Name: HIV逆转录酶和整合酶抑制剂的快速筛选 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-09T21:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 46 s
Description: 了解利用荧光素酶报告基因检测HIV-1逆转录酶和整合酶抑制剂的快速筛选方法。该技术可评估化合物对野生型及耐药HIV-1的抗病毒活性与细胞毒性，为抗逆转录病毒药物研发提供高效工具。

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本研究由美国国家癌症研究所（NCI）院内研究计划资助。

1. 主储备液的制备
<ol>
	<li>用DMSO配制待测化合物的母液，标准浓度为20 mM。 
	注意：浓度高于10 mM均可使用。可用于验证本实验的阳性对照化合物包括RAL、EVG和DTG。</li>
	<li>通过涡旋振荡溶液每次15秒，重复多次，并在室温孵育1小时，确保化合物完全溶解于DMSO中。将20 mM的母液避光保存于-20 °C，直至使用。</li>
</ol>
2. 化合物筛选用96孔板的制备
<ol>
	<li>选择待检测的细胞系（例如 HOS 或 TZM-bl），以每孔 100 µl、密度为 4 × 10⁴ 个细胞4 细胞/ml（4,000 个细胞/孔）于培养基中（例如 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM），添加 5% (v/v) 胎牛血清、5% 新生牛血清以及青霉素（50 单位/毫升）和链霉素</li>
</ol>
3. 病毒毒株的制备
通过转染293细胞来制备VSV-g假型HIV（如图1步骤1所示）32-34。
<ol>
	<li>转染前一天，将293细胞以每100 mm直径培养皿1.5 × 106个细胞的密度接种。</li>
	<li>转染当天，采用磷酸钙法35，用16 µg野生型或突变型HIV（pNLNgoMIVR-ΔLUC）和4 µg VSV（pHCMV-g）转染293细胞。</li>
	<li>加入磷酸钙沉淀后约6 hr&#160;，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤293细胞两次，随后更换新鲜培养基继续培养48 hr。[DMEM培养基&#160;中添加5%（v/v）胎牛血清、5%新生牛血清，以及青霉素（50 units/ml）和链霉素（50 µg/ml）]。</li>
	<li>通过从100 mm直径培养皿中收集培养上清液来收获含病毒的上清液，以3,000 rpm低速离心10 min澄清上清液，再经45 µm&#160;孔径&#160;的一次性针筒滤器过滤，室温下用Turbo DNase处理30 min，然后用培养基稀释，用于后续感染实验。将病毒上清液分装后于-80 °C冷冻保存。 
	注意：使用HIV-1 p24酶联免疫吸附试验试剂盒测定上清液中的p24含量，并以此浓度控制样品中病毒的加入量。感染前一天，将1.5 ×&#160;105个细胞/皿的HOS细胞接种于60 mm直径培养皿中，每皿加入约500 ng病毒。感染后继续培养48 hr&#160;，收集细胞，离心沉淀，洗涤后重悬于100 µl PBS中。加入等体积的发光报告基因检测试剂，按照第5.4.1和5.4.2节所述方法检测荧光素酶活性。据此可确定病毒的合适稀释倍数，具体见步骤4.6中的说明。</li>
</ol>
4. 96孔板中的化合物筛选
每种化合物均需进行三次重复实验，并对结果取平均值。
注意：每种化合物对病毒复制的影响均通过归一化至无任何化合物存在时的复制水平进行校正。
<ol>
	<li>确定需要筛选的实测浓度范围。 
	注意：通常情况下，包含11个连续稀释浓度的筛选通过逐列向孔板中添加化合物来实现，而包含7个连续稀释浓度的筛选则通过逐行添加化合物完成。必须保留一组三复孔用于无化合物对照。此外，需留出一列或一行作为空白，作为阴性/背景对照。&#160;最后，是否加入病毒取决于实验类型是细胞毒性检测还是感染性检测。&#160;</li>
	<li>从20 mM的储备液中制备系列稀释液。稀释浓度的选择应基于预先确定的待测浓度范围（如表1所示）。将稀释液用培养基配制为所需终浓度的10倍，即若终浓度为100 µM，则配制1 mM的工作液。 
	注意：IC50值高于5–10 μM的化合物通常不适合作为药物开发的候选物。在初步实验中，我们仅使用野生型（WT）载体对化合物进行测试。对有效抑制野生型载体的有前景化合物，将进一步在一组耐药突变体上进行测试。&#160;</li>
	<li>从培养箱中取出96孔板，将待测化合物的系列稀释液以每孔三复孔的方式加入孔中（如图1步骤2所示）。 
	注意：加入孔中的体积应为终体积的1/10。因此，在感染性检测中，每孔加入22 µl（病毒加入后的终体积为220 µl）；在细胞毒性检测中，每孔加入11 µl（终体积为110 µl/孔）。</li>
	<li>将96孔板放回培养箱。对于细胞毒性筛选，于37 °C继续孵育48小时&#160;，之后无需进一步操作，直接进入方案5。对于感染性检测，请继续执行方案4中的后续步骤。</li>
	<li>仅适用于感染性检测。在化合物于37 °C孵育至少3小时后&#160;至少3小时&#160;，将孔板从培养箱中取出。 
	注意：此步骤可确保在用HIV载体感染前，细胞已充分摄取化合物。</li>
	<li>制备病毒的稀释储备液33,34（通常约为1:3），使其在未处理细胞中产生的荧光素酶信号介于0.2–1.5相对荧光素酶单位（RLUs）之间。整块板大约需要10 ml稀释后的病毒。使用8通道或12通道多道移液器，向每个孔中加入100 µl病毒。阴性/背景对照孔中不加病毒。将孔板放回37 °C培养箱中孵育48小时。 
	注意：根据p24检测结果，若上清液中病毒浓度约为500 ng/1.0 ml，则1:3的病毒稀释比例通常可产生0.2–1.5 RLUs的荧光素酶信号。</li>
</ol>
5. 在96孔板中进行细胞毒性和感染性的制备与测定
<ol>
	<li>吸去孔板中的培养基（培养基中的酚红可能干扰荧光素酶信号）。使用末端连接200 µl吸头的玻璃移液管，从培养基液面顶部开始，缓慢移向孔底角落。在孔底部停留时间不宜过长，以免细胞被吸出。</li>
