Name: 捕获复合质谱 - 一个强大的工具来确定新型C-二GMP效应蛋白 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 11 s
Description: 了解捕获复合质谱技术如何用于鉴定细菌中环二鸟苷酸结合蛋白。该方法通过紫外光交联和链霉亲和素磁珠洗涤提高特异性，为研究细菌信号传导提供强大工具。

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感谢 Alberto Reinders 在优化铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）的 CCMS 条件方面所做的工作。同时感谢 Pablo Manfredi 对铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）蛋白质的注释。本研究由瑞士国家科学基金会（SNF）Sinergia 项目（资助号：CRSII3_127433）提供支持。

1. 裂解液制备
<ol>
	<li>培养 P. aeruginosa 在LB培养基中将细胞培养至所需的OD值。 
	注意：请参考使用 &#8776; 100 ml&#160;用于静止期培养物的培养/样品 &#8776; 500 ml 对数期培养物/样品（OD600 nm = 0.5).</li>
	<li>5,000 × g 离心 20 分钟以形成沉淀 g.</li>
	<li>将0.5–1 g沉淀重悬于1 ml裂解缓冲液（6.7 mM MES，6.7 mM HEPES，200 mM NaCl，6.7 mM KAc，1 mM DDT，pH 7.5）中，并加入蛋白酶抑制剂（complete mini，无EDTA）以及DNase I。</li>
	<li>使用高压细胞破碎仪（French pressure cell），在20,000 psi条件下反复通过3次以裂解细胞（参见材料列表）。</li>
	<li>超速离心细胞裂解液，100,000 x g g 4℃孵育1小时 &#176;C.</li>
	<li>保存上清液（进入步骤2）。</li>
	<li>用移液器吸取1 ml 1×裂解缓冲液上下吹打重悬沉淀。</li>
	<li>以 100,000 x g 超速离心 g 4℃孵育1小时 &#176;C.</li>
	<li>将沉淀物在液氮中速冻，并于-20℃保存 &#176;C，直至用于膜蛋白捕获（见步骤3）。</li>
</ol>
2. 去除游离的 c-di-GMP 及其他核苷酸（仅可溶性组分）
<ol>
	<li>用10 ml冷裂解缓冲液洗涤PD10脱盐柱（见材料列表）。</li>
	<li>倒入上清液（&#8776; 1 ml）上样至PD10柱，以去除核苷酸。</li>
	<li>用4 ml冷裂解缓冲液（500 &#181;l 步骤）。</li>
	<li>根据Bradford法测定结果，选择浓度最高的组分并合并。</li>
</ol>
3. 沉淀重悬与溶解（仅膜组分）
<ol>
	<li>将沉淀重悬于 500 至 1,000 µl 的 1x 捕获缓冲液（不含去污剂）中（见表 1）。 
	注意：沉淀难以重悬。建议先用移液器反复吹打以初步重悬沉淀，然后使用 27 G 注射器充分均质化溶液。</li>
	<li>加入 1% (w/v) 的正十二烷基-β-D-麦芽糖吡喃苷 (DDM)。</li>
	<li>在 4 °C 下于旋转仪上孵育至少 2 小时（或过夜）。</li>
	<li>在 4 °C 下以 100,000 x g 超速离心 1 小时。</li>
	<li>收集上清液。</li>
</ol>
4. 蛋白质浓度测定
<ol>
	<li>使用Bradford法测定蛋白质浓度（膜组分使用BCA法）。</li>
	<li>将总蛋白浓度调至10 mg/ml。</li>
</ol>
5. 捕获
<ol>
	<li>将300 µg蛋白与1 mM的GDP、GTP、ATP、CTP以及20 µl的5x捕获缓冲液（100 mM HEPES、250 mM KAc、50 mM MgAc、5%甘油，pH 7.5）混合（表1）。用H2O将反应体系调整至100 µl。 
	注意：在竞争对照实验中（见步骤5.3和表2），总体积需包含cdG-CC和c-di-GMP的体积。 
	注意：所有实验均在200 µl的12孔PCR条板（Thermo Scientific）中进行。 
	注意：对于膜组分，务必确保在进行8 M尿素溶解蛋白步骤（步骤7.1）之前，DDM浓度始终高于临界胶束浓度（0.01% w/v）。</li>
	<li>在4 °C下于旋转仪上孵育30分钟。</li>
	<li>加入10 µM cdG-CC（终浓度）。 
	注意：需设置不含cdG-CC的对照组（称为“珠粒对照”），以及添加1 mM c-di-GMP的对照组（“竞争对照”）（见表2）。 
	注意：cdG-CC浓度可在1至10 µM范围内调整。</li>
	<li>在4 °C下避光孵育至少2小时（膜组分建议过夜），置于旋转仪上。</li>
	<li>短暂离心后，使用CaproBox（见材料列表，λ = 310 nm，辐照强度≥10 mW/cm²，光源距离为2 cm）进行紫外照射4分钟，以激活cdG-CC的反应基团，实现交联。注意：交联前需移除条板盖。</li>
	<li>加入25 µl 5x洗涤缓冲液（5 M NaCl、250 mM Tris，pH 7.5）和50 µl充分重悬的链霉亲和素磁珠，轻轻混匀。</li>
	<li>在4 °C下于旋转仪上孵育1小时。</li>
</ol>
6. 洗涤步骤
注意：（磁铁：见材料列表）。首先，使用磁铁将磁珠吸附在PCR条带管盖上。然后将PCR条带更换为含有下一个洗涤液的新条带。移除磁铁，重悬磁珠，并孵育2分钟。短暂离心后，将管盖更换为新的管盖。
<ol>
	<li>洗涤步骤（仅可溶性组分）
	<ol>
		<li>用 200 µl 1× 洗涤缓冲液洗涤 6 次。</li>
		<li>用 200 µl HPLC 级 H2O 洗涤 1 次。</li>
		<li>用 200 µl 80% 乙腈洗涤 6 次。</li>
		<li>用 200 µl HPLC 级 H2O 洗涤 2 次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>洗涤步骤（仅膜组分）
	<ol>
		<li>用 200 µl 1× 洗涤缓冲液 + 0.1% DDM 洗涤 5 次。</li>
		<li>用 200 µl 1× 洗涤缓冲液 + 0.05% DDM 洗涤 2 次。</li>
		<li>用 200 µl 1× 洗涤缓冲液 + 0.025% DDM 洗涤 1 次。</li>
		<li>用 200 µl 1× 洗涤缓冲液 + 0.0125% DDM 洗涤 1 次。</li>
		<li>用 200 µl 100 mM ABC（碳酸氢铵，NH4CO3）+ 2 M 尿素洗涤 3 次。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 质谱样品制备
<ol>
