薄层色谱法（TLC）分离与植物提取物的生物活性测定以鉴定抗菌化合物

本实验的总体目标是鉴定对厌氧细菌具有抗菌活性的植物代谢物。首先通过薄层色谱法（TLC）分离植物提取物，然后将色谱图切割成若干区带，每个区带包含一种或多种化合物。

随后将这些区域置于接种了厌氧菌的琼脂平板上并进行培养。培养结束后，移除这些区域并对平板进行染色，以鉴定能够抑制细菌生长的化合物。所得数据可揭示植物代谢物是否具有抑菌作用。

该方法有助于回答反刍动物营养学领域的一些关键问题，例如植物次生代谢产物对特定微生物利用营养物质的影响。尽管该方法可用于揭示对瘤胃细菌具有抑制作用的植物化合物，但也可应用于揭示对其他细菌或真菌具有抑制作用的化合物。

本实验方案中，将使用红三叶草中的酚类化合物，通过接触生物自显影法演示抗菌化合物的鉴定。首先在通风橱中清洗薄层色谱（TLC）板，准备足量的清洗溶剂，以浸没TLC展开槽底部以及TLC板的下边缘。

将乙酸乙酯与甲醇按2:1的比例在室温下置于层析缸中。随后，佩戴手套并在通风橱内操作，使用剪刀将带有铝箔或塑料背衬的柔性硅胶板裁剪至适合展开缸的大小。

将培养皿插入层析缸中，使其顶部斜靠在缸壁上。培养皿之间不应相互接触。盖上层析缸，使溶剂通过毛细作用沿培养皿上升。

当溶剂到达板的顶端时，将板从展开槽中取出，并在通风橱中直立放置，直至溶剂完全挥发。待板干燥后，检查是否有杂质迁移至薄层色谱板的顶部附近。这些杂质在可见光下呈现为黄色条带，或在紫外光下呈现为荧光条带。

如果板的大部分区域仍带有黄色，则在同一个薄层色谱缸中使用相同的溶剂重复清洗过程。从色谱缸中取出薄层色谱板后，弃去溶剂。在将色谱缸用于后续步骤之前，需等待残余溶剂完全挥发。

接下来，为去除可能影响化合物在硅胶上迁移的残留水分，将20厘米×20厘米的薄层板直立置于100摄氏度的干燥箱中加热10至15分钟，7厘米×10厘米的薄层板则加热5分钟。薄层板干燥后，需冷却至室温，然后再点加提取物。为准备展开槽用于分离提取物，使用剪刀裁剪一张滤纸，其长度略小于展开槽的高度，宽度约为展开槽周长的一半。

本实验中，滤纸将起到灯芯作用，使溶剂沿层析缸内壁上升，并通过溶剂浸润的滤纸使层析缸内环境饱和，从而提高分离结果的重复性。在通风橱中配制以下溶剂：乙酸乙酯与甲醇按体积比4:1混合。将配好的溶剂混合物倒入层析缸中，并盖上盖子。

用铅笔在薄层色谱板上轻轻标记原点，该位置应位于展开槽中展开剂液面之上。如果薄层色谱板的吸附层较软且容易损坏，则如图所示在板的边缘处做标记。接下来，将提取物溶解于足量的有机溶剂中，制成浓溶液，而非浑浊的悬浮液。

此处使用的溶剂为甲醇。使用毛细管微量移液器或微升注射器将标准品和样品加样成狭窄的条带，同时在板的两侧留出一厘米的边缘。让条带自然干燥，或将板置于通风橱中以加快干燥速度。待条带完全干燥后，再次在同一位置或重叠位置重复加样。

