Name: 同时进行pH测量的内吞和胞车厢中使用共焦显微镜活细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: 学习使用共聚焦显微镜同时测量活细胞内囊泡和细胞质的pH值。该方法利用HPTS和SNF F1探针标记内体、溶酶体和细胞质，通过荧光比率成像技术实现实时动态监测，为研究细胞内pH稳态调控机制提供了可靠工具。

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感谢 Gilles Dupuis 博士对本文手稿的审阅。
资金
本工作由加拿大卫生研究院（Canadian Institutes for Health Research）资助，资助号为 MOP-126173。C.M.D. 是由魁北克健康研究基金会（Fonds de la Recherche en Santé, FRSQ）资助的艾蒂安·勒贝尔临床研究中心（Centre de Recherche Clinique Étienne LeBel）的成员。

1. 细胞pH校准用溶液的配制
<ol>
	<li>将以下化合物分别加入五个独立的 50 ml 锥形管中，以配制用于校准的 5 种溶液：
	<ul>
		<li>NaCl（1 ml 1 M NaCl）（1 M NaCl = 0.58 g 溶于 10 ml H₂O）20)</li>
		<li>KCl（1 M KCl 溶液 6.75 ml）（1 M KCl = 0.75 g 溶于 10 ml H₂O）20)</li>
		<li>葡萄糖（1 ml，1 M） D-葡萄糖（1 M） D-葡萄糖 = 1.80 g 溶于 10 ml H₂O20)</li>
		<li>MgS04 （0.05 ml 的 1 M MgSO₄）4) (1 M MgSO₄4= 1.20 g 溶于 10 ml H20)</li>
		<li>20 mM HEPES（1 ml 1 M HEPES）（1 M HEPES = 2.38 g 溶于 10 ml H₂O）20)</li>
		<li>CaCl2 （0.05 ml 的 1M CaCl₂）2) (1 M CaCl₂2= 1.47 克溶于 10 毫升 H20) 
		所有溶液均使用双蒸水配制2O (ddH₂O)2O</li>
	</ul>
	</li>
	<li>用35 ml的ddH2O定容每种溶液2O，并使用磁力搅拌器搅拌直至溶解。</li>
	<li>使用 1 N KOH 或 1 N HCl 调节每种溶液的 pH 值，使其分别为 5.5、6.0、6.5、7.0 和 7.5。然后用去离子水定容至终体积 50 ml。</li>
	<li>称取5 mg尼日里菌素，加入670 μl无水乙醇，配制10 mM尼日里菌素储备液。 
	注意：尼日里菌素具有高毒性，必须小心操作（佩戴手套、安全眼镜和口罩）。通过倒置混匀溶液，直至尼日里菌素完全溶解。</li>
	<li>向每种校准溶液中加入 0.05 ml 的 10 mM 尼日霉素（终浓度为 10 μM）。尼日霉素是一种离子载体，可增加细胞膜通透性，在细胞外 K⁺ 处于去极化浓度时，促使细胞内与细胞外 pH 值达到平衡。+.</li>
	<li>校准溶液可在 4 °C 下保存长达 1 个月</li>
</ol>
2. 细胞准备
<ol>
	<li>在生物安全柜中，将细胞以每皿 2 ml 的培养基接种于 35 mm × 10 mm 的培养皿中，培养基中需添加 10% 胎牛血清和抗生素。接种细胞数量应确保 24 小时后融合度约为 50%。 
	注：在我们的实验中，使用 HT-1080 细胞系，每培养皿接种 1 × 105 个细胞。</li>
	<li>根据实验需求确定所需培养皿数量，并额外接种 5 个培养皿用于校准。</li>
	<li>将培养皿置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中培养至少 24 小时。</li>
</ol>
3. pH 传感探针的制备
<ol>
	<li>用去离子水（ddH2O）配制1M的荧光pH探针8-羟基芘-1,3,6-三磺酸三钠盐（HPTS/吡兰宁）储备液。该溶液需在室温下保存，并避光。</li>
	<li>将1 mg的5-(和-6)-羧基半萘罗丹明荧光素乙酰氧基甲酯乙酸盐（C-SNARF-1 AM；下文简称SNARF-1）溶于1.76 ml二甲基亚砜（DMSO）中，配制成1 mM的储备液。通过反复吹打充分混匀。SNARF-1溶液需在-20 °C保存，并避光。</li>
</ol>
4. 细胞标记
<ol>
	<li>活细胞成像前16小时，向每个含有2 ml完全培养基的培养皿中加入2 μl的1 M HPTS储备液（终浓度为1 mM）。</li>
	<li>将培养皿放回&#160;培养箱。HPTS探针不能穿透细胞膜，因此要标记细胞器必须通过胞饮作用摄取该探针。此过程要求在含血清的培养基中进行HPTS孵育。</li>
	<li>与HPTS孵育后，用无菌PBS洗涤细胞两次，并加入2 ml无血清培养基孵育至少2小时。SNARF-1的孵育必须在无血清培养基中进行，因为血清可能阻碍探针的摄取。</li>
	<li>加入10 μl的1 mM SNARF-1储备液，使终浓度达到5 μM，在37°C弱光条件下孵育20分钟。C-SNARF-1的浓度和孵育时间可根据细胞类型有所不同。</li>
	<li>孵育结束后，用无菌PBS洗涤细胞两次，并加入2 ml无血清培养基。</li>
</ol>
5. 添加pH调节剂
<ol>
	<li>为评估该方法是否能够检测细胞内的 pH 变化，可使用不同的试剂来调节细胞内 pH：
	<ul>
		<li>Bafilomycin A1，一种特异性 V-ATPase 抑制剂5</li>
		<li>Na+/H+ 交换体同工型 1 (NHE-1)6</li>
		<li>NH4Cl，一种可提高细胞内 pH 的弱碱7</li>
	</ul>
	<ol>
		<li>制备上述试剂的储存液：
		<ul>
			<li>Bafilomycin A1：将 10 μg 的 bafilomycin A1 加入 160 μl 的 DMSO 中，配制成 100 μM 的储存液</li>
			<li>EIPA：将 25 mg 的 EIPA 加入 1.67 ml 的甲醇中，得到终浓度为 50 mM 的溶液</li>
			<li>NH4Cl：将 0.53 g 氯化铵溶解于 10 ml 的 ddH2O 中，得到终浓度为 1 M 的溶液</li>
		</ul>
		 
