Name: 核苷三磷酸 - 从合成到生化特征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-03T16:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 22 s
Description: 学习修饰核苷三磷酸的四步一锅法合成与纯化技术，通过反相高效液相色谱、核磁共振和MALDI-TOF进行表征，并利用引物延伸反应验证底物活性。该方法为核酸化学研究提供可靠的技术支持。

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本工作由瑞士国家科学基金会（项目编号 n&deg; PZ00P2_126430/1 和 PZ00P2_144595）。感谢 C. Leumann 教授提供实验室空间和设备，以及持续的支持。感谢 Sue Knecht 女士富有成效的讨论。

1. 修饰核苷三磷酸的合成
所选用的合成方法遵循Ludwig和Eckstein开发的方案，因为该方法通常可靠，且产生的副产物极少（图1A）39。
<ol>
	<li>共蒸发适当保护的3’-OAc核苷（&#160;通常&#160;用无水吡啶（2 ml）清洗0.1 mmol样品两次，然后在真空下干燥过夜。同时，将四丁基铵焦磷酸盐（0.13 mmol）在真空下干燥过夜。</li>
	<li>将核苷溶于最少体积的干燥吡啶（0.2 ml）中，加入干燥二氧六环（0.4 ml）作为共溶剂。最后加入2-氯-1,3,2-苯并二氧磷杂环-4-酮（0.11 mmol），室温下反应45分钟。 
	注意：需特别注意2-chloro-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one试剂的处理。事实上，即使将该试剂保存在惰性气体氛围中，也不足以完全防止其分解。因此，分解过程中形成的白色固体可在使用前刮除。</li>
	<li>在干燥的DMF（0.17 ml）中配制焦磷酸三丁基铵溶液，并加入新鲜蒸馏的三丁胺（58 &#181;l；切勿加入分子筛）。将所得溶液加入反应混合物中（会出现白色沉淀，但迅速消失），室温下反应45分钟。</li>
	<li>将碘（0.16 mmol）溶于吡啶（0.98 ml）中，制备溶液2O (20 &#181;l）并加入反应混合物中，以氧化P&#945;(III) 中心。将所得深色溶液在室温下搅拌 30 分钟。</li>
	<li>使用10%的NaS水溶液2O3 以淬灭过量的 I2. 在减压下除去溶剂（旋转蒸发仪水浴的温度必须保持在30℃以下） &#176;C). 加入 H2O (5 ml)，室温下静置30分钟，以水解环状三磷酸基团。</li>
	<li>在此阶段，通常需去除保护基团（即 3'-OAc 和核碱基侧链上的基团）。因此，加入 NH4OH（30% 溶于 H2将10 ml O加入粗产物中，室温下搅拌1.5小时，然后减压除去溶剂。</li>
	<li>加入2 ml H2O并分装至2个管中。加入12 ml 2%的NaClO溶液4 在丙酮中沉淀并离心（1,000 × g）30分钟。此步骤重复一次。该沉淀步骤可使合成过程中使用的溶剂和试剂与三磷酸盐（将发生沉淀）分离，从而显著简化后续的反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化过程。</li>
	<li>油性残留物空气干燥后，记录一个 31粗产物的磷-31核磁共振谱（遵循标准操作步骤，详见材料列表） 图3）并溶于4 ml H2O. 
	注意：本合成方案主要针对修饰脱氧核苷三磷酸的制备，但通过使用2',3'-双保护的核糖类似物，几乎相同的方法也可适用于其RNA对应物的合成。O-乙酰化前体</li>
</ol>
2. 修饰核苷三磷酸的高效液相色谱纯化
<ol>
	<li>1 M 三乙基铵碳酸氢盐（TEAB）储备溶液的制备：40
	<ol>
		<li>配制1摩尔三乙胺（139 ml）的溶液 &#8776; 600 ml 蒸馏过滤 H2O.</li>
		<li>气泡 CO2 （通过干冰和气体鼓泡器）在剧烈搅拌下通入溶液，直至pH达到7.6（此过程至少需要10小时）。该储备液可在冰箱中保存最多一个月。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>纯化：
	<ol>
		<li>从1 M储存液中配制两种缓冲溶液：2 L含50 mM TEAB的超纯水溶液（流动相A）和1 L含50 mM TEAB的50%乙腈溶液（流动相B）。将两种流动相在真空条件下搅拌脱气20分钟（需特别注意避免因去除CO₂而改变pH值）。2 （脱气过程中）。</li>
		<li>通过溶解10 mg样品来制备分析用样品 &#181;l 粗三磷酸盐于 300 &#181;l 蒸馏水2O，并注入配备半制备型反相色谱柱（C18）的高效液相色谱系统，采用0-100% B的梯度洗脱，运行时间为40分钟（图4）。根据 R 调整 HPLC 程序t 三磷酸盐（通常为色谱图中的主峰）和二磷酸盐（其R值略低）t）。使用这些条件纯化粗混合物，并去除可能含有焦磷酸盐的早期馏分。</li>