	<li>向每孔中加入100 µl含0.5 mM MgCl2的PBS。此步骤需在去除培养基后立即进行，以防止细胞干燥。</li>
	<li>仅用于细胞毒性检测时，向每瓶提供的冻干试剂中加入5 ml来自荧光素ATP检测试剂盒的底物缓冲液。每瓶足够用于一块96孔板。
	<ol>
		<li>向每孔中加入50 µl来自荧光素ATP检测试剂盒的细胞裂解缓冲液。使用小型恒温混匀仪，在室温下以700 rpm振荡96孔板5分钟。</li>
		<li>向除阴性对照/背景孔外的所有孔中加入50 µl重悬后的荧光素ATP检测试剂。使用小型恒温混匀仪，在室温下以700 rpm振荡5分钟。将孔板在室温下孵育20分钟&#160;，以使信号充分发育。</li>
		<li>使用微孔板发光仪读取96孔板。 
		注意：打开SoftMax Pro微孔板发光仪程序。确保发光仪设置为以每孔5次读数的灵敏度检测发光信号。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>仅用于感染性检测时，向每瓶提供的冻干试剂中加入10 ml来自荧光素报告基因检测试剂盒的底物缓冲液。每瓶足够用于一块96孔板。
	<ol>
		<li>向每孔中加入100 µl重悬后的荧光素报告基因检测试剂。在室温下孵育20分钟&#160;，以使信号充分发育。</li>
		<li>按照第5.3.3节所述方法，使用微孔板发光仪读取96孔板。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6.&#160;化合物CC50和IC50值的测定
<ol>
	<li>将荧光素酶数据从微孔板发光仪转移至 Excel 电子表格中。
	<ol>
		<li>对三份重复的荧光素酶数据以及背景/对照信号数据取平均值。从整个浓度范围内的三份重复信号平均值中减去平均背景/对照信号。</li>
		<li>将经背景校正后的平均信号相对于无化合物存在时的活性（无论是细胞毒性还是感染性）进行归一化，以确定抑制百分率。 
		注：抑制百分率定义为药物存在时的荧光素酶活性除以药物不存在时的荧光素酶活性再乘以 100。&#160;</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 Kaleidagraph 软件获取 CC50 和 IC50 值
	<ol>
		<li>将实验测定的浓度范围和荧光素酶活性抑制百分率数据输入 Kaleidagraph 软件。</li>
		<li>以浓度范围为 x&#160;轴，荧光素酶活性抑制百分率为 y&#160;轴绘制数据图。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Butler, S. L., Hansen, M. S., Bushman, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+assay+for+HIV+DNA+integration+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">A quantitative assay for HIV DNA integration in vivo.</a> Nat. Med. 7, 631-634 (2001).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们描述了一种快速、高效且可重复的检测方法，可用于筛选化合物对野生型和耐药型 HIV-1 的细胞毒性及其抑制病毒复制的能力。在开发新型和改进型抗 HIV-1 药物过程中，快速鉴定化合物并评估其有效性和细胞毒性至关重要。一旦确定了先导化合物，即可利用该检测方法合成并测试其类似物。该检测方法相对简单，包含阳性和阴性对照，可帮助使用者诊断最常见的问题（如化合物毒性、载体储备液问题）。通过设置三组未添加化合物的孔，可验证病毒已成功感染。由于细胞毒性在独立的检测体系中进行测量，因此可避免将由细胞毒性引起的荧光素酶活性降低误判为对病毒复制的特异性抑制作用。
该实验方案的关键步骤包括：制备培养板，使细胞在各孔中均匀分布；确保各孔中含有适当浓度的待测化合物；向每孔加入等量的病毒；以及检测荧光素酶活性，以确定CC50和IC50值。
该检测方法安全、定量且可重复。其安全性源于所用载体具有复制缺陷性。该检测方法能够定量且可重复，是因为它基于单周期载体系统，该载体表达荧光素酶，可被准确而便捷地检测。在多周期病毒复制检测中，测得的IC50值依赖于病毒生命周期的轮数；当检测同时涉及野生型病毒和药物抗性病毒时，这一问题尤为突出，因为这些病毒可能具有显著不同的复制能力。
此前已有多种酶学检测方法被报道，可用于筛选整合酶（IN）抑制剂。那些利用实时PCR技术检测整合DNA的检测方法需要纯化的重组蛋白，通常更为耗时且成本较高36,37。尽管可以使用酶学检测方法来评估化合物对其他病毒酶（如逆转录酶RT和蛋白酶）的影响，但每种酶都需要独立的检测体系。如本文所述，单周期载体检测法无需修改即可用于筛选RT抑制剂。类似的方法也可用于筛选蛋白酶抑制剂；然而，在蛋白酶抑制剂检测中，化合物必须添加到用于产生载体的细胞中。通过使用不同的细胞和载体，相关检测方法还可用于筛选包膜蛋白（env）及HIV进入融合抑制剂。最后，该检测方法还可结合自动化 robotic 分液系统进行大规模应用。因此，该方法可用于对大量化合物库针对野生型和突变型HIV进行筛选。然而，该检测法能够检测出作用于病毒生命周期不同阶段的HIV复制抑制剂，这也揭示了其在数据解读上的局限性：该检测本身无法确定化合物阻断的是生命周期中的哪一个具体步骤。若需解答此问题，可通过时间添加检测法38以及将化合物作用于纯化的重组病毒蛋白来进行进一步验证。
遗憾的是，尽管抗 HIV 药物已取得成功，但仍存在耐药性和毒性问题。在尚无有效抗 HIV 疫苗的情况下，不仅需要开发出对现有耐药突变株有效的新型治疗药物，还需要开发能够减少病毒传播的预防性药物。如果抗 HIV 药物的预防性使用涉及对未感染人群的治疗，这种方法将对药物的长期毒性提出更高要求，即必须尽量减少甚至消除长期毒性。