		注意：所有储存液均需保存在 4 °C，但 bafilomycin A1 必须保存在 -20 °C 并避光。</li>
		<li>在不同的培养皿中，分别加入以下试剂之一：
		<ul>
			<li>2 μl 的 100 μM bafilomycin A1（终浓度为 100 nM）</li>
			<li>1 μl 的 50 mM EIPA（终浓度为 25 μM）</li>
			<li>40 μl 的 1 M NH4Cl（终浓度为 20 mM）</li>
		</ul>
		</li>
		<li>将细胞在 37 °C 下孵育 30 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行图像采集。</li>
</ol>
6. 活细胞成像显微镜的规格及图像采集设置
<ol>
	<li>使用配备电动 XY 载物台和环境控制（温度、湿度、CO2）载物台培养箱的光谱倒置扫描共聚焦显微镜，结合 40X 物镜进行活细胞成像。</li>
	<li>本实验所用的共聚焦仪器（Olympus FV1000）配备以下组件：
	<ul>
		<li>405 nm 激光二极管</li>
		<li>40 mW 氩离子激光器（458 nm、488 nm、515 nm）</li>
		<li>氦氖激光器（543 nm）</li>
		<li>萤石 10X 物镜，NA 0.4</li>
		<li>LUCPLFLN 40X 物镜，NA 0.60</li>
		<li>PLAPONSC PLAN APO 60X 油镜，NA 1.4</li>
		<li>二向色镜 DM 405/458/488/543</li>
		<li>SDM 560 和 SDM 640 二向色滤光片</li>
		<li>BA655-755 发射滤光片</li>
		<li>分光镜 BS20/80</li>
		<li>用于图像采集与分析的数据分析软件</li>
	</ul>
	</li>
	<li>待载物台培养箱升温至 37 °C 且显微镜完成设置后，将预先用 HPTS 和 SNARF-1 孵育过的培养皿放入共聚焦显微镜的成像室中。</li>
	<li>找到目标区域后，调整软件采集参数 图 1。
	<ul>
		<li>设置两个虚拟通道组。</li>
		<li>启动第一阶段：HPTS 在 405 nm 激发，发射光收集范围为 505–525 nm；SNARF-1 在 543 nm 激发，发射光收集范围为 570–600 nm。</li>
		<li>启动第二阶段：HPTS 在 458 nm 激发，发射光收集范围为 505–525 nm；SNARF-1 在 543 nm 激发，发射光收集范围为 640–650 nm。</li>
		<li>共聚焦针孔默认设置为 175 μm，最佳针孔大小需手动调整至 300 μm。</li>
		<li>通过堆叠连续的水平光学切片（800 × 800 像素，厚度为 0.4 μm）获取图像。</li>
	</ul>
	</li>
</ol>
注意：使用40倍物镜可同时观察多个细胞，适用于细胞器观察。然而，采用60倍油镜可获得更佳的空间分辨率和信号强度。此外，两种染料之间不存在激发或发射光谱的串扰。
7. pH 传感探针的校准
<ol>
	<li>校准前，从先前用 HPTS 和 SNARF-1 孵育的培养皿中移除培养基，用无菌 PBS 洗涤两次，然后加入 2 ml 五种校准溶液中的一种。</li>
	<li>将培养皿放入共聚焦显微镜的载物台腔室中。</li>
	<li>按照以下设置进行时间序列图像采集：
	<ol>
		<li>设定实验所需的图像数量及采集间隔时间。 
		注：我们通常采用每 1 分钟采集一次图像，持续最多 30 分钟。</li>
		<li>编程控制快门在每次图像采集之间关闭。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在电子表格软件中记录每分钟的荧光强度，并确定荧光强度达到稳定的时间点。细胞内 pH 通常在 15–20 分钟后趋于稳定。</li>
	<li>对每种剩余的校准溶液，使用新的培养皿重复步骤 7.1 至 7.4。</li>
</ol>
8. 数据采集
<ol>
	<li>完成校准后，从随机选择的4-5个视野中获取样本数据，每个视野包含15-20个细胞。每个视野获取两幅图像：一幅用于HPTS标记（囊泡），另一幅用于SNARF-1标记（细胞质）。</li>
	<li>从两种探针的荧光图像中数字减去背景荧光（细胞外区域）。使用二值掩膜从各自存储的图像中选择标记的囊泡和细胞质。针对每种pH传感探针，以数值尺度（0-4,095灰度级）测量荧光强度。计算细胞器或细胞质内所有像素的平均强度，并利用这些值计算荧光比值。</li>
</ol>
9. 数据分析
<ol>
	<li>市面上有多种商业化的软件包可用于数据分析。i.e.&#160;Fluoview Software。</li>
	<li>在电子表格中记录数值，并按如下方法计算荧光比值：对于 HPTS，R = (F458 nm/F405 nm)；对于 SNARF-1，R = (F644 nm/F584 nm)。</li>
	<li>使用 GraphPad Prism 等科学绘图软件绘制数据图，图中应以荧光比值（Y 轴）随 pH 值（X 轴）的变化关系表示。采用非线性回归进行曲线拟合。</li>
	<li>按照步骤 8.2 所述方法采集样品的荧光强度，并计算荧光比值。利用标准校准曲线将比值转换为 pH 值。</li>
</ol>

