Name: 口咽部气管内PAMP管理和支气管肺泡灌洗的利用率来评估小鼠宿主的免疫反应 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-02T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: 了解如何通过口咽部气管内LPS给药和支气管肺泡灌洗技术评估小鼠宿主免疫反应。该方法可分析细胞因子谱和肺组织病理学变化，为研究病原体感染引发的肺部炎症提供高分辨率评估手段。

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作者感谢弗吉尼亚-马里兰区域兽医学院为本项目提供的核心设施与技术支持。本研究由美国国立卫生研究院职业发展奖（K01DK092355）资助。

所有研究均在弗吉尼亚理工学院机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准下进行，并遵循美国国立卫生研究院《实验动物照护与使用指南》。
1. 通过经口咽给药进行脂多糖的气管内（i.t.）接种
<ol>
	<li>使用耳孔、耳标或其他机构批准的方法，确保每只动物具有唯一的标识。</li>
	<li>记录每只动物的基线体重和体温。</li>
	<li>准备LPS的工作液。每只小鼠将接受50 µl剂量的1 mg/kg LPS溶于1×磷酸盐缓冲液（PBS）中。对照处理的动物将接受50 µl的1×PBS。</li>
	<li>使用以下滴入法准备适合的异氟烷给药 chamber。各机构对异氟烷及其他麻醉剂的使用指南有所不同，在开展任何研究之前，相关人员应联系所在机构的动物护理/福利部门，以确保充分满足所有规定。若滴入法使用异氟烷不可行，则可采用其他麻醉剂作为替代方案。
	<ol>
		<li>在合适的安全柜内，将约3 ml&#160;异氟烷滴加至一张折叠的吸水纸巾上，并将其置于500 ml烧杯底部。</li>
		<li>将一小片铝箔放置在纸巾上方，并用透明盖子盖住烧杯。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备将在经气管接种过程中使用的工具和试剂。在插管架上安装用于固定动物头部的橡皮筋。该操作需要准备一对直头镊子、一对弯头或弧形镊子，以及一支配有吸头的p200移液枪。</li>
	<li>将50 µl LPS吸入移液枪吸头中，并放置在插管架旁易于取用的位置。</li>
	<li>将小鼠放入异氟烷 chamber 中，并用透明盖子盖上 chamber 以实施麻醉。观察动物的呼吸模式，刚放入 chamber 时呼吸会较快且浅表。当呼吸频率接近每2秒一次呼吸时，表明动物已达到充分麻醉状态，通常在放入 chamber 后30秒内达到此状态。&#160;应按照批准的动物实验方案中规定的滴入法使用异氟烷进行麻醉。</li>
	<li>从 chamber 中取出已麻醉的小鼠，并将其前门齿悬挂在插管架上。确保动物被牢固固定，且口腔和舌头易于接触。</li>
	<li>用直头镊子轻轻固定舌头，再用弯头镊子夹住舌头并轻柔向外拉出，直至感到轻微阻力。此操作足以阻塞会厌，从而暴露气管。</li>
	<li>在保持舌头伸展的同时，将50 µl LPS溶液注入咽后部，并立即用戴手套的手指堵住动物的鼻孔。LPS在咽后部可见，直至小鼠开始吸气将其吸入。</li>
	<li>继续堵住鼻孔并保持舌头伸展状态，持续5-10次额外呼吸。</li>
	<li>将小鼠从插管架上取下，并放回新的笼子中，直至其从麻醉中恢复。</li>
	<li>监测与疾病进展相关的替代指标。在整个研究期间，应每4-8小时监测一次体重和体温。同时，评估与发病率升高相关的行为特征和临床症状。</li>
	<li>为评估疾病进展，在LPS暴露后的特定时间点处死小鼠并采集样本。LPS暴露后典型的采样时间点包括0、6、12、18、24和48小时。为评估恢复情况和存活率，应在接种后连续观察小鼠7天。</li>
</ol>
2. 血清和支气管肺泡灌洗液（BALF）的采集
<ol>
	<li>采用机构批准的方法处死小鼠。</li>
	<li>将动物仰卧位放置，并固定于解剖板上，解剖板高度建议为 0.5 英寸（1.27 厘米）。</li>
	<li>用 70% 乙醇润湿整只小鼠。</li>
	<li>使用带 27 G 针头的 1 ml 注射器，在进行任何切口前实施心脏穿刺。应可从小鼠体内抽取 500–800 µl 全血。</li>
	<li>将针头从注射器上取下，将全血转移至预先标记的 1.5 ml 微量离心管中。若用于血清收集，需在室温下使全血凝固至少 30 分钟。除血清收集外，本操作还可通过在注射器和收集管中预先加入抗凝剂的方式进行修改，以用于循环免疫细胞的研究。</li>
	<li>沿腹腔长度方向做一横向切口，并从腹腔向上至小鼠下颌做一纵向切口。</li>
	<li>使用镊子夹住切口两侧皮肤，轻轻将皮肤从下方的腹腔和胸腔分离。</li>
	<li>从生殖器至胸骨沿腹腔长度方向做一大切口，注意避免切破膈肌。轻轻移动腹腔内的肠道，以便暴露一侧肾脏。</li>
	<li>切断通向肾脏的肾静脉，作为灌注时的引流点。</li>
	<li>使用剪刀切开膈肌，注意避免损伤肺和心脏，以暴露心脏左侧。</li>
	<li>使用带 27 G 针头的 10 ml 注射器及 1× PBS 溶液手动灌注心脏。灌注过程中避免施加过大压力，以防止生理盐水进入肺部。残留血液应从门静脉切口处流出。</li>
	<li>使用钝头/钝头剪刀沿胸骨小心剪开肋骨，注意避免损伤心脏和肺。此过程中若意外剪破肺组织，将显著减少支气管肺泡灌洗液（BALF）的收集量，并导致无法用固定液充分膨胀肺组织。</li>
	<li>使用镊子轻轻将心脏和肺组织从肋骨中分离。使用钝头/钝头剪刀尽可能靠近脊柱处逐段剪断肋骨，并完全移除两侧肋骨。</li>
	<li>使用镊子分离唾液腺或用剪刀将其移除，以暴露气管。</li>
	<li>使用剪刀小心剪开覆盖在气管上的肌肉组织。此过程中必须确保不损伤气管。</li>
	<li>使用剪刀分离覆盖在气管上方的锁骨。</li>
	<li>用镊子轻轻夹住胸腺并将其从心脏上方提起，使用剪刀小心切除胸腺，注意避免损伤心脏或肺组织。</li>
	<li>使用斜角剪刀（45–90º 角度，锐头/锐头）在喉部下方 1–2 个气管环处做一小的横向切口。切口应足够大，以便牢固固定套管。</li>
	<li>插入套管，使锥形端延伸至切口下方 2–3 个气管环处，并使用丝线缝合固定套管。确保缝线穿过气管与食管之间，并在套管上扎紧。</li>
	<li>用 1 ml 汉克斯平衡盐溶液（HBSS）充满 1 ml 注射器，并轻轻将鲁尔接头插入套管。</li>