针对HIV-1病毒生命周期中多个关键步骤的药物相继问世，推动了联合药物治疗（称为高效抗逆转录病毒治疗，HAART）的发展，显著改善了HIV-1感染的治疗效果，并延长了患者的长期生存期。&#160;HAART通常联合使用两种核苷类逆转录酶（RT）抑制剂，以及一种蛋白酶抑制剂或非核苷类逆转录酶抑制剂，目前已将一种致命性疾病转变为可长期控制的慢性病1-5。然而，尽管HAART在持续抑制病毒复制方面取得了诸多成功，但仍存在局限性。HAART无法根除HIV，因此患者无法被治愈，治疗需终身维持。此外，还存在药物毒性问题以及耐药毒株的出现。所有已批准的抗HIV药物均可能出现耐药性，包括新近获批的靶向HIV整合酶（IN）的药物。耐药性的产生可能源于病毒复制过程中发生的自发突变（突变率为每复制周期每碱基3 × 10-5）6。当抗逆转录病毒药物靶点基因发生突变时，其中一小部分突变会导致病毒株对药物的敏感性降低。为防止耐药性的产生，必须将药物浓度维持在足以完全抑制HIV复制的水平。患者对治疗方案依从性差会加剧这一问题，并可能导致耐药性迅速出现7-9。尽管由于个体在吸收、代谢、分布和排泄方面的差异，药物浓度在不同患者中可能有所不同，但过高的药物浓度又可能引发毒性10。由于治疗需持续患者一生，抗逆转录病毒药物的长期毒性带来了严重的安全性担忧。HAART中常用的抗逆转录病毒药物可能产生不良反应，已有报道显示某些副作用甚至危及生命11-15。患者在治疗过程中面临的耐药性和毒性问题，凸显了开发新型药物的迫切需求：这些新药应能有效抑制常见耐药病毒株的复制，同时具备极低或无长期毒性的特点。
因此，迫切需要一种能够快速筛选出阻断病毒生命周期关键步骤化合物的检测方法。本文介绍了一种高效的检测方法，可快速、高效地评估化合物的细胞毒性和其对野生型（WT）及耐药型HIV毒株复制的抑制能力。我们所采用的检测方法与先前为筛选从患者体内分离出的病毒耐药性而开发的方法类似16-18。
尽管该检测方法无需修改即可用于筛选能够阻断HIV逆转录的化合物，但本文将描述如何利用该检测方法评估整合酶（IN）抑制剂。IN是一种关键的病毒酶，负责将病毒DNA插入宿主细胞基因组19。尽管目前已有多种具有前景的IN抑制剂正在研发中，其中部分已进入临床试验阶段，但美国食品药品监督管理局（FDA）迄今仅批准了Isentress20,21（也称为Raltegravir或RAL），以及近期批准的Elvitegravir（EVG）22和Dolutegravir（DTG）23。&#160;这些化合物在细胞培养和患者中均对HIV B亚型及非B亚型具有活性24,25。然而，使用RAL治疗会筛选出耐药性HIV-1 IN突变株，包括Y143R、N155H和G140S/Q148H24,26-31。N155H以及G140S/Q148H突变也会降低EVG的疗效，这凸显了设计和开发能够有效对抗这些耐药突变的第二代IN链转移抑制剂（INSTIs）的必要性。