<ol><li>Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH+Homeostasis+of+cellular+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22News+Physiol+Sci%22%5BJournal%5D)">pH Homeostasis of cellular organelles.</a> News Physiol Sci. 17, 1-5 (2002).</li>
<li>Webb, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulated+pH%3A+a+perfect+storm+for+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression.</a> Nat Rev Cancer. 11, 671-677 (2011).</li>
<li>Hinton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+a+subunit+isoforms+of+the+V-ATPase+in+pH+homeostasis+and+in+vitro+invasion+of+MDA-MB231+human+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Function of a subunit isoforms of the V-ATPase in pH homeostasis and in vitro invasion of MDA-MB231 human breast cancer cells.</a> J Biol Chem. 284, 16400-16408 (2009).</li>
<li>Overly, C. C., Lee, K. D., Berthiaume, E., Hollenbeck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+measurement+of+intraorganelle+pH+in+the+endosomal-lysosomal+pathway+in+neurons+by+using+ratiometric+imaging+with+pyranine%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Quantitative measurement of intraorganelle pH in the endosomal-lysosomal pathway in neurons by using ratiometric imaging with pyranine.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 3156-3160 (1995).</li>
<li>Drose, S., Altendorf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bafilomycins+and+concanamycins+as+inhibitors+of+V-ATPases+and+P-ATPases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Bafilomycins and concanamycins as inhibitors of V-ATPases and P-ATPases.</a> J Exp Biol. 200, 1-8 (1997).</li>
<li>Pedersen, S. F., King, S. A., Nygaard, E. B., Rigor, R. R., Cala, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NHE1+inhibition+by+amiloride-+and+benzoylguanidine-type+compounds.+Inhibitor+binding+loci+deduced+from+chimeras+of+NHE1+homologues+with+endogenous+differences+in+inhibitor+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">NHE1 inhibition by amiloride- and benzoylguanidine-type compounds. Inhibitor binding loci deduced from chimeras of NHE1 homologues with endogenous differences in inhibitor sensitivity.</a> J Biol Chem. 282, 19716-19727 (2007).</li>
<li>Alfonso, A., Cabado, A. G., Vieytes, M. R., Botana, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-pH+crosstalks+in+rat+mast+cells%3A+cytosolic+alkalinization%2C+but+not+intracellular+calcium+release%2C+is+a+sufficient+signal+for+degranulation%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Calcium-pH crosstalks in rat mast cells: cytosolic alkalinization, but not intracellular calcium release, is a sufficient signal for degranulation.</a> Br J Pharmacol. 130, 1809-1816 (2000).</li>
<li>Han, J., Burgess, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+indicators+for+intracellular+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Fluorescent indicators for intracellular pH.</a> Chem Rev. 110, 2709-2728 (2010).</li>
<li>Giuliano, K. A., Gillies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+intracellular+pH+of+BALB%2Fc-3T3+cells+using+the+fluorescence+of+pyranine%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Determination of intracellular pH of BALB/c-3T3 cells using the fluorescence of pyranine.</a> Anal Biochem. 167, 362-371 (1987).</li>
<li>Willoughby, D., Thomas, R., Schwiening, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+intracellular+pH+changes+on+resting+cytosolic+calcium+in+voltage-clamped+snail+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The effects of intracellular pH changes on resting cytosolic calcium in voltage-clamped snail neurones.</a> J Physiol. 530, 405-416 (2001).</li>
</ol>