	<li>以缓慢但持续的动作向气管内注入约 900 µl 溶液，使肺膨胀，随后立即回抽 HBSS。将回收的支气管肺泡灌洗液（BALF）置于 15 ml 锥形管中。</li>
	<li>重复此灌洗操作 2 次，共收集约 3 ml&#160; BALF 用于后续分析。收集后的 BALF 应置于冰上或 4 ºC 保存，直至使用。</li>
</ol>
3. 组织病理学制备
<ol>
	<li>将一个 10 ml 注射器插入肺灌注支架中。将导管连接至鲁尔接头，鲁尔接头连接至旋塞阀，旋塞阀再连接至注射器。确保旋塞阀处于关闭状态。&#160;该 10 ml 注射器将作为重力灌注的储液器。储液器应固定在灌注支架上，其位置高于动物 4.75 英寸&#160;，且储液器顶部应高于动物 10.5 英寸&#160;。</li>
	<li>用中性缓冲甲醛溶液填充注射器。确保注射器完全充满固定液。</li>
	<li>在导管开口端下方放置一块吸水毛巾，打开旋塞阀，使固定液充满导管。当固定液开始从导管流出时，立即关闭旋塞阀，并将注射器重新加满固定液至顶部。必须确保注射器完全充满，以提供肺组织膨胀所需的适当压力。</li>
	<li>在气管上轻轻穿过第二根缝合线，位置大约位于套管末端下方 1-2 个气管环处。</li>
	<li>在缝合线上打一个松散的单结；但不要将结扎紧。</li>
	<li>将小鼠肺灌注支架上的导管插入套管中。</li>
	<li>打开旋塞阀，通过重力作用使肺部充盈。</li>
	<li>当肺部达到最大膨胀程度后，拉紧缝合线并打第二个结。</li>
	<li>关闭旋塞阀，并将导管从套管中移除。</li>
	<li>用镊子夹住缝合线，同时用手握住套管，轻轻将套管从气管中取出。用力将缝合线向下朝向胸腔方向拉动，同时将套管向小鼠鼻部方向撤出。</li>
	<li>用镊子轻轻夹住气管或缝合线，将气管从颈部腔隙中提起。</li>
	<li>使用钝头剪刀在结扎线远端（尾侧）切断气管。</li>
	<li>当气管完全脱离下方组织后，开始将气管从小鼠体内拉出。轻柔地将肺部从胸腔中提起。</li>
	<li>小心剪断固定肺部于胸腔内的结缔组织。持续将气管从小鼠体外拉出，同时在切断下方连接组织时施加稳定的向上拉力。注意避免损伤肺组织。需注意，采用此方法时心脏应保留在肺组织上。</li>
	<li>肺组织取出后，将其置于 10 ml&#160;缓冲甲醛溶液中。</li>
	<li>取一段小鼠尾部组织用于基因分型。</li>
	<li>按照相关机构规定妥善处理小鼠尸体。</li>
</ol>
4. 细胞因子评估
<ol>
	<li>将步骤 2.5 中采集的全血在 12,000 x g 条件下离心 5 分钟&#160;，以分离血清。将血清转移至预先标记的 1.5 ml 微量离心管中，并于 -80 °C 保存。</li>
	<li>采用 ELISA 或其他类似方法检测血清细胞因子水平。根据检测方法的不同，用适当的稀释缓冲液将血清稀释 1:5 至&#160;1:20，具体操作遵循试剂盒生产商的说明。这些稀释比例应在批量检测样本前通过实验预先确定。</li>
	<li>由于采集的血清体积较小，可将加载到 ELISA 板上的样本体积减少一半。例如，大多数商用 ELISA 试剂盒使用 100 μl 的标准品和样本体积。为节约样本，每孔可加载 50 μl 标准品和稀释后的血清。</li>
	<li>将支气管肺泡灌洗液（BALF）在预冷的台式离心机中以 200 x g 离心 5 分钟。将无细胞的上清液转移至两个预先标记的 1.5 ml 微量离心管中，并于 -80 °C 保存。</li>
	<li>采用 ELISA 或其他类似方法直接检测 BALF 中的细胞因子，无需稀释。</li>
	<li>未使用的血清和 BALF 应于 -80 °C 保存。</li>
</ol>
5. 差异染色与支气管肺泡灌洗液细胞分析
<ol>
	<li>在BALF离心并完全去除HBSS后，使用低渗盐水裂解沉淀的红细胞。将细胞重悬于900 μl蒸馏水中，立即加入100 μl 10x PBS。</li>
	<li>每个样本单独进行裂解。&#160;如果样本中含有过多红细胞，可在台式离心机中以400 × g离心5分钟收集细胞，并重复红细胞裂解步骤。</li>
	<li>使用血细胞计数板，在10X或20X放大倍数下结合台盼蓝染色，测定1 ml悬液中的总BALF细胞数。以细胞数/ml的形式评估并呈现数据。</li>
	<li>准备细胞离心涂片及差异染色所需材料。使用铅笔或耐溶剂记号笔标记标准显微镜载玻片。将载玻片固定于细胞离心涂片夹和漏斗中，并将载玻片组件固定在细胞离心转子内。</li>
	<li>取150 μl BALF在100 × g条件下离心5分钟进行细胞涂片。若细胞密度过高而难以有效评估细胞形态，可减少上样体积。让载玻片在空气中过夜干燥。</li>
	<li>按照制造商提供的说明书对载玻片进行差异染色。染色后让载玻片在空气中过夜干燥。使用Permount封片剂封片，并用配备20X和40X物镜的显微镜观察载玻片。</li>
	<li>收集剩余细胞用于后续分析，如流式细胞术（FACS）、电子显微镜、共聚焦显微镜、RNA提取用于基因表达分析和/或蛋白质提取用于Western blot检测。</li>
</ol>
6. 组织病理学评估
<ol>
	<li>为进行组织病理学评估，将肺组织在福尔马林中固定 24–48 小时后，以腹侧朝上的方向将完全膨胀的肺组织进行正位放置，并包埋于石蜡中。切开所得组织块，以暴露主要的传导性气道。</li>
	<li>为提高评分准确性，应将肺组织保持在同一位置进行定向，并修整每个组织块，以最大程度地纵向显示肺内主要轴向气道。从此切面连续切取 5 微米（5 µm）厚的切片，并用苏木精和伊红（H&amp;#38;E）染色。还可额外切取组织切片，并按照标准操作流程制备用于原位杂交（in situ hybridization）的样本。</li>
	<li>采用基于以下炎症参数的半定量评分系统进行组织病理学评估，各项参数按 0（无）至 3（重度）进行评分：单核与多形核细胞浸润；气道上皮细胞增生及损伤；渗出；血管周围及细支气管周围套袖样浸润；以及肺组织受累炎症区域所占百分比。肺组织病理学评估应由经验丰富的病理学家完成。</li>
	<li>将所有参数评分取平均值，以获得总组织病理学评分，或使用各单项评分分别量化疾病进展的特定方面。所有评分均应以双盲方式进行，评估者需对基因型和处理分组均保持盲态。该评分系统此前已有报道6,7,10。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明&#160;不存在相互竞争的经济利益。