如果需要在薄层板上获得更高浓度的样品，可在薄层色谱展开缸中按需重复点样。确保整个滤纸条已完全被溶剂饱和。然后用镊子将薄层板放入薄层色谱展开缸中。

平板不应接触灯芯。盖上层析缸，待展开剂前沿到达平板顶部前完成展开。将平板从薄层层析槽中取出，并用铅笔标记展开剂前沿的高度。

让薄层板自然晾干。在通风橱中，使用同一个薄层色谱展开槽对剩余的薄层板进行展开；只要保持密闭，该展开槽通常在一天内均可使用。若发现槽内溶剂量明显减少，应在薄层板干燥后配制新的溶剂混合液。

在可见光或紫外光下观察条带。使用带有便携式紫外灯的观察室较为方便，特别是当该灯能够检测254纳米短波紫外光和365纳米长波紫外光下的化合物时。使用铅笔标记条带，并利用配备顶置光源、紫外光和/或可见光的凝胶成像系统对板子进行拍照记录。

最后，为帮助表征条带，可通过以下步骤计算保留因子（Rf值）：首先测量化合物迁移的距离，然后测量溶剂迁移的距离，再将前者除以后者。在标记条带位置后，可将薄层板保存以备后续在生物测定中使用。

用塑料膜包裹平板，并用铝箔覆盖。将平板储存在零下20摄氏度。最大储存时间取决于化合物的稳定性，因为硅胶并非中性。

某些化合物在薄层色谱板上可能会降解。在进行接触生物测定实验前，需在厌氧条件下制备并接种产高浓度氨的细菌（HAB）培养基。本实验所用菌种为 Sticklandii 梭菌菌株 sr。

在39摄氏度下将培养物培养至对数期或稳定期。处理厌氧微生物时需使用无菌厌氧技术。制备0.75%（重量/体积）的溶液。

在琼脂温度降至60摄氏度以下后，使用相同的培养基来培养细菌。将培养物按1%体积比接种至熔化的琼脂中，轻轻混匀后立即放入厌氧室，并用剪刀将混合物倒入15 mm × 100 mm的塑料培养皿中。用剪刀将薄层色谱（TLC）板切割成含有目标条带或多个条带的区域。

使用记号笔标记平板的背面。将一条未使用的薄层色谱条放置在琼脂平板上作为对照。然后将条带有条纹的一面朝下放置在琼脂平板上。

将平板倒置于厌氧箱内的培养箱中，用镊子夹取，在39摄氏度下培养24小时。在厌氧箱内操作，从琼脂平板上取下薄层色谱条带。

将四氧化二红逐滴加至琼脂平板表面。静置显色至少20分钟。当对照平板完全变为红色后，将平板从厌氧舱中取出。

梭菌属 stick Landi 是一种厌氧细菌，因此一旦从厌氧环境中移出，其活性会立即开始下降，但其颜色在24小时以上仍保持稳定。使用数码相机在可见光下对平板进行拍照，背景应提供足够的对比度。当活细胞被染色后，可观察到亮红色。

死细胞不着色。此处展示了含有酚类化合物的红三叶草提取物的代表性硅胶薄层层析（TLC）分离结果。使用乙酸乙酯与正己烷（9:1）作为展开剂，在8.5厘米距离内分离得到五条色带，其中一条完全从原点分离出来。

加载的标准品为 Formin Bio Canon A 和 Genine。从该平板中取出四条带，与产气荚膜梭菌 Landi（一种瘤胃高产氨细菌）共同培养 24 小时，并按此处所述使用四油红染色。将第一条带 Bio Canon A 及第二条带部分 Monon nein 与接种了细菌的琼脂平板共同孵育后，形成了界限清晰的抑菌圈。

然而，将第二条带的剩余部分与第三条带和第四条带一起孵育，并未抑制细菌生长。这些结果表明，生物素Canon A可抑制梭菌Sticklandii的生长，而甲酸Aone Nein则不能。在进行该操作时，重要的是要记住该技术具有灵活性。

只要选择适当的培养基并设置对照以确保分离化学物质和检测方法的兼容性，即可使用其他测试微生物。按照本实验方案，还可采用高效液相色谱和质谱等其他技术，辅助鉴定生物测定中发现的抗菌化合物。