Name: 在Wholemount大鼠视网膜免疫组化和钙成像方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: 学习通过视神经残端注射钙指示剂染料对大鼠视网膜进行整体免疫组化和钙成像的方法。该技术可选择性标记视网膜神经节细胞，用于测量钙动态并评估电压门控钙通道的贡献。

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我们感谢 S. Stella 博士和 Helen Vuong 对钙成像实验方案的贡献。感谢 K. Sheets 博士对访谈场景的拍摄。感谢 Arlene Hirano 博士对稿件提出的修改意见。本研究与开发项目由作者在加州大学洛杉矶分校（UCLA）大卫·格芬医学院完成，项目的实施得益于美国陆军医学研究与物资司令部授予并管理的合同协议支持。 &amp;#38; 物资司令部（USAMRMC）与远程医疗 &amp;#38; 先进技术研究中心（TATRC），位于马里兰州德特里克堡，合同编号：W81XWH-10-2-0077。本研究还获得了美国国立卫生研究院（NIH）EY04067 项目以及退伍军人事务部（VA）杰出研究奖（NB）的支持。NCB 是退伍军人事务部职业研究科学家。

所有实验均遵循美国卫生公共服务部发布的《实验动物福利指南》以及加州大学洛杉矶分校（UCLA）动物研究委员会关于实验动物护理与使用的政策进行。实验使用3至5周龄的雄性和雌性成年斯普拉格-道利大鼠（Charles River Lab，马萨诸塞州威尔明顿）。
1. 全片视网膜制备与免疫组织化学实验方案的动物与组织准备
<ol>
	<li>准备以下材料和工具：解剖显微镜、两把尖端非常细的镊子、剪刀、纤维素滤纸、塑料移液管和显微镜载玻片。</li>
	<li>在密闭容器中通过1-3%异氟烷深度麻醉大鼠使其安乐死，随后使用断头器断头。用虹膜剪剪下眼球并置于含有细胞外溶液的培养皿中。推荐使用Hibernate A、Ames培养基或生理溶液。</li>
	<li>[如需用Fluo-4逆行标记视网膜神经节细胞（RGCs）则执行此可选步骤]。按照步骤2.3-2.4所述进行Fluo-4标记。</li>
	<li>在解剖显微镜下（光照强度：1.6 × 108 光子/mm2⋅秒），剪除眼球前部以去除角膜。用镊子从视网膜内表面移除晶状体和玻璃体。去除玻璃体时，用一把镊子牢固夹住巩膜以固定眼球，用另一把镊子从视网膜周边向中心方向轻轻剥离玻璃体基部。此阶段制备完成的组织称为眼杯（eyecup），用于制备冷冻切片。有关冷冻切片的更多细节可参见文献14,15。</li>
	<li>从眼杯上取下视网膜，然后做四个切口，使视网膜能够平展铺开。将视网膜感光细胞层朝上轻轻贴附在载玻片上。向视网膜滴加一滴溶液，并在其上放置纤维素滤纸。待视网膜附着于滤纸上后，将其重新放回溶液中。如有需要，可用毛刷或镊子轻轻压平视网膜。</li>
	<li>将整体视网膜放入4%多聚甲醛（PFA）中固定10-15分钟。</li>
	<li>用0.1 M磷酸盐缓冲液（PB，pH 7.4）清洗整体视网膜三次，每次30分钟。在含0.3% Triton-X 100和0.1% NaN3的0.1 M PB中，加入5%正常山羊血清或驴血清，于4 °C封闭过夜。为节约封闭液和抗体用量，建议所有步骤使用500 μl的终体积。</li>
	<li>次日，在4 °C下用一抗孵育整体视网膜5-7天。最佳稀释比例需由使用者自行确定。</li>
	<li>用0.1 M PB清洗视网膜三次，每次30分钟，然后在4 °C下用针对一抗宿主物种的荧光标记二抗（稀释比例1:1,000）避光孵育过夜。</li>
	<li>最后用PB清洗三次，每次30分钟，将视网膜封片于封片剂中。用指甲油密封盖玻片以便长期保存。样品储存于4 °C并避光。</li>
</ol>
2. 使用钙离子指示剂染料对大鼠全层视网膜中神经节细胞及其轴突进行标记
<ol>
	<li>配制 1,000 ml 哺乳动物任氏液，其中含有（单位为 mM）125 NaCl、3 KCl、2 CaCl2、1.25 NaH2PO4、1 MgCl2、25 NaHCO3 和 10 葡萄糖，并用 95% O2/5% CO&#173;2 混合气体饱和。</li>
	<li>按照步骤 1.2–1.4 所述进行解剖操作。</li>