成功评估小鼠肺部宿主免疫反应最关键的步骤如下：1）为所评估的模型选择合适的小鼠品系和性别；2）优化PAMP向肺部的递送；3）正确收集和处理支气管肺泡灌洗液（BALF）；4）正确固定肺组织并为其组织病理学评估做好准备。
小鼠品系的选择是评估宿主免疫反应的重要因素。C57Bl/6 小鼠通常被认为是研究固有免疫的理想小鼠背景，因其具有 Th1 偏向性以及对大多数病原体相关分子模式（PAMPs）产生强烈的免疫反应。同样，BALB/c 小鼠通常用于研究过敏性疾病模型，因其具有 Th2 偏向性。在肺部模型中另一种常用的小鼠品系是 129SvEv 背景小鼠，因其广泛用于基因修饰动物的制备。在所有情况下，实验设计时应谨慎，尽可能使用年龄和性别匹配的同窝出生对照动物，以比较基因修饰小鼠与野生型动物。通常，对于本文所述的 LPS 实验方案，应使用 6–12 周龄、性别匹配的 C57Bl/6 小鼠，且体重应不少于 20 g。LPS 暴露可能导致对 LPS 敏感的小鼠品系或基因型出现较高的发病率和死亡率。若发生此类情况，可能需要调整本实验方案的多个方面，包括降低 LPS 剂量、使用体型更大的动物，或更换实...