未声明利益冲突。

在对不同细胞区室进行活细胞成像时，定量测量 pH 值对于准确评估细胞在应对外界刺激时的 pH 变化至关重要。然而，目前仍存在的主要难题之一是如何简便且特异性地靶向特定细胞区室。在这方面，已有少数研究报道了使用 HPTS 作为细胞内 pH 指示剂，并通过电穿孔或显微注射将其导入细胞8-10。但这些技术存在严重缺陷：电穿游戏副本导致细胞严重损伤，而显微注射则需要特殊设备和技术操作能力。值得关注的是，Hinton et al. 此前曾报道，HPTS 可通过胞饮作用被细胞摄取，并且 SNARF-1 与 HPTS 的联合使用可用于监测细胞质以及内体/溶酶体区室的 pH3。我们利用这一特性，在活体 HT-1080 细胞中记录了溶酶体/内体区室的 pH 变化。通过与荧光素标记的转铁蛋白（溶酶体/内体区室的标志物）或主要标记溶酶体的嗜酸性染料共染色，证实了 HPTS 定位于该区室，因此可作为可靠的 pH 指示剂图 2。此外，使用靶向不同细胞区室的多种细胞内 pH 调节剂表明，bafilomycin A1 可特异性升高囊泡内 pH，而不影响胞质 pH；相比之下...