		<li>将所有含有产物的馏分合并，并进行冷冻干燥（相较于旋转蒸发仪蒸发，冷冻干燥可最大限度地减少不希望产生的焦磷酸水解产物）。用超纯水多次共蒸发（以去除洗脱液中残留的三乙胺）。通过核磁共振（NMR）检测三磷酸产物的纯度（包括 1H 和 31P 核磁共振（P NMR）和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF），采用标准实验方案（参见 图5）。根据底物的不同，采用本方案的典型产率通常在30%–70%之间。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 引物延伸反应与末端脱氧核苷酸转移酶聚合
<ol>
	<li>引物5'端标记
	<ol>
		<li>混合30 pmol的相应引物（例如 P1，材料列表）与 4 &#181;10x 多核苷酸激酶（PNK）缓冲液，3 μl &#181;升 &#947;-[32P]-ATP，1 &#181;PNK 溶液和 ddH₂O2O（总体积为40） &#181;l). 将反应混合物在37℃下孵育 &#176;C，30 分钟，然后使激酶热失活（70 °C，10 分钟） &#176;C）。</li>
		<li>在标记反应过程中，用硅化玻璃棉堵塞1 ml移液枪头末端，并用G10 Sephadex溶液（10% ddH₂O溶液）填充枪头，制备G10 Sephadex柱。2O，经高压灭菌）。离心并用500 &#181;l ddH₂O2O 和最后一次用 50 洗涤 &#181;l ddH₂O2O. 将反应混合物通过G10柱（以去除游离的放射性标记物）。</li>
		<li>凝胶纯化（20% PAGE）放射性标记的引物，并通过压碎浸泡法回收即 用500洗脱 &#181;含1% LiClO的水溶液的升4 和 1 mM NEt3 （pH 8）于 72 &#176;C，15 分钟）。乙醇沉淀并使用 G10 脱盐柱对洗脱的寡核苷酸进行脱盐。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>引物延伸反应
	<ol>
		<li>退火1 pmol的放射性标记引物 P1，10 pmol 引物 P1，以及10 pmol模板 T1 （材料列表）在10x反应缓冲液（由所用聚合酶供应商提供）中，将离心管置于高温（90–95℃）条件下 &#176;C）水，并使其在45分钟内逐渐冷却至室温。</li>
		<li>将试管置于冰上，依次加入dNTP混合液（包含修饰的和天然的三磷酸核苷，100） &#181;M 终浓度）和 1 U DNA 聚合酶（Vent (exo-），克列诺（Klenow）， Pwo 或 9&#176;Nm）并加水至终体积为20 μL &#181;l). 在酶的最适工作温度下孵育（例如 60 &#176;C，30 分钟，当 Vent (exo-）正在被使用。</li>
		<li>加入20 &#181;l 终止液（甲酰胺（70%）、乙二胺四乙酸（EDTA；50 mM）、溴酚蓝（0.1%）、二甲苯青（0.1%）），将样品加热（95℃） &#176;C，5 分钟），冷却（0 &#176;C），并通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。使用磷屏成像仪检测。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>末端脱氧核苷酸转移酶聚合反应
	<ol>
		<li>稀释7 pmol单链未标记引物 P2 （材料列表），1 pmol 带放射性标记的引物，体积为 1 μL &#181;10× 末端脱氧核苷酸转移酶缓冲液</li>
		<li>将试管置于冰上，依次加入dNTP混合物（终浓度在10至200之间） &#181;M）和 TdT 聚合酶（4 U）。37℃孵育 &#176;C 反应 1 小时。加入 10 &#181;加入终止液后，将样品加热至95℃ &#176;C，5 分钟），冷却（0 &#176;C），并通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE 15%）分离，使用磷屏成像仪检测。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 含修饰核苷三磷酸的PCR
<ol>
	<li>将8 pmol的正向引物和反向引物与0.5 pmol待扩增的模板混合，加入10倍反应缓冲液和dNTP混合物（终浓度为200 µM），并将离心管置于冰上。加入1 U DNA聚合酶，用H2O补足至终体积20 µl。将混合物转移至PCR管中，进行30个PCR循环。</li>
	<li>取6 µl产物与6 µl 2倍蔗糖上样缓冲液混合，通过含溴化乙锭染色的2%琼脂糖凝胶电泳分离。使用磷屏成像仪观察结果。</li>
</ol>