与致病性细菌相关的肺部感染是全球发病率和死亡率的常见原因。明确驱动宿主对这些病原体免疫反应的机制，将有助于开发新型预防策略和治疗药物，从而减轻这些感染带来的影响。本方案的总体目标是为使用者提供一种灵活的方法，利用病原体相关分子模式（PAMP）作为活细菌的替代物，来评估宿主对病原体感染的先天免疫反应。以往大多数评估宿主对细菌先天免疫反应的研究主要集中在腹膜模型，因其操作相对简便。尽管这些模型非常有用，并已在宿主-病原体相互作用和全身性炎症研究领域取得了重要进展，但这些模型产生的数据并不总是适用于呼吸系统相关研究。本文提出一种急性肺部炎症的肺部模型，作为经典腹腔（i.p.）注射模型的一种实用且具有临床相关性的拓展。该技术能够在器官特异性的模型系统中对先天免疫反应进行局部评估。
本文所述方法旨在提供一种简单且可靠的实验技术，使研究人员能够评估宿主对脂多糖（LPS）的免疫应答，LPS 是一种常见的病原体相关分子模式（PAMP）。该方法基于经气管（i.t.）滴注 LPS，可在小鼠肺部诱导强烈的先天免疫反应，并模拟人类呼吸道感染及急性肺损伤患者中观察到的多种病理生理特征1。该技术的主要优势在于，可在无需使用活体细菌进行体内实验的情况下评估宿主免疫反应，从而避免了与之相关的混杂因素和生物安全风险。此外，本方案中描述的经口咽部气管内给药途径相较于其他常用技术（如经鼻腔（i.n.）给药和手术途径气管内给药）具有显著优势。例如，与经鼻腔给药相比，经口咽部气管内给药可实现相对准确的剂量控制和肺部沉积，而经鼻腔给药通常因药物在鼻腔和鼻窦中的滞留而导致肺部沉积量变异性增加2-4。气管内给药途径可绕过这些腔道，直接进入气管和气道。同样，手术途径的气管内给药创伤更大，且需要经过大量训练才能掌握。本文还描述了用于评估炎症进展的常用技术及替代标志物，并以一套详细说明如何正确制备肺组织用于组织病理学评估的方案作为结尾。这些实验方案的设计重点在于通过最大化每只实验动物所提供的数据量，以尽量减少每项研究所需使用的小鼠数量。
所述方案具有高度灵活性，可轻松修改以评估多种病原体相关分子模式（PAMP）和损伤相关分子模式（DAMP）。此外，经过一些额外修改，这些方案还可应用于评估过敏性气道疾病进展，或宿主与活细菌、病毒或真菌之间的相互作用研究5-10。