	<li>为了将钙离子指示剂染料加载至视网膜神经节细胞（RGCs）及其轴突中，使用注射器将 0.5 μl 的 Fluo-4 五钾盐（40 mM 储存液，溶于 H&#173;2O）注入视神经残端，注射位置位于眼球后方约 1 mm 处。为检测神经节细胞内 [Ca2+]i 的动态升高，应选用高亲和力的指示剂，例如 Kd 为 345 nM 的 Fluo-4，其为最优选择。Fluo-4 还具有极高的量子效率优势，与钙结合后荧光发射强度可增加 &#62;100 倍。</li>
	<li>将眼杯置于用 95% O2/5% CO&#173;2 混合气体饱和的哺乳动物任氏液中，在室温避光条件下孵育 1 小时。</li>
</ol>
3. 视网膜神经节细胞及其轴突的钙成像实验方案。
<ol>
	<li>按照步骤1.1-1.4所述去除眼球、晶状体和玻璃体。从眼杯中分离视网膜并将其分为四个象限。取其中一个象限，神经节细胞面朝上固定于载玻片上，并使用网格切片固定器（harp slice grid）加以稳定。其余组织块则在以95% O₂ 与5% CO₂ 混合气体饱和的哺乳动物任氏液（mammalian Ringer's）中保持暗适应状态2/ 5% CO₂&#173;2 置于冰上以备后续使用。</li>
	<li>用哺乳动物林格氏液灌流记录室，并持续以95% O₂2/5% CO₂2.</li>
	<li>在显微镜下观察组织。实验在室温（约 23 °C）下进行，或通过加热载物台、加热标本下方的水浴，或向标本表面施加暖风，以达到生理温度。 
	注意：许多细胞功能受温度调控，而温度在维持细胞内稳态中起着关键作用16然而，引入加温措施可能会加快光漂白速率、培养基蒸发以及由热膨胀引起的焦平面漂移17使用室温可降低 Fluo-4 的细胞内区室化18.</li>
	<li>进行两组配对的高K对照+ 在无药物条件下刺激脉冲。通过提高[K+]o 从3 mM到60 mM，每次脉冲持续33秒，通过八通道重力驱动的灌流系统激活电压门控钙通道（VGCCs）。降低Na+ 通过添加 57 mM 来维持高 K+ 条件下的等渗状态+ 溶液</li>
	<li>利用广谱或特异性钙通道阻断剂评估不同电压门控钙通道（VGCCs）对钙信号的贡献。例如，加入非特异性钙通道阻断剂钴离子后钙信号的降低，可半定量地反映VGCCs在高K⁺诱导的钙信号中的作用+-诱发的钙信号</li>
	<li>通过在目标RGCs周围设置感兴趣区域（ROI）来获取荧光强度值（图2).</li>
	<li>标准化第二次高钾刺激引起的荧光强度变化+ 峰值与第一次高钾引起的变化相对应+ 峰。随后，在测试特异性钙通道阻滞剂时，仅在第二次高钾刺激期间给予药物+ 一对脉冲的峰值，并将该峰值相对于第一个峰值进行归一化，以测量药物对高K⁺诱导的反应的影响+ 峰值，将第二个K的振幅除以+ 峰值与第一个峰值进行比较。应针对这些数值与其配对的高K对照组进行分析。+ 在无药物存在时测得的峰</li>
	<li>以5秒间隔采集图像。为避免光漂白，应尽可能降低激光激发强度。使用氩离子激光器的488 nm谱线进行激发，同时通过505 nm长通滤光片由光电倍增管收集荧光发射信号。</li>
</ol>

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</ol>

作者无披露信息。

本文中，我们描述了两种不同的技术：1）免疫组织化学法，用于显示Fluo-4在视网膜铺片中节细胞的定位；2）钙成像法，用于分析视网膜节细胞及其轴突中的钙动力学。
利用全组织样本进行免疫组织化学染色已被用于揭示蛋白质在啮齿类动物视网膜中的定位20-23。然而，该方法存在一些局限性。染色质量在很大程度上依赖于抗体对其相应抗原的识别能力，以及其穿透视网膜组织到达特定目标层的能力。这些问题可通过延长一抗孵育时间至最多七天、增加Triton-X的浓度，和/或在孵育过程中去除滤纸以促进抗体穿过神经节细胞层和感光细胞层来改善。另一个局限性在于固定的时间和浓度。某些抗体在组织固定一小时时效果更佳，而其他抗体则需要更短的固定时间。同样，某些抗体在4%多聚甲醛（PFA）固定条件下效果最佳，而另一些抗体在较低浓度下表现更好。我们建议使用者根据具体实验条件优化固定时间与浓度、孵育时间、Triton-X浓度以及一抗浓度，以获得最佳结果。
钙成像被用于研究视网膜神经节细胞及其轴突中的钙动力学。通过灌流电压门控钙通道（VGCC）阻断剂，...