	<li>在瓶盖中直接将珠子重悬于 20 µl 100 mM ABC（膜组分使用 100 mM ABC + 8 M 尿素）中，并转移至 1.5 ml 离心管中。</li>
	<li>仅膜组分：在 60 °C 孵育 5 分钟，以 500 rpm 振荡。</li>
	<li>加入 0.5 µl 200 mM TCEP（三(2-羧乙基)膦），在 60 °C 孵育 1 小时，以 500 rpm 振荡，随后冷却至 25 °C。</li>
	<li>加入 0.5 µl 新鲜配制的 400 mM 碘乙酰胺，在 25 °C 避光孵育 30 分钟，以 500 rpm 振荡。</li>
	<li>加入 0.5 µl 0.5 M N-乙酰半胱氨酸，在 25 °C 孵育 10 分钟，以 500 rpm 振荡。</li>
	<li>仅膜组分：加入 1 µl Lys-C，在 37 °C 过夜孵育。</li>
	<li>加入 2 µg 胰蛋白酶，在 37 °C 过夜孵育，以 500 rpm 振荡（用 Parafilm 封口以防止干燥）。 
	注意：此步骤后样品可在 -20 °C 保存。 
	注意：仅膜组分：在加入胰蛋白酶前，加入 100 mM ABC 以调节尿素浓度至 &#60;2 M。</li>
	<li>短暂离心，使用磁铁收集珠子。</li>
	<li>将上清液转移至新的 1.5 ml&#160;离心管中（若仍有珠子残留，请重复此步骤）。</li>
	<li>加入 5 µl 5% TFA（三氟乙酸）+ 1 µl 2 M HCl（膜组分使用 15 µl 5% TFA + 5 µl 2 M HCl）。</li>
	<li>用 150 µl 乙腈预处理 C18 MicroSpin 柱（The Nest Group, MA, USA）（2,400 rpm 离心 20 秒）。</li>
	<li>用 150 µl 0.1% TFA 平衡 C18 柱两次（每次 2,400 rpm 离心 20 秒）。</li>
	<li>上样并以 2,000 rpm 离心 2 分钟。</li>
	<li>将穿流液重新加载到柱上，并重复离心步骤（2 分钟，2,000 rpm）。</li>
	<li>用 150 µl 0.1% TFA、5% 乙腈洗涤三次（每次 2,400 rpm 离心 20 秒）。</li>
	<li>取一新管，用 150 µl 0.1% TFA、50% 乙腈洗脱两次（每次 2,000 rpm 离心 2 分钟）。</li>
	<li>在真空浓缩仪中将肽段干燥。</li>
	<li>重悬于 40 µl 98% H2O、2% 乙腈、0.15% 甲酸中。</li>
	<li>超声处理 20 秒（脉冲周期 0.5，振幅 100%；参见材料列表），随后以 12,000 rpm 离心 5 秒（台式离心机）。涡旋振荡 10 秒，再以 12,000 rpm 离心 5 秒。转移至 HPLC 小瓶中用于 LC-MS/MS 分析。</li>
	<li>在 -20 °C 冻存。 
	注意：此步骤后样品可在 -20 °C 保存。</li>
</ol>
8. LC-MS/MS 分析
<ol>
	<li>使用配备反相高效液相色谱柱（75 μm × 37 cm，填充 Magic C18 AQ 3 μm C18 树脂）的纳米液相色谱系统（nano-LC systems），以 0.2 µl/min 的流速运行，采用线性梯度洗脱：溶剂 A（0.15% 甲酸，2% 乙腈）从 95% 逐渐变为 65%，同时溶剂 B（98% 乙腈，0.15% 甲酸）从 5% 逐渐升至 35%，历时 60 分钟。</li>
	<li>采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）分析肽段，仪器为双压 LTQ-Orbitrap Velos 质谱仪，连接电喷雾离子源。 
	注意：数据采集模式设置为：在质谱仪的傅里叶变换（FT）部分进行一次高分辨率 MS 扫描，分辨率为 60,000 FWHM，随后对强度最高的 20 个离子在线性离子阱中进行 MS/MS 扫描。为提高 MS/MS 采集效率，启用电荷态筛选模式，排除未指定及单电荷离子。当前体离子强度超过 100 计数时，触发碰撞诱导解离（CID）。动态排斥时间设置为 30 秒。离子累积时间设置为 300 毫秒（MS 模式）和 50 毫秒（MS/MS 模式）。</li>
</ol>
9. 数据库搜索
<ol>
	<li>通过 NCBI 主页（<a href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/</a>）下载 P. aeruginosa NCBI 数据库。</li>
	<li>使用 MassMatrix 转换工具（<a href="http://www.massmatrix.net/mm-cgi/downloads.py">http://www.massmatrix.net/mm-cgi/downloads.py</a>）将质谱原始谱图转换为 Mascot 通用文件（mgf）。</li>
	<li>使用 MASCOT 2.3 版本在包含正向序列和反向诱饵蛋白条目的 P. aeruginosa NCBI 数据库中搜索该 mgf 文件。</li>
	<li>对完全胰蛋白酶肽段进行赖氨酸和精氨酸位点的 in silico 胰蛋白酶消化（脯氨酸之后除外），允许最多两个漏切位点。</li>
	<li>设置数据库搜索参数：甲硫氨酸氧化（+15.99491 Da）作为可变修饰，半胱氨酸羧氨甲基化（+57.021464 Da）作为固定修饰；对于使用高分辨率扫描的 MASCOT 搜索，前体离子质量容差设为 15 p.p.m.，碎片离子质量容差设为 0.6 Da；最后将蛋白质错误发现率（FDR）设为 1%。</li>
	<li>将 P. aeruginosa CCMS 实验的 Mascot 搜索结果导入 Scaffold 软件（ProteomeSoftware，版本 3），设置参数以获得接近 1% 的蛋白质 FDR，并提取总谱图计数。</li>
	<li>本文展示的代表性结果中，我们采用配对 t 检验比较实验组与竞争对照组，仅考虑 p 值低于 0.1 且谱图计数比值大于 2（实验组谱图计数 / 竞争对照组谱图计数）的蛋白。</li>
	<li>数据可导出至任意电子表格软件进行进一步分析。</li>
</ol>
10. 无标记定量
<ol>
	<li>将原始文件导入 Progenesis LC-MS 软件（Nonlinear Dynamics，版本 4.0）。</li>
	<li>使用默认设置进行 LC-MS 对齐和特征峰检测。</li>
	<li>从 Progenesis LC-MS 中以 mgf 格式导出数据。</li>
	<li>使用 MASCOT 对包含正向与反向诱饵蛋白条目的 NCBI P. aeruginosa 数据库进行 MS/MS 谱图搜索。</li>
	<li>将数据库搜索结果导入 Progenesis LC-MS，并将肽段鉴定结果映射到 MS1 特征峰。</li>
	<li>对于数据分析（显著性水平计算、倍数变化比值），采用 SafeQuant 的 ProteinSQAnalysis 脚本（阈值：q 值低于 0.1，谱图计数比值高于 2）。</li>
</ol>