<table><tbody><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning Cellgro</td><td>10-017</td><td></td></tr><tr><td>ATPlite 发光法 ATP 检测试剂盒</td><td>Perkin Elmer</td><td>6016941</td><td></td></tr><tr><td>Steady Lite Plus 高灵敏度发光报告基因检测试剂盒</td><td>Perkin Elmer</td><td>6016751</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's PBS</td><td>Gibco-Life Technologies-Invitrogen</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax Gemini EM</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KaleidaGraph</td><td>Synergy Software</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nunc F96 微孔白色聚苯乙烯板</td><td>Thomas Scientific</td><td>12-566-26</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Thermomixer Compact</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1442-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Turbo DNase</td><td>Ambion-Life Technologies-Invitrogen</td><td>AM2238</td><td></td></tr><tr><td>Millex HA 滤器单元，0.45 &amp;micro;M</td><td>Millipore</td><td>SLAHA033SS</td><td></td></tr><tr><td>Alliance HIV-1 p24 ELISA 检测试剂盒</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEK050B001KT</td><td></td></tr><tr><td>HOS 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-1543</td><td></td></tr><tr><td>TZM-bl 细胞</td><td>NIH 艾滋病试剂计划</td><td>8129</td><td></td></tr><tr><td>pNL4.3&amp;Delta;Env.LUC</td><td>NIH-NCI 艾滋病药物耐药性研究计划 - Hughes 实验室</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VSV-G</td><td>NIH-NCI 艾滋病药物耐药性研究计划 - Hughes 实验室</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SoftMax Pro</td><td>Molecular Devices</td><td>0200-310</td><td></td></tr></tbody></table>