无利益冲突声明。

将修饰引入核酸在多种实际应用中具有重要意义，包括反义和抗基因试剂的开发42,43、寡核苷酸的标记与功能标记41，以及扩展遗传字母表的研究44-46。化学修饰和功能基团通常通过标准或自动化的固相合成方法引入核酸中。然而，磷酰胺单体必须能够耐受该方法所施加的较为剧烈的条件，这反过来对化学功能基团的性质造成了严重限制47。相比之下，通过酶促聚合修饰的脱氧核苷三磷酸，可引入更广泛的功能基团，因为其唯一限制是这些修饰核苷酸需能作为聚合酶的底物1,2。尽管目前仍明显缺乏普适性的方法，但针对修饰dNTP的合成，已有可靠且稳健的合成与分析方法被建立。此外，由于其固有性质，修饰的三磷酸化合物对不同的外界条件（例如 pH、温度）较为敏感，因此，提供详细的合成与表征操作流程具有重要意义。
本文所述的工作流程包括修饰脱氧核苷三磷酸（dNTP）的化学合成、反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化、核磁共振（NMR）分析，以及用于这些核苷类似物生化表征的酶学实验。修饰dNTP成功合成与...

5'-核苷三磷酸（(d)NTP）是一类重要的生物分子，参与了从作为通用能量货币到细胞代谢调控等多种过程与功能。除了在这些基本生物学转化中的作用外，其修饰衍生物已发展成为一种多功能且温和的平台，可用于将功能基团引入寡核苷酸中，该方法很好地补充了通常采用的自动化固相合成技术1,2。事实上，只要（d）NTPs能够作为RNA和DNA聚合酶的底物3，就可以将多种功能基团引入寡核苷酸，包括氨基酸4-13、硼酸14,15、降冰片烯16、类金刚烷残基17、有机催化侧链18、胆汁酸19，甚至寡核苷酸本身20。
除了作为核酸功能化的便捷载体外，修饰的dNTP还可用于SELEX及其他相关的组合方法中 体外 修饰型催化核酸生成的筛选方法21-30 以及适用于多种实际应用的适配体10,31-36通过修饰的脱氧核苷三磷酸（dNTPs）聚合引入的额外侧链被认为能够扩大筛选实验中可探索的化学空间，并弥补核酸本身功能基团相对贫乏的不足37然而，尽管这些特性颇具吸引力，且在合成与分析方法的开发方面已取得近期进展，但目前仍不存在一种普适且高产率的制备修饰核苷三磷酸的方法。2,38.
本实验方案的目的是阐明这些活化结构单元的合成及其生化表征过程中（有时）较为复杂的操作步骤（图1B）。我们将特别关注所有在实验部分中常常难以找到或缺失、但对于成功完成合成路径并分离得到纯净的(d)NTPs至关重要的合成细节（图1）。