<ol><li>Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+capture+compound+for+the+identification+and+analysis+of+cyclic+di-GMP+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins.</a> J Proteomics. 75, 4874-4878 (2012).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在实验方案的多个步骤中需格外注意。蛋白浓度是一个关键参数，当细胞在特定培养条件下生长时，很难达到10 mg/ml的浓度。例如 生物膜或小菌落变体）。因此，沉淀重悬应使用少量裂解缓冲液进行。蛋白质浓度可降低至8 mg/ml。与Nesper发表的方法相比 等.1，我们在捕获反应中添加了多种核苷酸，以尽量减少对核苷酸结合蛋白的非特异性捕获。尽管添加核苷酸提高了特异性，但同时也可能阻止在相同位点结合不同核苷酸的蛋白质被捕获。例如效应蛋白FleQ，最近研究表明其可结合ATP和c-di-GMP18 在我们之前的实验中，是在无ATP条件下特异性钓取的1，但在本实验所呈现的数据中，由于存在过量ATP，该现象不再出现。
cdG-CC 应避光保存。尽管环境光中仅含有少量紫外线，仍建议将捕获化合物的储备液用铝箔包裹，并在紫外线照射活化前将捕获混合物也进行同样处理。由于被捕获的蛋白质已与 cdG-CC 共价结合，后续的洗涤步骤可较为严格，以提高特异性。在进行 LC-MS/MS 分析时，实验应在无角蛋白污染...