<table><tbody><tr><td>C57Bl/6J</td><td>杰克逊实验室</td><td>库存编号 000664</td><td></td></tr><tr><td>紧凑型天平</td><td>Ohaus 天平公司</td><td>71142845</td><td></td></tr><tr><td>小型动物直肠温度计</td><td>Braintree Scientific</td><td>TH 5</td><td></td></tr><tr><td>啮齿类动物直肠探头</td><td>Braintree Scientific</td><td>RET 3</td><td></td></tr><tr><td>耳标钳</td><td>Braintree Scientific</td><td>EP-S 901</td><td></td></tr><tr><td>来自 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; 0111:B4 的脂多糖</td><td>InvivoGen</td><td>LPS-EB</td><td></td></tr><tr><td>1× 磷酸盐缓冲液</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Baxter</td><td>40032609</td><td></td></tr><tr><td>气管内给药与肺膨胀支架</td><td>ICAP 制造公司</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>啮齿类动物插管支架</td><td>Braintree Scientific</td><td>RIS 100</td><td></td></tr><tr><td>剪刀（钝头/锐头）</td><td>费舍尔科学公司</td><td>13-806-2</td><td></td></tr><tr><td>镊子（直头）</td><td>费舍尔科学公司</td><td>22-327-379</td><td></td></tr><tr><td>镊子（45&amp;ordm;，弯头）</td><td>费舍尔科学公司</td><td>10-275</td><td></td></tr><tr><td>剪刀（钝头/钝头）</td><td>费舍尔科学公司</td><td>08-940</td><td></td></tr><tr><td>移液器（200 &amp;micro;l 容量）</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 注射器</td><td>BD 医疗</td><td>301025</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 注射器</td><td>BD 医疗</td><td>301604</td><td></td></tr><tr><td>27 G × 0.5 英寸针头</td><td>BD 医疗</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>制冷微量离心机</td><td>费舍尔科学公司</td><td>13-100-676</td><td></td></tr><tr><td>带鲁尔接头的 1.2 mm 气管套管</td><td>哈佛仪器公司</td><td>732836</td><td></td></tr><tr><td>汉克平衡盐溶液</td><td>Life Technologies</td><td>14025-076</td><td></td></tr><tr><td>4-0 编织丝线外科缝合线</td><td>Ethicon</td><td>A183</td><td></td></tr><tr><td>鲁尔接头至管路连接套件</td><td>哈佛仪器公司</td><td>721406</td><td></td></tr><tr><td>鲁尔三通阀套件</td><td>哈佛仪器公司</td><td>721664</td><td></td></tr><tr><td>Tygon E-3603 型实验室管路</td><td>Sigma</td><td>R-3603</td><td></td></tr><tr><td>中性缓冲福尔马林溶液，10%</td><td>Sigma</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 IL-1&amp;beta; OptEIA ELISA 试剂盒</td><td>BD 生物科学</td><td>559603</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 IL-6 OptEIA ELISA 试剂盒</td><td>BD 生物科学</td><td>550950</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 TNF-&amp;alpha; OptEIA ELISA 试剂盒</td><td>BD 生物科学</td><td>560478</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Hausser Scientific</td><td>3520</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板盖玻片</td><td>Thermo Scientific</td><td>22-021-801</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV3008401</td><td></td></tr><tr><td>细胞学漏斗夹</td><td>费舍尔科学公司</td><td>10-357</td><td></td></tr><tr><td>细胞学漏斗</td><td>费舍尔科学公司</td><td>10-354</td><td></td></tr><tr><td>滤纸卡</td><td>费舍尔科学公司</td><td>22-030-410</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>费舍尔科学公司</td><td>12-544-1</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>费舍尔科学公司</td><td>12-540A</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin 细胞离心涂片机</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78300003</td><td></td></tr><tr><td>Diff Quick 染色试剂盒</td><td>费舍尔科学公司</td><td>47733150</td><td></td></tr><tr><td>Permount 封片介质</td><td>费舍尔科学公司</td><td>SP15-500</td><td></td></tr></tbody></table>