<table><tbody><tr><td>校准用溶液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Fischer</td><td>L-11621</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Fischer</td><td>M-12445</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖（右旋糖）</td><td>Fischer</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>硫酸镁</td><td>Fischer</td><td>M65-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>二水合氯化钙</td><td>Fischer</td><td>M-1612</td><td></td></tr><tr><td>去离子水</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>尼日尔菌素（Nigericin）</td><td>Calbiochem</td><td>481990</td><td>吸入或皮肤接触有毒</td></tr><tr><td colspan="4">避光，4 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>培养皿 &amp;empty; 35 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>354456</td><td></td></tr><tr><td>pH 传感探针</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>8-羟基芘-1,3,6-三磺酸（HPTS）</td><td>Life technologies</td><td>H-348</td><td>避光，室温保存</td></tr><tr><td>5-(和-6)-羧基 SNARF&amp;reg;-1, 乙酰氧基甲基酯，醋酸盐</td><td>Life technologies</td><td>C-1271</td><td>避光、防潮，-20 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Fischer</td><td>BP231-1&amp;nbsp;</td><td>有害</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）100X</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Fischer</td><td>M-12445</td><td>20 g</td></tr><tr><td>磷酸二氢钠</td><td>Fischer</td><td>S369-1</td><td>115 g</td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>J.T Baker</td><td>3246-01</td><td>20 g</td></tr><tr><td>去离子水</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>加至 1 L</td></tr><tr><td>高压灭菌，调节 pH 至 7.4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）1X</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS 100X</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>50 ml</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Fischer</td><td>L-11621</td><td>40.5 g</td></tr><tr><td>去离子水</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>加至 5 L</td></tr><tr><td>pH 调节剂</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>巴佛洛霉素 A1（Bafilomycin A1）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B-1793</td><td></td></tr><tr><td>5-(N-乙基-N-异丙基)阿米洛利（EIPA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3085</td><td></td></tr><tr><td>氯化铵</td><td>Fischer</td><td>A649-500</td><td></td></tr></tbody></table>

使用共聚焦显微镜在活细胞内同时测量内吞体和胞质区室的 ph 值

Simultaneous pH Measurement in Endocytic and Cytosolic Compartments in Living Cells using Confocal Microscopy

细胞内pH值受到严格调控，已有报道指出细胞质与细胞器之间的pH存在差异1。细胞pH的调控对于维持蛋白质、DNA和RNA合成、囊泡运输、细胞生长及细胞分裂等生理过程的稳态控制至关重要。细胞pH稳态的改变可导致有害的功能性变化，并促进多种疾病的发展2。目前已有多种测量细胞内pH的方法，但其中极少有方法能够同时检测细胞质和细胞器内的pH。本文详细描述了一种利用共聚焦显微镜对活细胞进行细胞质和细胞器pH同步测量的快速且准确的方法3。该目标通过使用两种具有选择性细胞区室分布特性的pH比率型荧光染料实现。例如，SNARF-1主要定位于细胞质内，而HPTS则特异性分布于内体/溶酶体细胞器中。尽管HPTS通常被用作细胞质pH指示剂，但该染料在通过胞饮作用被细胞摄取后，可特异性地标记内体-溶酶体通路上的囊泡3,4。利用这些pH感应探针，可同时测量内吞区室和细胞质区室中的pH值。HPTS的最佳激发波长随pH变化而变化，而SNARF-1则是其最佳发射波长随pH变化。在将细胞负载SNARF-1和HPTS后，将其培养于不同pH校准的溶液中，以分别为每种探针构建pH标准曲线。通过共聚焦显微镜进行细胞成像，可有效消除伪影和背景噪声。由于HPTS具有特定的光谱特性，该探针更适用于轻度酸性内体区室的pH测量，或用于展示内体/溶酶体细胞器的碱化过程。该方法简化了数据分析流程，提高了pH测量的准确性，可用于研究细胞对外界刺激响应过程中pH调控相关的基础科学问题。