c-di-GMP 是大多数细菌用来调控其生长和行为多个方面的关键第二信使。例如，c-di-GMP 调控细胞周期进程、运动性以及胞外多糖和表面黏附素的表达2-4。通过协调这些过程，c-di-GMP 促进生物膜的形成，而这一过程与多种致病菌的慢性感染相关5。c-di-GMP 由称为二鸟苷酸环化酶（DGCs）的酶合成，这些酶含有催化性的 GGDEF 结构域4。一些 DGCs 具有一个抑制性位点，当结合 c-di-GMP 后可下调环化酶活性。c-di-GMP 的降解由两类不同的磷酸二酯酶（PDEs）催化，这些酶分别含有催化性的 EAL 或 HD-GYP 结构域6,7。
目前已知的直接结合 c-di-GMP 的效应蛋白绝大多数属于三类蛋白之一：无催化活性的 GGDEF 或 EAL 结构域以及 PilZ 结构域，这些是小分子开关，在结合 c-di-GMP 后会发生构象变化8。DGCs、PDEs 和 PilZ 蛋白已被充分表征，其结构域可通过生物信息学方法相对可靠地预测。in silico 目前的研究重点集中在发现新的 c-di-GMP 效应蛋白类别。最近已报道了一些具有不同结合基序的 c-di-GMP 效应蛋白，例如在 Burkholderia cenocepacia 中的 CRP/FNR 蛋白家族成员 Bcam1349，以及 P. aeruginosa 中的转录调控因子 FleQ9,10。此外，最近还鉴定出特异性结合 c-di-GMP 的核糖开关，并证实其以 c-di-GMP 依赖的方式调控基因表达11。不同效应蛋白的 c-di-GMP 结合基序保守性较低，使得通过生物信息学方法预测这类蛋白十分困难。为解决这一问题，我们开发了一种生化方法，该方法基于使用特异性结合 c-di-GMP 的捕获化合物（Capture Compound），并结合质谱分析技术1,12,13。
我们最近设计了一种新型的三价c-di-GMP捕获化合物（cdG-CC，图1）1。该化学骨架包含以下部分：1）以c-di-GMP为诱饵，用于捕获c-di-GMP结合蛋白；2）一个紫外光活化的反应基团，用于将cdG-CC与结合的蛋白交联；3）一个生物素基团，用于通过链霉亲和素包被的磁珠分离捕获的蛋白。cdG-CC可用于直接且特异性地从复杂的生物大分子混合物（如细胞裂解液）中捕获c-di-GMP效应蛋白。基于捕获化合物和化学蛋白质组学的方法此前已被报道适用于多种生物体，例如 Caulobacter crescentus、Salmonella enterica 血清型 typhimurium 和 P. aeruginosa1,14。
在本方法学论文中，我们以铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）的提取物为例，深入描述了CCMS实验流程。本研究确立了CCMS作为一种强大且多功能的工具，可用于在生化层面鉴定参与小分子信号传导的新组分。