利用经口咽气管内给予pamp及支气管肺泡灌洗评估小鼠宿主免疫反应

The Utilization of Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration and Bronchoalveolar Lavage to Evaluate the Host Immune Response in Mice

宿主对病原体的免疫反应是一个复杂的生物学过程。传统上，用于表征宿主-病原体相互作用的大多数体内研究通常采用向小鼠腹腔注射特定细菌或病原体相关分子模式（PAMPs）的方法。尽管这些技术已为感染性疾病的发病机制研究提供了大量数据，但腹腔注射模型并不总是适用于肺部宿主-病原体相互作用的研究。通过利用小鼠急性肺部炎症模型，可以对宿主先天免疫反应进行高分辨率分析，其中使用脂多糖（LPS）作为刺激物。本文描述了通过非手术经口咽气管内途径给予LPS的方法，监测与疾病发生相关的临床参数，并利用支气管肺泡灌洗液评估宿主免疫反应。所介绍的技术广泛适用于研究宿主对多种PAMPs和病原体的先天免疫反应。同样，经过少量修改后，这些技术也可应用于过敏性气道炎症研究以及药理学研究。

革兰氏阴性菌的细胞壁由脂多糖（LPS）组成，而LPS在环境中广泛存在。在敏感人群吸入LPS后会加重气道反应性，并可触发强烈的免疫反应11。LPS也是一种常用于小鼠模型中的病原体相关分子模式（PAMP），以诱导强烈的先天免疫反应。在本方案中，小鼠接受了经气管给予的来自 E. coli （血清型 0111:B4）通过经口咽部气管内给药。在LPS暴露模型中，体温和体重均为反映动物发病情况和疾病进展的典型替代指标。LPS攻击后，体温在最初6小时内显著下降，随后在24小时内逐渐恢复至基线水平。图1A）。然而，在24小时过程中，体重将稳步下降（图1B），在此期间体温将达到峰值，并在随后的48–72小时内逐渐恢复。因此，体温是评估炎症早期启动阶段更合适的指标；而体重则在疾病发生后期及恢复阶段更具可靠性。
气道暴露于LPS可导致大量白细胞浸润至肺组织。在暴露后的最初6小时内，可在支气管肺泡灌洗液（BALF）中观察到与宿主固有免疫反应相关的细胞（图1C）。在随后的24至48小时内，...