<table><tbody><tr><td>三丁基铵焦磷酸盐&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8533</td><td>易吸湿固体，需在氩气下保存</td></tr><tr><td>2-氯-1,3,2-苯并二氧磷杂环-4-酮&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>324124</td><td>对湿气敏感</td></tr><tr><td>吡啶</td><td>Sigma Aldrich</td><td>82704</td><td>在分子筛条件下</td></tr><tr><td>二噁烷</td><td>Sigma Aldrich</td><td>296309</td><td>在分子筛下</td></tr><tr><td>二甲基甲酰胺（DMF）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>40248</td><td>在分子筛下</td></tr><tr><td>乙腈&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>HPLC 级</td></tr><tr><td>三乙胺</td><td>Sigma Aldrich</td><td>90342</td><td></td></tr><tr><td>三丁胺</td><td>Sigma Aldrich</td><td>90781</td><td></td></tr><tr><td>ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Milli-Q</td><td></td><td>经二乙基焦碳酸酯（DEPC）处理并高压灭菌的去离子纯化水</td></tr><tr><td>焦碳酸二乙酯（DEPC）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>159220</td><td></td></tr><tr><td>D&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Cambridge Isotope Laboratories, Inc.</td><td>DLM-4-25</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#947;-[&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P]-ATP</td><td>Hartmann Analytics</td><td>FP-301</td><td></td></tr><tr><td>天然 dNTP</td><td>Promega</td><td>U1420</td><td></td></tr><tr><td>Vent (exo-&lt;sup&gt;-&lt;/sup&gt;DNA聚合酶</td><td>NEB</td><td>M0257S</td><td></td></tr><tr><td>DNA聚合酶I大（Klenow）片段</td><td>NEB</td><td>MO210S</td><td></td></tr><tr><td>9&amp;deg;&lt;em&gt;N&lt;sub&gt;m&lt;/sub&gt;&lt;/em&gt; DNA聚合酶</td><td>NEB</td><td>MO260S</td><td></td></tr><tr><td>末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）</td><td>Promega</td><td>M828A</td><td></td></tr><tr><td>Pwo DNA聚合酶</td><td>Peqlab</td><td>01 01 5010</td><td></td></tr><tr><td>T4 PNK</td><td>Thermo Scientific</td><td>EK0032</td><td></td></tr><tr><td>丙烯酰胺/双丙烯酰胺（19:1，40%）</td><td>Serva</td><td>10679.01</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Apollo Scientific</td><td>BIA1177</td><td></td></tr><tr><td>G10 Sephadex</td><td>Sigma</td><td>G10120</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>Apollo Scientific</td><td>BIU4110</td><td></td></tr><tr><td>Jupiter半制备型反相高效液相色谱柱（5&amp;#956; C18 300 &amp;Aring;)</td><td>Phenomenex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gene Q热循环仪</td><td>生物概念</td><td>BYQ6042E</td><td></td></tr><tr><td>PCR 管</td><td>生物概念</td><td>3220-00</td><td></td></tr><tr><td>高效液相色谱系统</td><td>Amersham Pharmacia Biotech</td><td></td><td>&amp;Auml;kta basic 10/100</td></tr><tr><td>所有寡核苷酸均购自Microsynth，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）进行纯化</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5&amp;#039;-CAAGGACAAAATAC&lt;br /&gt;
CTGTATTCCTT &lt;strong&gt;P1&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5&amp;#039;-GACATCATGAGAGA&lt;br /&gt;
CATCGCCTCTGGGCTA&lt;br /&gt;
ATAGGACTACTTCTAAT&lt;br /&gt;
CTGTAAGAGCAGATCC&lt;br /&gt;
CTGGACAGGCAAGGAA&lt;br /&gt;
TACAGGTATTTTGTCCTTG &lt;strong&gt;T1&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5&amp;#039;-GAATTCGATATCAAG &lt;strong&gt;P2&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">有关实验步骤和设备的更多信息可在以下文章中找到：&lt;br /&gt;
&lt;em&gt;Chem. Eur. J.&lt;/em&gt; &lt;strong&gt;2012&lt;/strong&gt;, 18, 13320-13330&lt;br /&gt;
&lt;em&gt;有机与生物分子化学&lt;/em&gt; &lt;strong&gt;2013&lt;/strong&gt;，DOI: 10.1039/C3OB40842F</td></tr></tbody></table>

核苷三磷酸——从合成到生化表征

Nucleoside Triphosphates - From Synthesis to Biochemical Characterization

传统引入化学功能基团的策略是通过固相合成法，将经过适当修饰的亚磷酰胺前体添加到新生链上。然而，该方法在合成过程中所使用的条件以及对较短序列的限制，阻碍了其广泛应用。另一方面，修饰的核苷三磷酸是已活化的结构单元，已被用于在温和条件下将多种功能基团引入核酸分子中，这一策略为修饰核酸在诸多实际应用中的使用开辟了道路，例如功能标记以及核酶和脱氧核酶的构建。其中主要挑战之一在于该方法本身的复杂性，导致这些核苷类似物的分离与表征过程困难。
	
	在本视频文章中，我们详细介绍了一种使用基于磷(III)试剂合成这些修饰类似物的实验方案。此外，还公开了其生物化学表征的具体步骤，特别着重于引物延伸反应和末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）加尾聚合反应。该详细的实验方案将有助于修饰型脱氧核苷三磷酸（dNTP）的制备及其在化学生物学中的进一步应用。