为了同时测量细胞内和内体/溶酶体区室的pH值，使用了比率型荧光pH传感探针SNARF-1和HPTS。SNARF-1局限于胞质溶胶区室，而HPTS可用于内体/溶酶体区室的比率型pH测量。通过将细胞负载HPTS 16小时，可实现其在内体/溶酶体中的选择性定位4。在图2A中展示了从负载pH传感探针的HT-1080细胞记录到的荧光典型示例。通过与Alexa 546标记的转铁蛋白（内体）或荧光溶酶体探针（Lysotracker Deep Red染料）共染色，证实了HPTS可标记内体和溶酶体两个区室。数据明确显示HPTS对这两个区室均有染色图2A。
采用上述方法，利用每种探针的校准曲线（图 2B 和 2C），根据每种pH敏感染料的比率特性测定了活细胞内的pH值。使用五种校准溶液将荧光强度转换为pH单位。每种pH传感探针的数据均报告了三次独立校准的结果（图 2C）。每个数据点代表在特定pH值下，HPTS在4...

目前有多种方法可用于测量细胞内pH值，但其中极少有方法能够同时测量细胞质和细胞器的pH值。本文详细描述了一种通过活细胞的比率成像技术，快速、准确地同时测定细胞质和囊泡pH值的方法。

使用共聚焦显微镜在活细胞内同时测量内吞体和胞质区室的 pH 值

细胞内pH值受到严格调控，已有研究报道细胞质与细胞器之间的pH值存在差异1。细胞pH值的调控至关重要……

以下实验的总体目标是通过共聚焦显微镜同时测量活细胞中的囊泡内和胞质内的pH值。首先将细胞与pH感应探针HPTS和SNARF-1孵育，分别标记内体和溶酶体区室以及胞质溶胶。随后，将细胞置于共聚焦显微镜下的环境可控培养室中，并设置软件以检测培养室内探针的荧光信号。将细胞与不同pH值的校准溶液共同孵育。使用非线性回归构建pH标准曲线。确定两种探针的指数方程，并据此将样品的荧光强度转换为pH值。该方法可在不同处理后从样品中测定囊泡和胞质的 pH 值，有助于研究生物过程中细胞内 pH 的调控机制。与现有的细胞内 pH 检测方法相比，本技术的主要优势在于能够在活细胞中测量细胞内 pH 动态变化，同时在成像过程中消除伪影和背景噪声。在演示该操作流程时，将由开发该细胞 pH 校准方法的博士研究生 Fess Lucier 进行展示。进行细胞 pH 校准时，需配制一系列共五个 50 毫升的溶液，pH 范围从 5.5 至 7.5，以 0.5 为增量递增。逐滴加入正常浓度的氢氧化钾或盐酸以调节 pH 值。然后向每种 pH 校准溶液中加入 0.05 毫升的 IOR gersin。在细胞外钾去极化浓度存在的情况下，使用含 10% 胎牛血清和抗生素的培养基，在 35 毫米培养皿中接种细胞，每皿 2 毫升，目标是在 37°C 培养 24 小时后达到 50% 汇合度，此时 10 毫摩尔浓度的 gersin 最终工作浓度为 10 微摩尔，可增加细胞膜通透性。在为实验接种所有必需的培养板后，额外接种五块培养板用于校准。将这些培养板分别在成像前 24 小时、24 小时后和 16 小时进行孵育。在第二天早晨，大约三小时后，向溶液中加入两微升浓度为一摩尔的细胞器标记物 HPTS，使 HPTS 的终浓度达到一毫摩尔。成像前，用 PBS 洗涤两次以去除 HPTS。然后加入 2 毫升无血清培养基，使细胞继续孵育至少 2 小时以上。成像前，通过加入10微升1毫摩尔的snf，一，将snf，一终浓度调整为5微摩尔，随后进行snf，一孵育。用PBS洗涤细胞两次，加入2毫升无血清培养基，然后进行成像。