大鼠视网膜全层标本的免疫组织化学与钙成像方法

本实验的总体目标是通过向视神经残端注射钙离子指示剂染料，从而在视网膜整体装片中特异性标记视网膜神经节细胞。该方法首先将一种高亲和力的钙离子指示剂染料（如Fluo-4）注入视神经残端；随后，将视网膜从眼球杯状结构中分离，并分割为四个象限，装片于玻璃载片上。在模拟生理条件的记录装置中，可进一步研究电压门控钙通道对钙信号的贡献。

在去极化细胞中，可通过通道阻断剂测量视网膜神经节细胞的活动。最终，该方法可提供电压门控钙通道对特定信号（如高钾诱发的钙信号）贡献程度的半定量测量结果。与现有方法（如电穿孔和批量负载）相比，该技术的主要优势在于能够在整体装片标本中选择性地标记视网膜神经节细胞及其轴突，标本可保存于解剖后的鼠眼，并置于 Hibernate A 培养基或类似溶液中。

现在，如果你打算进行钙成像实验，需用Fluo-4对视网膜神经节细胞进行逆向填充。将0.5微升浓度为40毫摩尔的Fluo-4五钾盐（溶于水中）注射到视神经残端，注射位置位于眼球后方约1毫米处。随后将眼球转移至哺乳动物林格液中。

用95%氧气和5%二氧化碳混合气体通气，在室温下孵育1小时。将制备物避光保存。在显微镜下解剖眼睛，控制光照强度。

使用剃须刀片在眼球前方轻轻划开一个小切口，取出角膜。然后用镊子从视网膜内表面取下晶状体。牢固握住巩膜。

使用另一把镊子去除玻璃体时，应轻柔地将玻璃体基部向视网膜中心方向剥离。所获得的标本称为I杯，可用于免疫组织化学全装片制备、钙成像制备，或制备成横断面视网膜切片以进行免疫组织化学全装片制备。首先，对视网膜做四个切口，使其平铺展开。

将视网膜放置在玻璃盖玻片上，使节细胞层朝下。第二步，在视网膜上滴加一滴溶液，必要时用纤维素滤纸覆盖，并用刷子或镊子将视网膜压平。第三步，当视网膜完全展平并与滤纸分离后，将其重新放回溶液中。

首先进行样品处理，将其转移至4%多聚甲醛中固定10至15分钟。随后用pH 7.4的0.1摩尔磷酸盐缓冲液洗涤视网膜，每次30分钟，共洗涤三次，总计90分钟。接着，在4摄氏度下，将视网膜置于500微升封闭液中过夜孵育。

该溶液为含5%正常山羊血清或驴血清的磷酸盐缓冲液，其中加入0.3% Triton和0.1%叠氮化钠。接下来五至七天内，在4摄氏度条件下将视网膜组织孵育于一抗溶液中。该溶液的具体配比需通过实验经验确定。一抗溶液的清洗方法与去除固定剂的方法相同。

然后将视网膜在浓度为1:1000的二抗溶液中4°C过夜孵育。用磷酸盐缓冲液再清洗三次，去除二抗。随后将视网膜封片以进行观察，并用指甲油封固。

这些载玻片必须在4°C避光保存。首先，从林格氏液中的I杯制备钙成像整体装片。第一步，将视网膜组织切成四个象限。

将一个象限的视网膜平放在记录室中，节细胞层朝上，因此感光细胞层朝下。用无尘纸小心擦干周围区域，轻轻将涂过油脂的网格压在组织上。现在将视网膜制备物装入记录装置，并完成八通道重力驱动的灌流系统的设置。

如果在放置音叉后固定好的视网膜发生移动，请小心取下并清洁音叉。干燥视网膜周围的区域，重新安装音叉。用哺乳动物林格溶液填充记录室，并持续用95%氧气和5%二氧化碳混合气体通气。

首先，作为无药物的对照，从3毫摩尔到60毫摩尔进行两次成对的高钾脉冲刺激，每次持续33秒。去极化过程中，若制备成功，视网膜神经节细胞（RGC）应激活电压门控钙通道。随后开始实验。

硝苯地平是一种L型电压门控钙通道阻断剂，常用于评估L型电压门控钙通道对去极化诱发的钙信号钴的贡献。可使用非特异性钙通道阻断剂非选择性地阻断电压门控钙通道。每5秒扫描一次制备样本，以观察并获取荧光视网膜神经节细胞（rgc）的图像。

尽可能使用最低的激光功率。激发波长应设置为 488 纳米，发射光应通过 505 纳米长通滤光片收集。根据所述方案，对视网膜神经节细胞蛋白 R-B-P-M-S 进行了免疫标记，该蛋白是一种具有多种剪接形式的 RNA 结合蛋白 Four。

根据抗体说明书，染色确实仅限于神经节细胞。接下来，利用从rgc获得的荧光强度值，研究了电压门控钙通道对RGCs中钙信号的贡献。在基础水平下，可见RGC及其轴突被flow four标记。

为了获取荧光强度值，将感兴趣区域（ROI）置于神经节细胞、胞体和/或轴突上。在全层制备样本中施加高钾溶液后，视网膜神经节细胞（RGC）的荧光信号增强。随后，在第二次高钾刺激期间加入钴离子后，荧光强度值出现下降。

观看本视频后，您应能够充分理解如何在视网膜全层铺片标本中选择性地将合成钙离子指示剂染料加载至视网膜神经节细胞。