烟草树与杨树作为生物基产业原料的转录组与代谢物谱分析

本实验的总体目标是从烟草树叶片材料中建立并优化代谢物和RNA测序数据，用于面向系统生物学的分析。首先采集不同发育阶段的叶片系列生物材料，完成第一步；第二步则根据后续分析的需要，选用适当的溶剂对材料进行提取。

接下来，使用气相色谱法、质谱法或气相色谱-质谱联用技术（GCMS）检测代谢物和碳氢化合物，同时利用RNA测序数据采集技术分析转录本。最终，通过结合代谢物分析和RNA测序介导的转录组分析，揭示烟草树叶片如何生成长链碳氢化合物及其他重要化合物。该方法可用于鉴定并定量烟草树叶片中产生的具有重要用途的代谢物。

尽管该方法可为烟草树代谢组学研究提供见解，但它也可用于烟草或其他相关物种等其他体系。通常，初次使用该方法的研究者会遇到困难，因为烟草树叶片难以提取出高质量的RNA。

在本段 JoVE PRO 视频中，您将看到 FERNA 研究组的成员提取并分析代谢物。通过气相色谱-质谱联用技术（GCMS），您还将看到 Fraser 研究组的一名成员提取碳氢化合物，以及我所在研究组的一名成员提取用于 RNA 测序的 RNA。首先，按照文本方案中的说明，将拟南芥（Neko Oceana Glauca）植株种植于直径 30 厘米、含有 M2 专业培养基的花盆中。为制备初级代谢物，采集植株的叶片和茎部，并立即冷冻材料。将冷冻的植物材料冷冻干燥三天，然后使用球磨仪配合金属球研磨冻干样品。将所得的细粉状干燥样品分装至 2 毫升离心管或玻璃小瓶中。接下来，将 10 毫克叶片或 20 毫克茎部的干燥粉末状植物材料分装至 2 毫升带螺帽的圆底试管中。

加入1.4毫升100%甲醇，涡旋10秒。然后加入60微升核醇作为内标定量标准，再次涡旋。再额外涡旋10秒，加入一个不锈钢研磨珠，使用混合研磨仪在25赫兹下均质化样品2分钟，随后离心10分钟。

在11,000 × g条件下，将上清液转移至玻璃小瓶中。加入750 µL氯仿和1.5 mL水，涡旋混合10秒。然后从上层相中转移150 µL至新的1.5 mL离心管中。

接下来，使用真空浓缩仪干燥样品。必须将样品干燥三至二十四小时，直至无任何残留液体。干燥后，加入 40 µL 盐酸甲胺溶液。

然后将混合物置于37摄氏度的水平加热振荡器中振荡两小时。再次振荡前，加入70 µL的M-S-T-F-A混合液，并在37摄氏度下继续振荡两小时。振荡后，通过短暂离心使盖片上的液滴沉降至底部，再将液体转移至适用于GC-MS分析的玻璃小瓶中。

进行GCMS分析时，通过配置质谱数据分析软件并选择待处理的数据分析项目来分析数据。根据化合物类别，制备目标检测峰的列表。通过标准化合物的比对，鉴定各峰，并结合质谱分析、结构表征算法、文献调研以及代谢物数据库检索，对检测到的峰进行注释，用于烃类提取物的分析。

将约200毫克新鲜采集的ncoa glauco叶片浸入溶剂中2至20分钟，取出叶片后通过旋转蒸发完全除去溶剂。然后将样品重新悬浮于1毫升HPLC级己烷中。随后按照文本方案中详述的参数对样品进行GCMs分析。

首先使用自动化的质谱解卷积与鉴定系统及NIST 98质谱库对色谱图组分进行初步处理。通过将保留时间与经典裂解图谱与已知的真实标准品进行比对，确认饱和长链烷烃的鉴定结果。随后，通过将积分峰面积与剂量响应曲线进行比较，对烃类进行定量分析。

使用真实标准品，通过 Excel 软件计算平均值及平均值的标准误差。本实验方案结合 TRIOL RNA 提取法与 RN easy 试剂盒，以获得高质量 RNA。取 100 毫克冷冻植物材料，置于 2 毫升离心管中，加入金属球，使用混合研磨仪进行研磨。样品均质化后，加入 1 毫升 TRIOL，随后在 4°C、12,000 × g 条件下离心 10 分钟。

将上清液转移至新的反应管中。加入200 µL氯仿，颠倒混匀数次，室温孵育3分钟。然后将混合物离心15分钟。

同前，将上层水相转移至新的反应管中。加入约2.5倍体积的乙醇。反复倒置混匀数次，并在-80摄氏度下孵育30分钟。

接下来，将样品连同任何沉淀物转移至离心柱中。以8,000 ×g离心15秒，并弃去滤过液。向离心柱中加入700 µL洗脱缓冲液RW1（提取试剂盒中提供），然后离心。

再次弃去穿流液后，向离心柱中加入500微升试剂盒提供的第二种洗涤缓冲液RPE。再次离心柱子，弃去穿流液，然后加入更多RPE缓冲液并进行离心。与之前相同，随后将离心柱放入一个新的1.5毫升反应管中，加入50微升无RNA酶的水，以8,000 × g离心一分钟，以洗脱RNA。

根据试剂盒说明书，使用DNA去除试剂盒清除残留的DNA。最后一步是测定RNA的质量。在将RNA送测进行下一代测序之前，RNA的完整性数值（RIN）应高于8。

高效液相色谱图显示了南美天芥菜叶片提取物中异戊二烯类化合物分析的代表性结果。使用光电二极管阵列检测器检测了C40及以上级别的不同异戊二烯类化合物。色谱峰的注释基于代码色谱法以及与标准品的真实对照进行光谱比对。

两个质谱色谱图是来自ncoa、glauco叶片和茎组织的初级代谢物分析结果。以丝氨酸对应峰的质谱图为例，展示了用于评估RNA质量的生物分析仪的典型输出结果。色谱图中的两个主要峰对应于18S和25S核糖体RNA，表明该样品中的RNA保持完整。

如果RNA部分或严重降解，核糖体RNA的片段化会产生额外的峰。掌握该技术后，可快速进行操作，并且与其它代谢物分析相兼容。按照本方案操作后，还可采用实时PCR或其他RNA分析方法，以回答其他科学问题，例如小RNA的生成或特定基因的表达情况。

观看本视频后，您应能充分理解如何从烟草植株中提取和分析代谢物数据。