快速筛选hiv逆转录酶和整合酶抑制剂

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

尽管已有多种抗HIV药物获批上市，但药物毒性和耐药性问题仍然存在。这表明有必要寻找新的化合物，以抑制常见耐药HIV-1毒株的感染，同时最大限度地降低毒性。本文介绍一种高效的检测方法，可用于快速评估化合物对野生型和突变型病毒株的细胞毒性和抑制效果。
将所需的目标细胞系接种于96孔板中，经24小时培养后，加入待测化合物的系列稀释液。细胞毒性检测无需进一步操作；进行抗HIV检测时，则向细胞中加入预定量的表达荧光素酶的野生型或耐药型HIV-1载体。通过ATP依赖性发光法检测细胞毒性，通过测定在疑似抑制剂存在或缺失条件下荧光素酶的含量，评估化合物对感染性的影响。
该筛选实验需要4天完成，可同时平行筛选多种化合物。化合物以三复孔形式进行筛选，数据经归一化处理，以不含目标化合物时的感染性/ATP水平为对照。该技术可快速、准确地评估潜在抗HIV化合物的药效及毒性。

如果检测实验（图1，步骤1和2）成功执行，则荧光素酶检测值应与表2中所示数据相似。观察浓度梯度范围，潜在的强效化合物应显示出从左到右荧光素酶活性逐渐增加的趋势，而对照组应具有最高的荧光素酶活性。如果在整个浓度范围内荧光素酶活性未超过0.1相对荧光素酶单位（RLUs），通常表明该化合物已杀死细胞。如果在所有连续稀释浓度下荧光素酶检测值均大于或等于2.0 RLUs，则表明这些化合物在所测试浓度下未能抑制HIV-1感染。
在 Kaleidagraph 中，以化合物浓度对荧光素酶活性抑制率作图（表3，A部分），经线性回归分析后，所得结果将与表3 B部分所示结果相似。
<img alt="荧光素酶检测流程：293T细胞转染、病毒收获、HOS细胞感染、活性测定" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51400/51400fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. HIV-1病毒储备液的制备及细胞毒性与单周期感染性检测的建立。 第一步，将293T细胞转染pNL4.3ΔEnv.LUC和VSV-G质粒，培养48小时以产生病毒34。收集病毒后分装保存（-80 °C冷冻），待感染性检测时使用。第二步，将HOS细胞接种于96孔板中，培养24小时。随后用待测化合物进行系列稀释，并预孵育3小时，然后用病毒（野生型或耐药型）感染细胞。经过48小时培养后，检测荧光素酶活性。
<img alt="化学稀释表，浓度单位为微摩尔，实验制备，实验室数据。" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51400/51400table1.jpg" width="300" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Table 1"> 
表 1. 药物筛选系列稀释原型。 更严格的筛选包括11个连续稀释梯度，通常起始于10 µM，终止于0.0005 µM。系列稀释液按10倍浓缩液制备；每孔含有100 µl 细胞和100 µl 病毒。在此体积及以下计算基础上，系列稀释液足以用于整块96孔板的3行。细胞毒性检测的制备方法类似；然而其11个连续稀释梯度起始于250 μM，终止于0.05 μM。仅需向含有100 μl 细胞的孔中加入11 μl 稀释液。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table1.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示浓度依赖性信号和抑制率分析的荧光素酶检测数据表。" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51400/51400table2.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="表 2"> 
表 2. 荧光素酶信号读数及荧光素酶活性抑制率的确定。 该数据表展示了一个成功化合物的典型荧光素酶数据。该表还显示了计算荧光素酶活性抑制百分比以及CC50和IC50值所需的附加计算过程。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table2.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="抑制曲线分析；图表显示抑制百分比与浓度的关系；拟合数据模型方程已显示。" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51400/51400table3.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="表 3"> 
表 3. 线性回归分析数据表。第 A 部分：在Kaleidagraph中绘制所用浓度范围与荧光素酶活性抑制百分比的关系图，可获得相应的抑制曲线。第 B 部分：抑制曲线由三参数S型函数定义，并通过线性回归分析对数据进行拟合18。随后将该数据表与Microsoft Excel结合使用，以计算抑制病毒整合和细胞毒性的药物浓度，即抑制50%效应所需的浓度，例如 IC50 和 CC50。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51400/51400table3.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

