一种用于从 Drosophila 胚胎中分离蛋白质复合物的 in vivo 交联方法

以下实验的总体目标是利用体内交联方法从活体果蝇胚胎中获取蛋白质复合物。首先将数千只果蝇装入群体饲养笼中并收集早期胚胎，随后使用甲醛对蛋白质进行体内交联，从而稳定其内部的蛋白质复合物。

然后从交联的胚胎中制备蛋白质提取物，以便对蛋白质复合物进行免疫沉淀。通过蛋白质印迹分析鉴定所分离的蛋白质复合物。该技术相较于传统体外方法的主要优势在于，这种体内方法使我们能够捕获短暂但功能重要的蛋白质-蛋白质相互作用，而这些相互作用可能无法通过传统的体外方法检测到。

演示该技术的是来自我实验室的博士后高敏（Min Gao）博士。首先，使用搅拌子将水和果蝇琼脂混合。在高压灭菌程序运行期间对该混合物进行高压灭菌。

将蔗糖加入苹果汁中，并在平板上加热至70摄氏度。随后混合溶液，并在琼脂凝固前静置冷却15分钟。用乙醇配制新鲜的对羟基苯甲酸甲酯。

这是防腐剂。将其加入凝固的混合物中，搅拌五分钟。然后将混合物倒入300平方厘米的塑料或聚苯乙烯板中，避免产生气泡。

将培养皿置于 4 摄氏度保存，并在一周内使用。准备一个含有 40,000 到 50,000 只果蝇的群体培养笼，用于收集胚胎。在群体培养笼上连接两个新鲜的玉米粉糖蜜培养皿，每个培养皿表面撒上约 4 克酿酒酵母。

将果蝇置于这些培养皿中，在 25 摄氏度下饲养 48 小时。两天后，取约 1 克酵母均匀撒在两个苹果汁琼脂培养皿上，并将种群饲养笼中的培养皿更换为这两个加酵母的培养皿。一小时后，再将饲养笼中的培养皿更换为另外两个相同的加酵母培养皿。

将使用一小时的两块收集板上的果蝇胚胎转移至培养皿中。用毛笔辅助，将胚胎和水悬浮并刷下，然后倒入双层筛中过滤。

上层为850微米的钢丝网，下层为75微米的钢丝网。胚胎将收集在较细的筛网上，可用画笔将其与粗大杂质分离。将胚胎转移至由50毫升锥形管顶部制成的细尼龙网篮中。

用清水冲洗胚胎，并在筛网上用纸巾吸干。接着，将胚胎浸入50%的次氯酸钠溶液中3分钟。轻轻摇动使其充分接触漂白液，然后用清水彻底冲洗，并用纸巾吸干。

随后将胚胎浸入异丙醇中约15秒。通过轻轻旋转，可使胚胎团块分散，此过程不应超过30秒。用吸水纸吸干胚胎，然后将其转移至庚烷溶液中孵育5分钟。

反复用庚烷吹打胚胎，以防止胚胎聚集，用吸水纸吸干胚胎后，再用PBST冲洗。冲洗胚胎3分钟后，将胚胎转移至含有10毫升PBST的15毫升离心管中的筛网上。移除筛网，使胚胎留在溶液中，并保留100至300微升的胚胎悬液。

让胚胎沉降至管底，吸去 PBST，立即进行交联处理。首先，向胚胎中加入 10 毫升新配制的含 0.2% 甲醛的 PBST 溶液，在 25 °C 条件下轻轻振荡孵育 10 分钟。

反应10分钟后，让胚胎沉降并移除溶液。然后迅速加入10毫升0.25摩尔的甘氨酸PBST溶液以终止反应。将试管置于摇床上继续震荡5分钟。终止反应后，移除溶液，并用10毫升PBST溶液清洗胚胎3次，每次清洗均使用10毫升PBST。

用移液器吸去剩余的PBST，将胚胎储存于负80摄氏度，直至需要时使用。使用下拉式匀浆器和2毫升裂解缓冲液，对500微升交联的胚胎进行匀浆。使用紧密研磨杵约需15次上下运动。

将裂解液转移至微量离心管中，置于摇床上轻柔振荡15分钟。然后在16,000 ×g 条件下离心5分钟。将上清液转移至15毫升离心管中。

沉淀物可弃去。向上清液中加入40 µL抗HA琼脂糖珠悬液。珠子偶联完成后，将混合物置于摇床上孵育约2.5小时。

在2,500 ×g条件下离心5分钟，使磁珠沉淀。离心后，管中保留约250微升上清液，并将磁珠在此上清液中重悬。将重悬的磁珠转移至装有10微米滤膜的离心柱滤芯上。

以12,000 G离心10秒，去除溶液。用200微升洗涤缓冲液洗涤柱中的珠子，并再次离心。共重复此步骤三次。然后向珠子中加入40微升洗脱缓冲液，在37摄氏度下孵育15分钟。

在此期间，每5分钟轻轻振荡试管一次，以收集流出液。再次在12,000 ×g下离心10秒。通过3%至7%的梯度凝胶进行SDS-PAGE，随后进行蛋白质印迹分析，以检测交联以及交联蛋白复合物纯化的效率。表达HA标签和GFP蛋白的胚胎用于监测交联程度，并测试该方案中不同浓度的甲醛。

大多数经处理的胚胎中的GFP未发生交联，因此不会出现此情况。将随机交联的两个复合物与未交联的对照组进行比较。未发生交联的两种蛋白在285千道尔顿条带处可见，可自由迁移。

交联后的二聚体分子量更大，在粗制蛋白裂解液中的迁移率较低。约一半的二聚体蛋白在体内发生了交联。通过与HA肽比较，洗脱组分中可检测到复合物形式和游离的管蛋白，此结果来自对磁珠洗涤后的洗脱物。

去除SDS后，可获得大部分游离的微管及少量微管复合物。通过此方法，可进一步采用质谱等其他技术，以回答有关方法学的其他问题，例如鉴定分离所得复合物中的蛋白质组分。