Name: 标记的细胞核从亲和力为基础的隔离果蝇组织的基因表达分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-25T14:15:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: 学习基于亲和力的细胞核分离技术，用于从果蝇组织中分离遗传标记的细胞核，进行基因表达分析和染色质免疫沉淀，揭示特定细胞类型的基因表达特征。

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感谢 Janice Fischer 提供 UAS-EGFP::Msp-300KASH 质粒。mAB24B10 抗体来自发育研究杂交瘤库（Developmental Studies Hybridoma Bank），该库由 NICHD 资助建立，并由爱荷华大学生物学系维护。repo-GAL4 果蝇品系（BL7415）来自印第安纳大学布卢明顿品系中心。特此感谢美国癌症协会机构研究基金（IRG #58-006-53）对普渡大学癌症研究中心的支持。Jingqun Ma 获得了普渡大学农业研究食品与农业助研奖学金的资助。

1. EGFP::KASH 的生成与表征 果蝇
<ol>
	<li>将 Gal4 驱动果蝇与 UAS-EGFP::Msp-300KASH 果蝇杂交。或者，可利用标准遗传学技术构建同时携带 Gal4 驱动子和 UAS-EGFP::Msp-300KASH 转基因的重组果蝇。若需要大量子代，第二种方法更具优势。</li>
	<li>使用标准显微技术对 EGFP::KASH 标记的表达进行表征。注意：在解剖后固定处理的 Drosophila 组织或完整幼虫中，均可通过标准显微技术直接观察 EGFP 表达，无需使用抗体。
	<ol>
		<li>在荧光解剖显微镜下确定 EGFP::KASH 标记在整个生物体中的表达模式（参见材料 PDF）。注意：许多 Gal4 驱动子（包括 图1 所示的 repo-GAL4 驱动子）在其他幼虫组织（如唾液腺）中表现出非特异性表达模式（见结果部分）。</li>
		<li>利用共聚焦显微镜分析目标解剖组织中 EGFP::KASH 的表达模式。
		<ol>
			<li>使用终浓度为 4% 的甲醛固定目标组织，并用终浓度为 0.1 μg/ml 的 DAPI 对 DNA 染色，以观察 EGFP::KASH 标签相对于 DNA 的定位情况。</li>
			<li>根据目标组织的大小，选用&#160;40X / 1.30 油浸物镜或&#160;20X / 0.75 油浸物镜进行成像。以下激发/发射条件可用于图像采集：408 nm / 425–475 nm（DAPI）；488 nm / 525–550 nm（GFP）。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 从黑腹果蝇（Drosophila）幼虫组织中分离细胞核
<ol>
	<li>准备幼虫组织解剖及后续细胞核分离所需的设备。需要注意的是，如有需要，也可使用完全去壳的胚胎作为起始材料。如果目标细胞类型存在于特定组织中（例如成虫盘），建议使用部分解剖的幼虫组织而非整条幼虫。这种方法可减少非特异性结合，并避免某些Gal4驱动子在非靶细胞中表达所引起的问题。
	<ol>
		<li>准备两把尖头镊子（参见材料PDF）、一个硅化9孔玻璃板（参见材料PDF）以及PBT（1×PBS，pH 7.4；0.1% Tween-20）。</li>
		<li>将GFP抗体预结合到磁珠上。此步骤应在开始解剖前进行。向400 μl洗涤缓冲液（1×PBS，pH 7.4；2.5 mM MgCl₂）中加入10 μl磁珠（Invitrogen，参见材料PDF）和2 μg GFP抗体（Roche，参见材料PDF）2) 加入1.5 ml离心管中。根据样品中目标物的含量以及抗体与磁珠的结合亲和力，必要时可优化磁珠和抗体的使用量。</li>