本文介绍了细胞毒性及单周期感染性检测方法，可用于快速、准确地筛选化合物，以确定其对野生型和耐药型 HIV-1 的细胞毒性（CC50）以及抑制浓度（IC50）值。

快速筛选HIV逆转录酶和整合酶抑制剂

尽管已有多种抗HIV药物获批，但毒性及药物耐药性问题仍然存在。这表明仍需寻找……

以下实验的总体目标是筛选感兴趣的化合物，以确定其细胞毒性以及在单周期感染实验中抑制野生型或耐药型HIV-1的能力。该目标首先通过将细胞暴露于化合物中以使其摄取，然后将处理后的细胞与表达荧光素酶的野生型或耐药型HIV-1共同孵育来实现。随后可检测病毒的荧光素酶活性。最终，荧光素酶检测信号可用于定量评估化合物对HIV-1病毒载体复制的抑制作用。该技术具有治疗意义，可用于筛选对耐药型HIV具有更强疗效的新化合物，这类化合物未来有望用于HIV-1感染患者的抗逆转录病毒治疗。转染前一天，将293细胞以每100毫米培养皿1,500,000个细胞的密度接种。第二天，使用磷酸钙法将16微克野生型或突变型HIV质粒和4微克VSV质粒共转染细胞。转染6小时后，用PBS洗涤2次93细胞，随后在新鲜培养基中孵育48小时。两天后，从直径100毫米的培养皿中收集含有病毒的上清液，并在室温下以1,620 ×g低速离心10分钟，澄清上清液。接下来，将上清液通过孔径为45 µm的注射器滤器过滤，并用Turbo DNase处理病毒悬液。室温孵育30分钟后，用新鲜培养基稀释病毒，并于-80 °C保存。为在感染性检测中进行化合物筛选，于实验前一天将4,000个目标细胞接种至96孔板的每个孔中。将细胞接种于含100微升培养基的孔板中，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育。24小时后，将化合物原液用新鲜培养基进行系列稀释。最终选择的浓度应依据表中所述经验确定的浓度范围而定。接下来，将化合物的系列稀释液以每孔三个复孔的方式加入到孔板中。以最终浓度的十分之一体积，将适当稀释的化合物与细胞共同孵育，时间至少为三小时。孵育结束后，使用多通道移液器向每个孔中加入100 µL稀释后的病毒液。接受阴性对照孔。然后将培养板再孵育48小时。孵育结束后，使用带有200微升吸头的玻璃移液器，从孔中培养基的上层开始，缓慢向下移向孔的底部角落，吸出培养基。立即向每个孔中加入100微升含0.5毫摩尔氯化镁的磷酸盐缓冲液，然后为检测荧光素酶活性，向每管提供的冻干试剂中加入10微升发光报告基因检测底物缓冲液。接着，向每个孔中加入100微升重悬后的试剂，并在室温下孵育平板20分钟，以使信号充分显色。最后，使用微孔板发光仪读取96孔板。成功进行化合物筛选实验后所得的荧光素酶数值列于下表中。请注意，在该代表性的Kaleido移植模型中，潜在高效化合物表现出荧光素酶活性的增加，而对照组显示出最高的信号值。已绘制化合物浓度与荧光素酶活性抑制率之间的关系曲线，以确定该化合物是否有效抑制野生型或耐药型HIV的复制。进行此操作时，必须准确地将等量的细胞和病毒均匀分配至所有孔板的孔中，并确保每个孔中加入正确浓度的化合物。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

HIV逆转录酶和整合酶抑制剂的快速筛选

来源： Scarborough, R. J., et al. 针对HIV-1产生的RNA在基因或药物治疗中应用的疗效与毒性评估。 J. Vis. Exp.