视网膜神经节细胞（RGCs）表达L型、N型、P/Q型和T型电压门控钙通道（VGCC），该结论基于对全细胞钙通道电流中这些组分进行药理学阻断的研究1,2。VGCC是跨膜多聚体蛋白，参与神经递质释放、基因转录、细胞调控以及突触可塑性3,4,5。功能性的VGCC至少由三类不同的亚基组成：形成孔道的大跨膜α1亚基，决定通道的生物物理特性和药理学特性；主要位于细胞外的辅助性α2δ亚基；以及细胞内的β亚基。后两种亚基可与不同的α1亚基形成异源复合物，从而调节通道的门控动力学及其向细胞膜的转运6。
近几十年来，已有多种技术被用于研究蛋白质表达，如免疫组织化学、酶联免疫吸附测定、蛋白质印迹分析和流式细胞术。这些技术需要使用特异性抗体来检测目标蛋白质，为特定蛋白质在不同组织中的定位与分布提供了强有力的工具。当缺乏现成的抗体或某种蛋白质的表达水平较低时，可采用检测和定量特定蛋白质mRNA表达水平的技术作为替代方法，例如RNA印迹分析、逆转录PCR、实时定量逆转录PCR、原位杂交、cDNA微阵列以及核糖核酸酶保护实验7。然而，这类分子生物学技术的一个局限性在于必须事先明确目标基因的序列信息。
为了在视网膜中定位蛋白质，可在视网膜全层标本上进行免疫组织化学染色。由于视网膜神经节细胞（RGCs）易于接近，全层制备为研究特定蛋白质在RGC胞体及其轴突中的定位提供了优良的平台。
除了定位之外，还可以通过钙成像技术来展示视网膜神经节细胞（RGCs）中电压门控钙通道（VGCCs）的某些功能特性。本文描述了一种钙成像实验方案，通过使用钙离子指示剂染料对RGCs进行选择性标记，以检测细胞内钙离子动态变化。利用亚型特异性的钙通道阻断剂，可分离出不同VGCC亚型在细胞不同区域钙信号中的贡献。
此处所述的钙成像技术最具优势的特点之一，是能够同时且独立地记录多个视网膜神经节细胞（RGCs）及其轴突的活动。尽管许多生理学技术（如全细胞膜片钳记录）能够以高时间分辨率记录膜电流，但无法区分这些电流的胞体或轴突来源，且每次只能记录单个神经元。多电极阵列（MEAs）能够同时记录多个细胞的动作电位，但既无法检测也无法区分例如不同亚型的钙通道的激活情况。&#160; MEAs 主要记录靠近特定电极的细胞8，并倾向于记录产生较大动作电位的细胞9。光学成像方法提供了一种替代策略，可实现对整个细胞群体的同时且独立的记录，并能与单细胞微电极、膜片钳记录以及 MEA 记录所获得的信息相互整合。&#160; 尽管此处描述的钙成像技术用于研究 RGCs 的钙动力学，但膜片钳和 MEA 技术也可并行使用，以进一步阐明 RGCs 的离子电流和放电特性。
由于移位的无长突细胞约占小鼠视网膜节细胞层神经元总数的60%10，我们的目标是采用一种选择性地将视网膜神经节细胞（RGCs）用合成钙指示剂染料进行标记的负载技术，用于视网膜全层铺片制备。尽管合成钙指示剂染料为研究细胞内钙动力学提供了优良的平台，但其广泛应用受到限制，原因在于难以有效地将特定神经网络中的特定神经元群体进行有效负载。&#160; 已有多种技术被用于对整群细胞进行负载，例如批量负载11和电穿孔8,12，然而这些技术无法区分特定的细胞类型。基因编码的钙指示剂能够实现对特定细胞群体的选择性标记，但此类方法需要构建转基因动物模型13。本技术描述了一种通过视神经残端注射钙指示剂染料，在视网膜全层铺片制备中选择性标记RGCs的方法。
综上所述，本文所述的结构与生理学技术为研究电压门控钙通道（VGCCs）在视网膜神经节细胞及其轴突中钙信号的定位与作用提供了平台。&#160;