修饰核苷三磷酸是一类极具吸引力的合成目标，因为它们能够方便地将多种功能基团引入核酸中41。然而，这些活化结构单元的分离与表征往往被证明是困难的。因此，本文所示结果被认为有助于指导上述合成与生物化学步骤中的各个操作过程（图1B）。
特别是 图3 显示典型的粗提物 31修饰核苷三磷酸（本例中为 dU）的磷-核磁共振谱BpuTP（4)18, 图2），其中可观察到磷中心的特征信号（即 -5.02 处的一个二重峰（Pγ），在 -10.44 处的一个双峰（Pα）以及在 -20.55 处的三重峰（Pβ）ppm）。此外，此阶段始终可观察到焦磷酸盐（-4.84 和 -10.63 ppm 处的两个双峰）和单磷酸盐（-0.18 ppm 处的单峰）副产物，以及多磷酸盐（-21.02 和 -23.19 p...

本文所述方案旨在阐明并简化通向修饰核苷三磷酸的复杂路径中的诸多障碍。因此，该方案有助于这些活化结构单元的合成及其在实际应用中的可及性。

传统的引入化学功能基团的策略是通过连接经过适当修饰的……来使用固相合成方法。

本视频的总体目标是演示从修饰核苷酸的合成到其完整生物化学表征的全过程。首先，通过四步一锅法将适当保护的核苷前体转化为相应的三磷酸化合物，以实现这一目标。第二步是通过沉淀法初步纯化所得的三磷酸产物，随后采用反相高效液相色谱法进行进一步纯化。接下来，通过核磁共振（NMR）和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）对三磷酸类似物进行表征，以确保其高纯度。最后一步是引物延伸反应和末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）聚合反应。最终，通过凝胶电泳分析反应产物，从而评估三磷酸类似物的底物接受能力。与Borge法等其他合成策略相比，该方法的优势在于副产物较少，因此纯化过程更为简便。通常，初学者会感到该技术较为困难，因为这是一个相当耗时且复杂的流程，需要具备多个领域的知识。当我们首次合成修饰磷酸盐并发现难以找到详细操作步骤时，便萌生了将该方法拍摄成视频的想法。该方法的另一个优势在于，它可用于解决核酸修饰领域的其他问题。事实上，该方法可用于筛选能够催化多种反应的DNA酶。此外，该方法还可用于核酸的功能标记。该方法的可视化演示至关重要，因为三磷酸盐是极性且具有活性的衍生物，操作时必须格外小心，其合成与纯化步骤难以掌握。首先，将适当保护的3'羟基核苷与2毫升无水嘌呤共蒸发两次，然后在真空下干燥过夜。同时，在第二天前将三乙胺焦磷酸盐在真空下干燥过夜，随后将核苷溶解于最少体积（200微升）的干燥吡啶中。然后加入 400 µL 无水二氧六环作为共溶剂。最后加入环状磷三衍生物，并在室温下反应 45 分钟。接下来，将无水焦磷酸丁铵溶解于 170 µL 无水二甲基甲酰胺和 58 µL 新蒸馏的三丁胺中，配制成溶液。将所得溶液加入反应混合物中，在室温下反应45分钟。然后配制160微摩尔碘的溶液，溶剂为980微升嘌呤和20微升水。将该溶液加入反应混合物中。为了氧化α位磷中心，将所得深色溶液在室温下搅拌30分钟。用10%的硫代硫酸钠水溶液淬灭过量的碘。在减压条件下除去溶剂。然后加入5毫升水，在室温下静置混合物30分钟，以水解环状三磷酸基团。在此阶段，通常会去除保护基。随后，向粗品样品中加入30%的氢氧化咪达唑仑。室温下搅拌1.5小时，然后在减压条件下除去溶剂。接着，加入2毫升水，并将混合物分装至若干离心管中。加入12毫升2%的过氯酸钠丙酮溶液，离心30分钟，然后重复该操作一次。从三磷酸盐合成过程中所用的试剂将沉淀形成油状残渣，从而实现溶剂的分离，因此在油状残渣经空气干燥后，可显著简化后续的反相高效液相色谱纯化步骤。按照标准操作程序对粗产物样品进行磷-31核磁共振（P 31 NMR）谱图测定。核磁共振测定完成后，将油状残留物溶解于4毫升蒸馏水中。根据文本方案所述，开始高效液相色谱（HPLC）纯化：以超纯水配制50毫摩尔三乙基碳酸氢铵作为EENT A，以50%乙腈配制三乙基碳酸氢铵作为EENT

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