细胞。应使用配备电动载物台和环境培养室的光谱倒置扫描共聚焦显微镜对细胞进行成像。当使用塑料培养皿时，最合适的物镜为40倍。软件应设置为两组虚拟通道，并调整激发波长和发射波长。对于 HPTS 和 SNF one，共聚焦光阑默认设置为 175 微米，而最佳光阑需手动设置为 300 微米。待腔室温度升至 37 摄氏度后，开始校准，用 PBS 再洗涤一板细胞两次，然后将培养基更换为第一种校准溶液。现在将细胞放入腔室中，并对两种 pH 敏感染料进行校准，以每分钟一次的频率采集最多 30 张时间序列图像。每个图像堆栈的采集厚度为 0.4 微米，分辨率为 800 像素见方。在图像之间，必须编程控制快门保持关闭状态。每分钟记录一次荧光强度，通常约 20 分钟后荧光强度会趋于稳定。待荧光稳定后，选取包含15至20个细胞以及两种探针的四到五个视野进行成像。这些图像用于曲线计算。对每种校准溶液重复此过程。接着对无需洗涤的实验条件培养板进行成像。在分析每幅图像时，首先从图像中数字减去背景细胞外荧光信号，然后使用二值掩膜从存储的图像中选择标记的囊泡和胞质区域。对于每种pH传感探针，荧光强度的测量范围为0至4,095。计算细胞器或细胞质中所有像素的平均强度。利用这些数值，计算HPTS和snf的荧光比值。用于校准曲线时，将每种校准溶液获得的荧光比值对pH作图，并应使用指数方程进行校准曲线拟合。最后，利用标准曲线将比值转换为 pH 值，从而获得实验条件下活细胞中细胞质和细胞器的 pH 值。通过与 Alexa 546 标记的转铁蛋白共染色标记内体，或与荧光溶酶体探针 LysoTracker 共染色，获得了明确证据，表明 HPTS 可同时标记内体和溶酶体区室。按照 HT 10 80 细胞的方法，为每种探针采集了深红色的时间序列图像。测试了五种校准溶液，以评估探针在溶液中 15 分钟后的荧光稳定性，例如 pH 6 和 pH 7.5 的溶液。在校准曲线中，针对特定 pH 值的数据表示 HPTS 在 558 与 405 纳米处的荧光强度比值，或 SNF1 在 644 与 584 纳米处的荧光强度比值。两条曲线均采用指数方程进行拟合。通过使用氯化铵（一种可提高细胞内pH值的弱碱）评估了该方法在活体HT 1080细胞中的效率。该弱碱可提高细胞质和囊泡的pH值。此外，还使用Bafilomycin A1（一种V-ATPase抑制剂）对该方法进行了评估。Bafilomycin A1可诱导内体和溶酶体区室的碱化，但不会改变细胞质pH值。最后，测试了NHE1的抑制剂EIPA。它使细胞质酸化至pH 6.62，但对pH没有进一步影响。细胞内pH稳态的研究一直受到细胞内快速pH变化以及缺乏细胞内pH检测工具的限制。本文介绍了一种简单、逐步的方法，可同时在单个活细胞中测量细胞质和内体的pH值。这对于研究细胞内pH稳态尤为重要，因为在某些细胞中，基因突变或药物可能会影响内体区室中质子的流入和流出。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

同时进行pH测量的内吞和胞车厢中使用共焦显微镜活细胞

该视频展示了小鼠脑动脉段内皮细胞中细胞内钙水平和膜电位变化的同步测量。分离的内皮管被加载荧光钙指示剂，并用一种诱导细胞内钙释放的药物处理，从而引起膜电位的变化。通过该指示剂的荧光可测量钙水平，同时将记录电极插入细胞以测量膜电位的变化。...