<table><tbody><tr><td>直剪刀</td><td>WPI</td><td>14124-G</td><td>解剖工具</td></tr><tr><td>直镊</td><td>WPI</td><td>501985</td><td>解剖工具</td></tr><tr><td>弯头虹膜剪</td><td>WPI</td><td>504487</td><td>解剖工具</td></tr><tr><td>纤维素滤纸</td><td>Millipore</td><td>HABP04700</td><td></td></tr><tr><td>Hibernate A</td><td>Invitrogen</td><td>&lt;a href=&quot;http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catProductDetail&amp;amp;productID=A1247501">A12475-01&lt;/a&gt;</td><td>培养基</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector</td><td>H-1000</td><td>&lt;a href=&quot;https://www.google.com/url?sa=t&amp;amp;rct=j&amp;amp;q=&amp;amp;esrc=s&amp;amp;source=web&amp;amp;cd=1&amp;amp;cad=rja&amp;amp;sqi=2&amp;amp;ved=0CC0QFjAA&amp;amp;url=http%3A%2F%2Fwww.vectorlabs.com%2Fcatalog.aspx%3FcatID%3D279&amp;amp;ei=VAHbUb_fBceeiQLK2IHIDw&amp;amp;usg=AFQjCNHijFTTB8p19FMPQ5hg_qTawXU9mA&amp;amp;sig2=FJCfB9fzKR_TmjxoGvhLcg&amp;amp;bvm=bv.48705608,d.cGE">荧光封片剂&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Fluo-4 五钾盐</td><td>Invitrogen</td><td>F-14200</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>雅培实验室</td><td>05260-05</td><td>麻醉剂</td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>费舍尔科技</td><td>22-178-277</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 5 Pascal 显微镜</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axioplan 40X (NA 0.8) 物镜</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 山羊抗兔 IgG (H+L) 抗体</td><td>分子探针</td><td>A-11034</td><td>二抗</td></tr><tr><td>RBPMS</td><td>ProSci, Poway, CA</td><td></td><td>由商业供应商（ProSci, Poway, CA）针对 RBPMS 多肽 N 端序列（RBPMS4-24），GGKAEKENTPSEANLQEEEVR，制备了兔多克隆抗体&amp;nbsp;&amp;nbsp;。</td></tr></tbody></table>

大鼠视网膜全层标本的免疫组织化学与钙成像方法

Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina

本文中，我们介绍了进行以下实验所需的工具、试剂和具体操作步骤：1）成功制备用于免疫组织化学的全层视网膜样本；2）对视网膜神经节细胞中电压门控钙通道（VGCC）介导的钙信号进行钙成像研究。我们所描述的钙成像方法可避免视网膜神经节细胞层中移位的无长突细胞非特异性染料加载问题。

使用特异性抗体进行免疫标记可为研究特定感兴趣蛋白在视网膜中的定位提供平台，而钙成像技术则可用于研究电压门控钙通道（VGCCs）对视网膜神经节细胞及其轴突中钙动力学的贡献。
通过使用针对视网膜神经节细胞蛋白 RBPMS（RNA 结合蛋白，多剪接型）的抗体，该抗体可特异性标记视网膜神经节细胞（RGCs）19，我们证实 Fluo-4 的标记局限于神经节细胞（图 1）。 stump 注射并不会如该技术所预期的那样标记所有神经节细胞。
通过商业供应商针对RBPMS多肽（RBPMS4-24）N端序列GGKAEKENTPSEANLQEEEVR制备了兔多克隆抗体（表1）。RBPMS在哺乳动物中高度保守，用于免疫的多肽序列在小鼠、大鼠、猴和人中完全相同（NCBI蛋白质数据库，<a href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein...