<table><tbody><tr><td>caproBox</td><td>caprotec bioanalytics</td><td>1-5010-001 (220 V)</td><td>配备冷却功能的96孔板冷却块耦合紫外灯，用于光激活</td></tr><tr><td>caproMag</td><td>caprotec bioanalytics</td><td>包含在CCMS启动试剂盒中</td><td>用于磁性颗粒的简便操作，无需移液</td></tr><tr><td>c-di-GMP caproKit</td><td>caprotec bioanalytics</td><td>按需提供</td><td>该试剂盒包含c-di-GMP捕获化合物、c-di-GMP（用于竞争性对照）、链霉亲和素包被的磁珠、捕获缓冲液和洗涤缓冲液</td></tr><tr><td>一次性PD-10脱盐柱</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>12联PCR管条</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-1114</td><td></td></tr><tr><td>UIS250v超声波破碎仪配VialTweeter</td><td>Hielscher超声波技术公司</td><td>UIS250v和VialTweeter</td><td></td></tr><tr><td>微型French高压细胞破碎仪</td><td>Thermo Electron Corporation</td><td>FA-003</td><td></td></tr></tbody></table>

捕获化合物质谱法——一种鉴定新型环二鸟苷酸效应蛋白的强大工具

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

在过去十年中，针对参与第二信使c-di-GMP合成（二鸟苷酸环化酶）和降解（磷酸二酯酶）的酶类，其鉴定与表征已取得显著进展。相比之下，关于该信号分子通过何种分子机制和细胞组分调控多种多样的细胞过程，目前仍缺乏相关信息。大多数已知的效应蛋白属于PilZ家族，或为失去催化功能而转为发挥效应功能的退化型二鸟苷酸环化酶或磷酸二酯酶。因此，为了更全面地定义多种细菌中的细胞内c-di-GMP调控网络，迫切需要实验方法来鉴定并验证那些无法通过可靠的in silico预测识别的新型效应蛋白。
我们近期开发了一种基于捕获化合物质谱法（Capture Compound Mass Spectrometry, CCMS）的新技术，作为生化鉴定和表征环二鸟苷单磷酸（c-di-GMP）结合蛋白的有力工具。该技术此前已被报道适用于多种生物体1。本文详细描述了我们用于研究此类信号组分的实验方案。以铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）为例，该菌是一种机会性病原体，其中c-di-GMP在毒力和生物膜调控中发挥关键作用。CCMS鉴定了已知或预测的c-di-GMP调控网络组分中的74%（38/51）。本研究详尽阐述了CCMS的操作流程，并确立其作为一种强大且多功能的工具，可用于鉴定参与小分子信号传导的新组分。