宿主对病原体感染的免疫反应是一个受到严密调控的过程。利用小鼠脂多糖肺暴露模型，可对与疾病发病机制相关的复杂机制进行高分辨率评估。

利用经口咽气管内给予PAMP及支气管肺泡灌洗评估小鼠宿主免疫反应

宿主对病原体的免疫反应是一个复杂的生物学过程。大多数用于表征宿主-病原体相互作用的经典体内研究……

本实验的总体目标是演示如何通过经口咽部气管内给予脂多糖（LPS）并进行支气管肺泡灌洗，以评估小鼠的宿主免疫反应。首先通过口咽途径向小鼠接种LPS；在第二步中，插入气管插管，随后经该插管收集支气管肺泡灌洗液，用于评估局部炎症反应。在最后一步中，用福尔马林充胀肺组织以进行组织病理学评估。最终，可分析肠道的细胞因子谱和肺组织的组织病理学变化，以评估宿主对脂多糖（LPS）的免疫应答。与现有的鼻内给药和手术气管内给药等方法相比，该技术的主要优势在于操作相对简便，并可实现精确的剂量控制和肺部沉积。首先通过气管内注射LPS。将一只麻醉的小鼠悬挂在插管装置上，站在其门齿前方，确保动物被牢固固定，并且口腔和舌头易于接触。用直头镊子轻轻固定舌头，然后用弯头镊子夹住舌头，轻柔地将舌肌拉出口腔，直至感到轻微阻力时保持舌头位置。在此状态下，向咽喉后部注入 50 微升 LPS 溶液，并立即用戴手套的手指堵住动物鼻孔，持续 5 至 10 次呼吸，以便在处死后收集灌流液。接着，在腹腔全长范围内做一横向切口，再从腹腔向上做一纵向切口，延伸至小鼠下颌。然后用镊子夹住切口两侧，轻轻将皮肤从下方的腹膜腔和胸腔上拉开。接着，从生殖器沿腹膜腔纵向至胸骨做一较长切口，注意避免切到横膈膜。然后轻轻移动腹膜腔内的肠道，以便暴露其中一个肾脏。剪断通向肾脏的肾静脉，作为灌注的引流点。然后用剪刀在膈肌上剪开一个小口，注意避免损伤肺和心脏。为暴露心脏左侧，使用带有27号针头的10毫升注射器，手动向心脏灌注PBS。应使剩余血液从门静脉切口流出。然后使用钝头剪刀沿胸骨小心剪开肋骨。注意避免损伤心脏和肺脏。轻柔地分离心脏和肺部，然后使用钝头剪刀尽可能靠近脊柱小心地剪断肋骨的每一部分。完全移除两侧肋骨部分后，分离唾液腺以暴露气管，并在不剪断气管本身的情况下，小心剪除覆盖在气管上方的肌肉。接着分离锁骨，轻轻夹住胸腺并将其从心脏上方提起。然后用剪刀小心地移除胸腺，注意避免剪到心脏或肺部。接下来，使用有角度的锐利剪刀，在喉部下方一至两个气管环处做一个足够大的小水平切口，以便牢固地固定气管插管。然后插入插管，使其锥形末端延伸至两到三个气管环。 在切口下方，将丝线缝合线穿过气管与食管之间的间隙，并将缝线在套管上拉紧以固定。然后，用1毫升注射器吸取HBSS，以缓慢而持续的动作将针头轻轻插入套管。接着，向气管内注入约900微升HBSS以膨胀肺部，随后立即回抽HBSS，并将回收的液体转移至15毫升锥形管中。重复灌洗两到三次，以收集约三毫升的瓣膜。将瓣膜置于冰上保存，用于肺组织的解剖。进行组织病理学分析时，将10毫升注射器插入肺膨胀支架中，并将导管连接至接头，接头连接至旋塞阀，旋塞阀再连接至注射器；确认旋塞阀处于关闭状态后，用中性缓冲福尔马林溶液充满注射器。当注射器完全充满固定液后，在导管开口端下方放置吸水毛巾，打开旋塞阀，使固定液充满导管。当固定液开始从导管中流出时，立即关闭旋塞，并用固定液将注射器重新注满至顶端。然后在气管下方约一个到两个气管环的位置，轻轻地将第二根缝合线穿过气管。在插管末端下方，将缝合线打一个松散的单结，随后插入用于小鼠肺部膨胀的导管。将导管插入。打开旋塞阀，使肺部通过重力灌注而充盈。当肺部达到最大膨胀程度后，拉紧缝线并打第二个结。关闭旋塞，将管路从套管上取下，然后用镊子夹住缝合线。用力将缝合线向下拉向胸腔，并轻轻将套管向小鼠鼻部方向拉出，以取出套管。接着，轻轻将气管从颈部腔隙中提起，使用钝头剪刀在靠近结扎缝合线处剪断气管。当气管已从下方组织中游离后，开始将气管从小鼠体内向外牵拉，并轻轻将肺组织从胸腔中提起。然后，用稳定的向上力量小心剪断固定肺组织与胸腔的结缔组织，同时继续将气管从小鼠身体中拉出，注意避免损伤肺组织。最后，将肺组织置于10毫升的缓冲甲醛溶液中固定。在LPS暴露模型中，体温和体重是我们常用的动物发病情况和疾病进展的替代指标。LPS刺激会在前六小时内引起体温显著下降，如图所示，随后在24小时内逐渐恢复至基线水平。然而，体重在24小时内持续下降，之后在接下来的48至72小时内达到最低点并逐渐恢复。因此，体温是评估炎症启动早期阶段更合适的指标。尽管体重在疾病发生后期及恢复阶段的评估中更为可靠，但气道暴露于LPS会导致大量白细胞浸润。在暴露后的最初六小时内，即可在阀门中观察到与宿主先天免疫反应相关的肺部细胞。随后，细胞数量在接下来的24至48小时内持续增加，直至免疫反应达到高峰，之后进入炎症消退阶段。到24小时时，肺部已出现大量中性粒细胞，经差异染色后可在阀门中观察到。瓣膜细胞密度评估为表征肺部宿主免疫反应相关的细胞提供了一种可靠且可量化的技术。这种增加与中性粒细胞大量浸润气道、血管及肺实质相一致。肺组织病理学可采用半定量评分系统进行有效评估，图中所示即为该评估结果。LPS可引起血管周围、支气管周围及肺实质炎症的显著增加。LPS给药可诱导局部和全身性促炎介质的高水平表达，包括通过ELISA检测到的多种与先天免疫反应相关的细胞因子。LPS给药后在肺组织中上调的常见细胞因子包括TNF、α IL-1β和IL-6。全身性细胞因子水平也可采用与肠道评估相同的实验技术在血清中进行检测。与未膨胀的肺组织或通过重力法固定的手动膨胀肺组织相比，采用重力置换法固定可为组织病理学评估提供更理想的条件。该方法实现的肺组织膨胀具有均匀的特征，从而实现准确的评分、减少肺泡损伤、增强可视化效果，并提高对炎症反应评估的分辨率。而手动膨胀肺组织通常导致膨胀区域不均匀，这些区域常呈现部分膨胀状态，引起组织塌陷，初学者审阅者往往将其误判为病理特征。手动膨胀还会导致肺部某些区域过度膨胀，从而引起肺泡腔严重损伤。未膨胀的肺组织显示出肺泡腔塌陷，以及难以分辨和评估的区域，若无 extensive training 则难以处理。同样，由于器官处于塌陷状态，该技术无法呈现肺部在体时的真实形态。观看本视频后，您应能充分理解如何通过简单的非手术经口咽及气管给药方法，诱导并评估小鼠中由脂多糖（LPS）介导的急性肺部炎症，并进行组织采集。