逆转录酶活性作为类病毒颗粒产生的标志物

体外检测病毒复制的实验方法已因表达荧光素酶或其他可产生生物发光的酶的重组RNA病毒的发展而得到显著改进。本文详细介绍了一种高通量筛选流程，该流程结合了麻疹病毒和基孔肯雅病毒的此类重组毒株，用于从化合物库中筛选广谱抗病毒药物。...

广谱RNA病毒化学抑制剂的高通量筛选

对于接受抗逆转录病毒治疗（ART）失败的HIV-1感染者，药物耐药性检测可指导后续治疗方案的选择，并改善治疗效果。在HIV感染率高但资源有限的地区，要优化个体和人群的健康结局，最终需要实现经济可负担且易于获取的药物耐药基因型检测及结果解读方法。...

一种适用于资源有限环境的经济型HIV-1耐药性监测方法

本报告描述了一种 体外 用于测定急性感染细胞胞质提取物中人免疫缺陷病毒1型（HIV-1）前整合复合物（PIC）相关整合活性的检测方法。通过巢式实时定量聚合酶链式反应策略，定量分析PIC相关HIV-1 DNA整合至异源靶DNA的过程。...

测量 体外 HIV-1前整合复合物的整合活性

本文描述了一种双向整合位点检测方法的实验流程及软件分析步骤，该方法可同时分析上游和下游的载体-宿主连接DNA。所获得的双向PCR产物可用于任何下游测序平台。所得数据可用于对整合的DNA靶标进行高通量、定量的比较分析。...

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重组逆转录病毒整合酶与模拟病毒DNA末端的DNA寡核苷酸可形成一种具有酶活性的复合物，称为整合体（intasome）。整合体可用于生化、结构和动力学研究。本方案详细介绍了如何组装和纯化原型泡沫病毒整合体。...

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我们描述了一种基于细胞的检测方法，通过表达绿色荧光蛋白并利用流式细胞术或荧光显微镜进行检测，以报告HIV-1的融合过程。via该方法可用于在无细胞感染系统和细胞间感染系统中测试病毒进入抑制剂（特异性作用于融合步骤）。...

一种高通量Cre-Lox激活的病毒膜融合检测方法用于筛选HIV-1病毒膜融合抑制剂

本文介绍一种深度测序方法，可无偏倚地确定新生3'末端以及单链DNA分子的突变谱型。该方法的主要应用是表征新生逆转录病毒互补DNA（cDNA），即逆转录病毒逆转录过程中产生的中间产物。...

确定感染细胞中HIV-1逆转录过程中新生单链病毒DNA的3'-末端及其序列

本文描述并应用了一种高通量方案，用于功能性评估高效激活HIV并清除潜伏前病毒的效果，通过检测干预措施对HIV转录和剪接的影响来实现。文中提供了潜伏期逆转剂对LTR驱动的转录和剪接作用的代表性结果。...

高通量体外评估潜伏逆转剂对HIV转录与剪接的影响

在本研究中，我们描述了基于复制子和病毒酶的检测方法所采用的实验方案，用于以高通量筛选形式筛选寨卡病毒复制的抑制剂。...

高通量抗病毒检测用于筛选寨卡病毒复制抑制剂

本研究采用in-silico策略，鉴定出利匹韦林为一种具有前景的HIV治疗药物。我们关于分子相互作用与动力学的研究结果，支持合理设计新型非核苷类逆转录酶抑制剂（NNRTIs），作为可能的HIV治疗替代方案。...

非核苷类逆转录酶抑制剂的定量构效关系、活性预测及分子动力学

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