爽，样品降至零摄氏度。通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离之前。
通过磷酸化成像仪可视化用于 TDT 聚合的条带，在 1 μL TDT 缓冲液中稀释单链未标记引物 P 2 和放射性标记引物。将试管放在冰上，加入 DNTP 混合物和 TDT 聚合酶，然后在 37 摄氏度下孵育 1 小时。孵育后，加入 10 微升终止液，然后在 95 摄氏度下加热样品 5 分钟，然后在 0 摄氏度下冷却。
通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品后，使用磷酸化成像仪观察条带。这里显示的是改性 DNTP 的典型粗 P 31 NMR 谱图，其中可以观察到磷中心的特征信号。此外，来自二磷酸盐和单磷酸盐侧的信号。
在这个阶段总是观察到产品以及较高的磷酸盐。粗混合物的反相 HPLC 分析如图所示。主峰对应于五次引头磷酸盐，而主副产物五次引头二磷酸盐的保留时间略短。
最后，经过彻底的反相、HPLC 纯化后，改性的 DNTP 通过 NMR 和 maldi 表征，这里显示的是磺胺、改性 DUTP 类似物的马洛夫光谱。在 712.54 的质量过充时可以看到钠加合物，并且不存在微量的二磷酸盐。P 31 NMR 和质子 NMR 波谱对于评估改性 dps 的纯度至关重要。
由于不需要的染料和单磷酸盐的存在给出了独特的信号，以下是反式脯氨酸修饰的 DUTP 组胺修饰的 DATP 和戊酸修饰的 DCTP 的初级延伸反应的结果，作为两种修饰的 DN dps 的组合作为单独修饰，或与单独的天然 DGTP 一起使用。最后，用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析了与不同修饰的 DUTP 类似物的代表性 TDT 介导的聚合反应。在这种情况下，顺式脯氨酸修饰的 DUTP 和肽修饰的 DUTP 是 TDT 的最佳底物。
由于拖尾效率与天然 DTTP 相当或更高，因此尿素改性 DUTP 在这种情况下是一种相当差的底物。由于多分散性小，可以观察到较长大小的寡核苷酸一旦掌握，如果作得当，这项技术可以在大约一周内完成。在尝试此程序时，重要的是要记住，核磷酸盐是自然界的活化组成部分，因此在创建后处理它们时应小心。
核酸领域的研究人员使用这种方法来探索组合选择以产生修饰的 abers 和催化核酸。观看此视频后，您应该对如何使用四步一 pop 程序合成和表征改性磷酸盐，然后是反相 HPLC 纯化和初级延伸反应。一些通常在实验部分找不到的实验细节将变得明显。
该方法可与 PCR 等其他技术结合使用，以回答其他问题。事实上，它可用于评估改性三磷酸盐与 VIO 选择方法的相容性。
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概述
本协议概述了修饰核苷三磷酸的合成和表征。它提供了一种全面的方法来克服其生产和应用中的挑战。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物化学
- 核酸化学
- 分析化学
背景
- 修饰核苷三磷酸对于各种生化应用至关重要。
- 在其合成和纯化中存在挑战。
- 表征对于确保其适用于实验至关重要。
- 本协议旨在简化这些过程。
研究目的
- 有效合成修饰核苷三磷酸。
- 通过高纯度纯化合成的化合物。
- 使用先进技术表征化合物。
使用的方法
- 从核苷前体开始，四步一锅合成三磷酸。
- 通过沉淀和反相高效液相色谱纯化。
- 使用核磁共振（NMR）和质谱辅助激光解吸/电离飞行时间（MALDI-TOF）进行表征。
- 通过凝胶电泳分析反应产物。
主要结果
- 成功合成了修饰核苷三磷酸。
- 通过有效的纯化方法实现高纯度。
- 表征确认了化合物的结构完整性。
- 功能分析证明了在聚合反应中的底物接受性。
结论
- 本协议提供了一种可靠的方法来合成修饰核苷三磷酸。
- 表征确保化合物适合进一步的生化应用。
- 这种方法可以促进核酸化学的研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Efficient synthesis and rigorous biochemical characterization of modified nucleoside triphosphates (dNTPs) are critical for enabling advanced nucleic acid engineering and functional tagging in early discovery pipelines. This protocol addresses key bottlenecks in producing high-purity, functionally validated dNTP analogs, supporting mechanistic de-risking and predictive confidence for downstream applications. The approach enhances portfolio flexibility by facilitating the generation and assessment of novel nucleic acid tools for chemical biology and enzymatic selection workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of nucleic acid modifications for functional impact in enzymatic reactions.
- Supports biological de-risking by confirming substrate acceptance in primer extension and TdT polymerization assays.
- Facilitates predictive confidence in the use of modified dNTPs for combinatorial selection and catalytic nucleic acid generation.
Screening & Assay Development
- Provides validated, high-purity dNTP analogs for robust assay development and screening workflows.
- Ensures reproducibility and quantitative output through standardized synthesis and purification protocols.
- Enables reliable evaluation of modified nucleotides in polymerase and tailing assays, supporting platform scalability.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling functional tagging and tracking of nucleic acids.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by providing well-characterized building blocks for nucleic acid-based tools.
- Reduces risk in advancing modified nucleic acid candidates by ensuring biochemical compatibility and purity.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates from early discovery through assay development, supporting lead identification and preclinical tool validation where modified nucleic acids are required.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on the functional consequences of nucleotide modifications in enzymatic systems.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible dNTP analogs for high-confidence screening and selection workflows.
- Analytics: Provides quantitative NMR, MALDI-TOF, and gel electrophoresis outputs for rigorous condition comparison.
- Translational Research: Enables functional tagging and tracking of nucleic acids in disease-relevant systems when supported by downstream applications.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, standardized protocol for generating diverse modified dNTPs across multiple R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in nucleic acid modification studies.
- Operational Value: Standardizes synthesis and characterization, improving reproducibility and scalability across teams.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions for nucleic acid tool development and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of modified nucleic acid candidates.
Implementation Considerations
- Requires multidisciplinary expertise in synthetic chemistry, analytical characterization, and enzymology.
- Demands access to advanced instrumentation such as NMR, HPLC, and MALDI-TOF for quality control.
- Necessitates cross-team standardization of protocols for reproducible outputs.
- Adaptation may be needed for different nucleoside substrates or enzymatic systems.
- Handling of activated triphosphates requires careful technique to avoid degradation or contamination.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:30
Synthesis of the Modified Nucleoside Triphosphates
5:56
HPLC Purification of the Modified Nucleoside Triphosphates
7:40
Primer Extension Reactions and TdT Polymerizations
11:05
Results: Biochemical Characterization of Nucleoside Triphosphates
14:02
Conclusion