为了在P. aeruginosa中鉴定新的环二鸟苷单磷酸（c-di-GMP）效应因子，我们系统地采用共价交联质谱法（CCMS）分析了对数生长期培养的P. aeruginosa菌株PAO1（OD600 = 0.5）的可溶性组分和膜组分。本文总结并讨论了此次“分子捕获”实验的代表性结果。实验共使用了四个独立的生物学重复。每次实验采用两种不同浓度的cdG-CC（5 µM和10 µM）。为验证结合特异性，实验分别在有或无1 mM c-di-GMP作为竞争物的条件下进行，最后还设置了磁珠对照（即不含cdG-CC）（表1）。
按照上述详细描述的方法（图2），我们获得了以 Scaffold 格式列出的捕获蛋白清单，并去除了可能的污染物，包括核糖体蛋白、链霉亲和素、胰蛋白酶、血清白蛋白、角蛋白及其他人源蛋白。通过 Scaffold 软件将蛋白鉴定的错误发现率（FDR）设定为1%，并将数据导出至 Excel。Scaffold 提供的登录号可通过 Excel ...

普遍存在的第二信使 c-di-GMP 调控多种细菌的生长和行为。我们开发了一种基于捕获化合物质谱技术的新方法，可用于在几乎所有细菌物种中生化鉴定和表征 c-di-GMP 结合蛋白。