the-utilization-oropharyngeal-intratracheal-pamp-administration

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

口咽部气管内PAMP管理和支气管肺泡灌洗的利用率来评估小鼠宿主的免疫反应

重复测量啮齿类动物呼吸生理参数并采集气道炎症细胞是理想的研究手段，但通常难以实现。本文介绍一种可重复的小鼠经口插管方法，该方法允许对气道高反应性进行多次测量，并可重复采集气道炎症细胞。...

一种可逆、非侵入性的小鼠气道阻力测量与支气管肺泡灌洗液采集方法

我们通过气管途径，展示了一种将待测物质非手术递送至麻醉小鼠肺部的方法。该方法可使肺部暴露于细菌和病毒病原体、细胞因子、抗体、微珠、化学物质或染料中。我们进一步描述了肺组织及肺引流淋巴结（LDLNs）的采集与处理，以用于流式细胞术分析。...

小鼠非手术气管内灌注及通过流式细胞术分析肺组织和肺引流淋巴结

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小鼠气管插管术 通过 使用耳镜进行直接喉镜检查

经插管介导的气管内（IMIT）试剂灌注是一种研究呼吸系统疾病以及将治疗性试剂直接递送至肺部的优良非侵入性方法。该方法快速且具有高度可重复性，适用于临床前测试。...

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尽管 体外 宿主-病原体相互作用的研究有助于表征特定的免疫应答， 体内 需要使用模型来观察复杂反应的影响。 白色念珠菌 暴露后...

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小鼠皮下与鼻内接种卡介苗后的保护效力及肺部免疫应答

文献中已描述了多种在小鼠中建立细菌性肺炎模型的方法。本文介绍一种非侵入性、低成本且快速的方法，通过将细菌接种物滴加至口咽部，使其吸入（即，经气道吸入）以诱导肺炎。同时详细阐述了用于评估肺部固有免疫反应的后续检测方法。...

一种用于小鼠实验性细菌性肺炎诱导与表型分析的非侵入性且技术简便的方法

肺的健康状况可通过肺细支气管中存在的免疫细胞类型和数量来反映。本文介绍一种支气管肺泡灌洗技术，可用于分离和研究小鼠下呼吸道中的非黏附性细胞及可溶性因子。...

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本文介绍了一种简洁的实验方案 体内...

小鼠中宿主-病原体反应及疫苗效力的评估

此处，我们提出一种经气管递送脂多糖（LPS）的实验方案 通过 无创经口咽气管插管。该方法可最大限度地减少手术操作对动物造成的创伤，并能准确地将LPS输送至气管，进而进入肺部。...

小鼠非侵入性气管内脂多糖滴注

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利用经口咽气管内给予PAMP及支气管肺泡灌洗评估小鼠宿主免疫反应

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