免疫组织化学实验方案用于研究特定蛋白质在视网膜中的定位。钙成像技术用于研究视网膜神经节细胞及其轴突中的钙动力学。

本文中，我们介绍了所需的工具、试剂以及实际操作步骤，包括：1）成功制备用于……的全层视网膜样本

本实验的总体目标是通过向视神经残端注射钙离子指示剂染料，从而在视网膜整体装片中特异性标记视网膜神经节细胞。该方法首先将一种高亲和力的钙离子指示剂染料（例如Fluo-4）注入视神经残端；随后，将视网膜从眼球杯状结构中分离，并分割为四个象限，装片于玻璃载片上。在模拟生理条件的记录装置中，可进一步研究电压门控钙通道对钙信号的贡献。在去极化细胞中，可通过通道阻断剂测量视网膜神经节细胞的活动。最终，该方法可提供电压门控钙通道对特定信号（如高钾诱发的钙信号）贡献程度的半定量测量结果。与现有方法（如电穿孔和批量负载）相比，该技术的主要优势在于能够在整体装片标本中选择性地标记视网膜神经节细胞及其轴突，标本可储存、解剖活体动物的眼睛，并置于 Ames 培养基或类似溶液中保存。现在，如果你打算进行钙成像实验，需用Fluo-4对视网膜神经节细胞进行逆向填充。将0.5微升浓度为40毫摩尔的Fluo-4五钾盐（溶于水中）注射至视神经残端，注射位置约为眼球后方1毫米处。随后将眼球转移至哺乳动物林格液中。用95%氧气和5%二氧化碳混合气体通气，在室温下孵育1小时。将制备物避光保存。在显微镜下解剖眼睛，控制光照强度。使用剃须刀片在眼球前部轻轻划开一个小切口，取出角膜。然后用镊子从视网膜内表面取下晶状体。牢固握住巩膜。使用另一把镊子去除玻璃体时，应轻柔地将玻璃体基部向视网膜中心方向剥离。所获得的标本称为I杯，可用于免疫组织化学全装片制备、钙成像制备，或制备成横断面视网膜切片以进行免疫组织化学全装片制备。首先，对视网膜做四个切口，使其平铺展开。将视网膜放置在玻璃盖玻片上，使节细胞层朝下。第二步，在视网膜上滴加一滴溶液，必要时用纤维素滤纸覆盖，并用刷子或镊子将视网膜压平。第三步，当视网膜完全展平并与滤纸分离后，将其放回溶液中。首先进行样品处理，将其转移至4%多聚甲醛中固定10至15分钟。随后用pH 7.4的0.1摩尔磷酸盐缓冲液洗涤视网膜，每次30分钟，共洗涤三次，总计90分钟。接着，在4摄氏度下，将视网膜置于500微升封闭液中过夜孵育。该溶液为含5%正常山羊血清或驴血清的磷酸盐缓冲液，其中加入0.3% Triton和0.1%叠氮化钠，在接下来的五至七天内，将视网膜组织在4摄氏度下孵育于一抗溶液中。该溶液的具体配比需通过实验经验确定。一抗溶液的清洗方法与去除固定剂的方法相同。然后将视网膜在浓度为1:1000的二抗溶液中4°C孵育过夜。用磷酸盐缓冲液再清洗三次，去除二抗。随后将视网膜封片以进行观察，并用指甲油封固。这些载玻片必须在4°C避光保存。首先，从林格氏液中的I杯制备钙成像整体装片。第一步，将视网膜组织切成四个象限。将一个象限的视网膜平放在记录室中，节细胞层朝上，因此感光细胞层朝下。用无尘纸小心擦干周围区域，轻轻将涂有油脂的金属丝网置于组织上。现在将视网膜制备物装入记录装置，并完成八通道重力驱动的灌流系统的设置。如果在放置音叉后固定好的视网膜发生移动，请小心取下并清洁音叉。干燥视网膜周围的区域，然后重新安装音叉。用哺乳动物林格溶液填充记录室，并持续用95%氧气和5%二氧化碳混合气体通气。首先，作为无药物的对照，从3毫摩尔到60毫摩尔进行两次成对的高钾脉冲刺激，每次持续33秒。如果制备成功，去极化应使视网膜神经节细胞（RGC）激活电压门控钙通道。现在开始进行实验。硝苯地平是一种L型电压门控钙通道阻滞剂，常用于评估L型电压门控钙通道对去极化诱发的钙信号钴的贡献。可使用非特异性钙通道阻滞剂非选择性地阻断电压门控钙通道。每5秒扫描一次样本，以观察并获取荧光视网膜神经节细胞（rgc）的图像。尽可能使用最低的激光功率。激发波长应设置为 488 纳米，发射光应通过 505 纳米长通滤光片收集。根据所述方案，对视网膜神经节细胞蛋白 R-B-P-M-S 进行了免疫标记，该蛋白是一种具有多种剪接形式的 RNA 结合蛋白。根据抗体说明书，染色确实仅限于神经节细胞。接下来，利用从RGC获得的荧光强度值，研究了电压门控钙通道对RGC中钙信号的贡献。在基础水平下，可见RGC及其轴突被flow four标记。为了获取荧光强度值，将感兴趣区域（ROI）置于神经节细胞、胞体和/或轴突上。在全装片标本上施加高钾溶液后，视网膜神经节细胞（RGC）的荧光信号增强。随后，在第二次高钾刺激期间加入钴离子后，荧光强度值出现下降。观看本视频后，您应能够充分理解如何在视网膜全层铺片标本中选择性地将合成钙离子荧光指示剂染料加载至视网膜神经节细胞。

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科研

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神经科学

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