在过去十年中，针对参与合成过程的酶的鉴定与表征已取得显著进展……

捕获化合物质谱实验的总体目标是捕获并鉴定环二鸟苷酸（cyclic di-GMP）结合蛋白。该目标通过以下步骤实现：首先使用法国压滤器对细胞培养物进行破碎，并去除游离的环二鸟苷酸（cyclic di-GMP）；然后使用PD 10柱作为第二步纯化手段，加入捕获化合物并通过紫外光激活，使其与环二鸟苷酸结合蛋白共价交联。该交联反应可在无或有过量游离环二鸟苷酸存在的条件下进行。接下来，将捕获化合物与链霉亲和素包被的磁珠结合，以对捕获的蛋白质进行充分洗涤。最后，将捕获的蛋白质消化并制备用于质谱分析，以鉴定生成的肽段，结果随后通过计算机进行分析。与共沉淀等现有方法相比，CCMS 的主要优势在于，捕获化合物可提高对直接相互作用蛋白的特异性捕获效率，并且由于共价键的连接，能够耐受较为剧烈的洗涤条件。该方法可为细菌中的环二鸟苷酸（cyclic di-GMP）信号传导研究提供重要信息，也可推广应用于其他系统，例如核苷酸信号通路，以及几乎所有能够与捕获化合物结合的分子。在开始本实验前，需培养并裂解产气克雷伯菌（p aerogen）细胞，随后在4°C条件下，以100,000 × g的离心力对细胞裂解液进行超速离心，持续1小时。保存上清液后，用一毫升一倍裂解缓冲液重悬沉淀，通过移液器反复吹打使其重悬，然后在与之前相同的条件下进行超速离心。用液氮迅速冷冻沉淀，随后将冷冻样品在零下20摄氏度保存，直至用于膜蛋白的捕获。在此洗涤步骤之后，用10毫升冷裂解缓冲液冲洗PD 10脱盐柱。将上清液加入PD 10层析柱中以去除核苷酸，然后以500微升为增量，用4毫升冷裂解缓冲液进行洗脱。使用Bradford法测定最浓缩的组分，随后将选定的组分收集至1.5毫升离心管中重悬。将先前保存的沉淀重悬于500至1000微升不含去污剂的1×捕获缓冲液中。向样品中加入终浓度为1%（重量/体积）的Endoil β-D-木聚糖酶溶液。随后，将样品置于4°C旋转仪上孵育至少2小时。完成后，在 4°C 条件下以 100,000 × g 超速离心样品一小时。超速离心后，将上清液转移至新的 1.5 毫升离心管中。此时，将 300 微克蛋白质与 1 毫摩尔的 G-D-P-G-T-P-A-T-P-C-T-P 以及 20 微升 5 × 捕获缓冲液混合。用水将反应体系调整至 100 微升。将样品置于旋转摇床上，在 4 摄氏度下孵育，然后加入 10 微摩尔的环状二核苷酸 GMP 捕获化合物。随后，将样品在 4 摄氏度、避光条件下于旋转摇床上孵育，可溶性组分至少孵育 2 小时，膜组分则过夜孵育。短暂离心并打开管盖后，使用帽排式紫外灯照射4分钟，激活环状二鸟苷酸捕获化合物的反应基团，进行交联。随后加入25 µL 5×洗涤缓冲液和50 µL 充分重悬的链霉亲和素磁珠。轻柔地混匀样品。然后将样品置于旋转仪上，在 4 摄氏度下孵育一小时。用磁铁在管盖中捕获磁珠后，先用 200 微升 HPLC 级水洗涤一次，再用 200 微升 1× 洗涤缓冲液洗涤可溶性组分六次，随后用 200 微升 80% 乙腈洗涤六次，最后用 200 微升 HPLC 级水洗涤两次；对于膜组分，则用 200 微升 1× 洗涤缓冲液洗涤五次，并使用含有逐渐降低浓度的十二烷基-β-D-麦芽糖苷的缓冲液进行洗涤。接下来，将磁珠重悬于 20 微升 100 毫摩尔每升碳酸氢铵溶液中（用于可溶性组分）或重悬于 100 毫摩尔每升碳酸氢铵加 8 摩尔每升尿素溶液中（用于膜组分）。对于膜组分，将每种悬液转移至1.5毫升离心管中。在膜组分孵育后，向两种组分中各加入0.5微升200毫摩尔的Tris。加入二羧乙基磷烷，于60摄氏度孵育1小时，同时以500转/分钟振荡。待样品冷却至25摄氏度后，在避光孵育后加入0.5微升新配制的400毫摩尔碘乙酰胺。向每份组分中加入0.5微升0.5摩尔乙酰半胱氨酸。然后将样品在25摄氏度孵育10分钟，同时以500转/分钟振荡。此时，在37摄氏度孵育过夜后，向膜组分中加入1微升LY C。向每个样品中加入2微克胰蛋白酶，并用封口膜包裹以防止干燥。孵育并离心样品后，在磁铁的帮助下将上清液转移至新的1.5毫升离心管中，以避免收集到磁珠。接下来，向可溶性组分中加入5 µL的5%三氯乙酸和1 µL的2摩尔盐酸，向膜组分中加入15 µL的5%三氯乙酸和5 µL的2摩尔盐酸。使用150 µL乙腈对C18微型离心柱进行处理，以2,400 RPM转速离心20秒。待离心柱用150 µL的0.1%三氟乙酸平衡两次后，上样并离心2分钟。在 2000 RPM 条件下，将流穿液重新加载到柱子上。重复离心操作，并用 0.1% 三氟乙酸和乙腈洗涤柱子后，取一支新管，用 150 微升含 0.1% 三氟乙酸和 50% 乙腈的溶液洗脱两次。肽段经真空离心干燥后，将其重悬于 40 微升含 98% 水、2% 乙腈和 0.15% 甲酸的溶液中。样本超声处理20秒后，在12,000 RPM下离心5秒。涡旋振荡并离心后，将样本转移至HPLC小瓶，用于LC-MS/MS分析。来自P. aeruginosa对数生长期培养物的初始筛选列表包含768种可溶性组分蛋白和433种膜组分蛋白。去除非特异性结合的蛋白后，该列表减少至76种可溶性组分蛋白和133种膜组分蛋白。其中包括13种已知或预测可结合环二鸟苷酸（c-di-GMP）的P. aeruginosa可溶性蛋白和21种膜蛋白。其余63种可溶性蛋白和112种膜蛋白是新的假定环二鸟苷酸（cyclic di-GMP）结合蛋白，它们不包含任何已知的环二鸟苷酸结合结构域。采用不同生长条件下收获的细胞提取物以及含有不同细胞内环二核苷酸的样品进行CCMS分析。也使用了GMP浓度。总体而言，已知或预测的产气克雷伯菌（p aerogen）、PO单核苷酸环化二酯、GMP信号通路组分中有74%被成功捕获。考虑到其中至少有九个基因已被证明在特定条件下发生转录，且部分基因可能完全不结合环化二酯GMP，因此这一覆盖程度可能已接近饱和。这一结果，结合大多数组分均被高特异性捕获的观察现象，充分表明该技术具有高效性和强大能力。在实施该实验流程时，必须注意，通过比较已知心理性 DGP 效应分子的捕获特异性，才能筛选出有效的候选分子。因此，在完成本流程后，可采用诸如 Drac、ubi、交联、差示扫描、荧光微量测定或等温滴定微量热法等方法，以验证候选分子与环磷酸鸟苷 GMP 的特异性结合。

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捕获复合质谱 - 一个强大的工具来确定新型C-二GMP效应蛋白

质谱技术已被证明是分析大型蛋白质复合物的有力工具。该方法能够揭示多亚基复合物的组成、化学计量比和整体结构。本文将逐步介绍如何进行结构质谱分析，并表征大分子结构。...