小鼠脑血管内皮细胞中细胞内钙离子与膜电位的同步测量

吞噬细胞通过在其吞噬体中清除和消除入侵的微生物，在先天免疫系统中发挥重要作用。吞噬体……...

活体巨噬细胞中吞噬溶酶体发生的生物学研究

吞噬体的pH值影响吞噬体成熟、活性氧产生、吞噬体杀菌作用以及抗原提呈。本文介绍一种利用荧光显微镜检测活体吞噬细胞中单个吞噬体内pH值随时间变化及终点pH值的比率法。...

通过比率荧光显微镜测量吞噬体pH值

本文描述了一种利用比率荧光指示剂S-1（seminaphthorhodafluor，SNARF-1）来测量人和小鼠中性粒细胞吞噬体pH值与面积以及细胞质pH值的简单方法。该方法通过活细胞共聚焦荧光显微镜结合图像分析实现。...

使用比率型pH指示剂对中性粒细胞吞噬体和细胞质进行成像

线粒体可利用其内膜上的电化学势能（ΔΨm）来摄取钙离子（Ca2+），从而调控细胞质内的Ca2+信号。本文介绍一种利用荧光染料和共聚焦显微镜在活细胞中同时检测线粒体Ca2+摄取和ΔΨm的方法。...

活细胞中线粒体钙与线粒体膜电位的荧光显微镜同步检测

利用对pH敏感的荧光蛋白——超 ecliptic...

利用pHluorin标记的受体监测亚细胞定位与转运

本方案描述了一种基于荧光共振能量转移和荧光寿命成像显微技术，用于定量可视化SNARE蛋白复合物形成的新方法。...

利用荧光寿命成像显微镜观察细胞内SNARE的运输

本文演示了以下实验方案：（1）新鲜分离完整的大脑微血管内皮“管状结构”；（2）在内皮依赖性超极化过程中，同步测量内皮细胞的钙离子浓度和膜电位。此外，这些方法允许将内皮细胞的钙信号和电学信号作为独立或交互的实验变量进行药理学调控。...

同时测量新鲜分离且完整的小鼠脑血管内皮细胞内的钙离子浓度和膜电位

本文介绍了Conpokal技术的实验方案，该技术将共聚焦显微镜与原子力显微镜整合于同一仪器平台。Conpokal可对活体生物样本实现同一细胞、同一区域的近同步共聚焦成像与力学表征。...

活细胞近同步激光扫描共聚焦与原子力显微镜联用技术（Conpokal）

本方案描述了一种共聚焦成像技术，用于检测牛肾上腺嗜铬细胞中的三种融合模式。这些融合模式包括：1）闭合融合（也称为“亲吻即走”模式），涉及融合孔的开放与关闭；2）持续融合，涉及融合孔的开放并维持孔道的开放状态；3）收缩融合，涉及融合囊泡的收缩。...

利用共聚焦显微镜测量肾上腺嗜铬细胞中融合孔动力学的三种模式

该方案描述了一种先进的微流控平台，用于定量测量单个外周血单个核细胞的细胞因子分泌动态。以脂多糖刺激为例，该平台可对每个单个细胞并行检测多达三种细胞因子（IL-6、TNFα 和...

微流控方法解析单个多功能细胞同时与顺序性细胞因子分泌

学习使用共聚焦显微镜同时测量活细胞内囊泡和细胞质的pH值。该方法利用HPTS和SNF F1探针标记内体、溶酶体和细胞质，通过荧光比率成像技术实现实时动态监测，为研究细胞内pH稳态调控机制提供了可靠工具。

使用共聚焦显微镜在活细胞内同时测量内吞体和胞质区室的 pH 值

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