通过结构质谱分析大型蛋白质复合物

捕获化合物（Capture Compounds）是一类具有三重功能的小分子，可通过功能性可逆的小分子-蛋白质相互作用降低蛋白质组的复杂性，随后进行光交联和纯化。在此，我们使用一种以S-腺苷-L-高半胱氨酸结合为选择性功能的捕获化合物，从大肠杆菌（Escherichia...

甲基转移酶及其他 S-腺苷-L-高半胱氨酸结合蛋白的捕获化合物质谱法（CCMS）分析

稳定同位素标准与抗肽抗体富集技术（SISCAPA）将肽段的亲和富集与稳定同位素稀释质谱法（MRM-MS）相结合，可对肽段进行定量检测，从而间接反映其对应蛋白质的含量。本文描述了使用磁性微粒并在部分自动化条件下进行该实验的操作流程。...

使用肽免疫亲和富集联合质谱法进行蛋白质定量

我们介绍了一种改进的QUICK（定量免疫沉淀结合敲低）方法，该方法此前已被提出，用于区分真实的和虚假的蛋白质-蛋白质相互作用。我们的方法基于15N代谢标记、通过ATP的有无来调节蛋白质-蛋白质相互作用的亲和力、免疫沉淀以及定量质谱分析。...

一种基于15N代谢标记、免疫沉淀、定量质谱及亲和力调控的蛋白质-蛋白质相互作用鉴定方案

本文描述了一种通过液相色谱/质谱法改进的聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性方法，用于河豚物种的基因分型。该方法采用反相硅胶整体柱分离经酶切后的扩增产物。此技术可解析寡核苷酸的单一同位素质量，有助于碱基组成的鉴定。...

通过液相色谱/质谱法改进河豚毒素鱼类的聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性基因分型

前体同位素标记与等重标记联合技术（cPILOT）是一种定量蛋白质组学策略，可增强等重标签的样本多重检测能力。本方案描述了cPILOT在阿尔茨海默病小鼠模型及野生型对照组织样本中的应用。...

利用前体同位素标记与等重标签联用技术（cPILOT）增强组织样本的多重检测能力

蛋白质复合物的结构对其功能至关重要。结合多种质谱技术已被证明是研究其组装过程的有力手段。本文提供了化学交联和天然质谱的技术方案，并展示了这两种互补技术如何帮助阐明多亚基蛋白质复合物的结构架构。...

结合完整蛋白质复合物的化学交联与质谱技术研究多亚基蛋白组装体的结构

我们介绍一种从复杂的生物样品中纯化、检测和鉴定来源于泛素化蛋白质的diGly肽的方法。该方法具有良好的重复性和稳健性，在泛素化修饰组分析的深度方面优于已发表的方法。...

通过肽段富集与质谱法检测蛋白质泛素化位点

本工作流程描述了同时对多种蛋白质翻译后修饰（PTM）进行高效、经济的时间和成本控制下的富集，以实现定量全局蛋白质组学分析。该方案采用多抗体偶联的肽段水平PTM富集方法，随后结合数据非依赖性采集质谱分析，以深入理解PTM之间的相互调控关系。...

同时富集两种翻译后修饰以实现定量与修饰位点定位

前体同位素标记与等重标记联用技术（cPILOT）是一种增强的样本多重分析策略，能够利用现有的等重标签显著增加可同时分析的样本数量。结合机器人平台的应用，极大地提高了实验通量、重复性以及定量准确性。...

利用前体同位素标记与等重标签联用技术（cPILOT）实现自动化样本多重分析

了解捕获复合质谱技术如何用于鉴定细菌中环二鸟苷酸结合蛋白。该方法通过紫外光交联和链霉亲和素磁珠洗涤提高特异性，为研究细菌信号传导提供强大工具。

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