		<li>将珠子与抗体在室温下旋转孵育至少30分钟。</li>
		<li>将含有磁珠和抗体的1.5 ml离心管置于磁力架上（参见材料PDF），静置约1–2分钟，使磁珠吸附至管壁一侧。使用1 ml移液器移除含有未结合抗体和洗涤缓冲液的上清液。磁珠将保持吸附在1.5 ml离心管靠近磁铁一侧的管壁上。</li>
		<li>用1 ml洗涤缓冲液将磁珠洗涤两次，每次操作参见2.1.4节。每次洗涤时，将1.5 ml离心管从磁力架上取下，短暂倒置以混匀磁珠与洗涤缓冲液。</li>
		<li>将抗体结合的磁珠保存在洗涤缓冲液中，直至准备进行步骤2.7。在实验流程的任何阶段，均不可让磁珠干燥。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在PBT中解剖幼虫组织，并将解剖好的组织转移至9孔板中的一个孔内。通常，从100只三龄幼虫中解剖视叶和眼成虫盘，可为细胞核分离后的下游基因表达分析提供足够的材料。</li>
	<li>用核提取缓冲液（10 mM HEPES-KOH，pH 7.5；2.5 mM MgCl₂）冲洗分离的组织2；10 mM KCl）于1.5 ml离心管中。将分离的幼虫组织转移至冰上预冷的1 ml Dounce匀浆器（见材料PDF）中，内含1 ml新鲜的核提取缓冲液。冰上孵育5分钟。若在细胞核分离后进行RNA提取，则无需添加蛋白酶抑制剂。</li>
	<li>用松散研杵研磨组织20次，然后将样品置于冰上孵育10分钟，使细胞充分肿胀。使用紧密研杵研磨15次，以从细胞中提取细胞核。松散研杵和紧密研杵的研磨次数需根据不同组织和细胞类型进行优化；过度匀浆可能导致细胞核剪切，而匀浆不足则无法从组织中完全释放所有细胞核。</li>
	<li>将含有细胞核和细胞碎片的匀浆液通过已用核匀浆缓冲液预冲洗的40 μm孔径滤网（见材料PDF）进行过滤，收集滤过的匀浆液至新离心管中。</li>
	<li>收集 预分离 用于后续分析，以确定细胞核得率、细胞核完整性，以及在细胞核分离前目标基因的转录水平。
	<ol>
		<li>使用移液器将50 μl过滤后的匀浆液转移至新的1.5 ml离心管中。此为 预分离 样品。加入500 μl Trizol试剂（参见材料PDF，注意安全），颠倒混匀，于-20 °C保存，用于后续RNA提取（步骤3.1）。</li>
		<li>将20 μl过滤后的匀浆液转移至新的1.5 ml离心管中。
		<ol>
			<li>加入DAPI至终浓度为0.1 μg/ml，冰上孵育样品10分钟。</li>
			<li>将经DAPI染色的细胞核转移至多聚赖氨酸包被的盖玻片上，置于显微镜载片上。用透明指甲油封固盖玻片。</li>
			<li>使用荧光显微镜检查细胞核的完整性以及目标GFP标记细胞核的存在情况。注意：如果这些载玻片在制备后较短时间内（24小时内）进行分析，则无需固定细胞核或对GFP进行染色。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将10 μl过滤后的匀浆液转移至新的1.5 ml离心管中，加入90 μl洗涤缓冲液（1×PBS，pH 7.4；2.5 mM MgCl₂）2加入DAPI至终浓度为0.1 μg/ml，冰上孵育10分钟。使用血细胞计数板，在10倍空气物镜下通过落射荧光显微镜计数DAPI阳性细胞核，测定分离前样品中的细胞核得率。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将含有抗体结合磁珠的1.5 ml离心管（按2.1.6节制备）置于磁力架中，参照2.1.4节所述，使磁珠在磁场作用下吸附至少2分钟。用1 ml移液器吸除抗体结合磁珠中的洗涤缓冲液，再用1 ml移液器将2.5步中过滤后的匀浆液加入该1.5 ml离心管中。</li>
	<li>轻轻翻转离心管数次以混匀，并在4 °C下颠倒摇动孵育30分钟。尽量避免管中产生气泡，因为气泡可能导致细胞核聚集。</li>
	<li>将含有抗体结合磁珠和匀浆液的1.5 ml离心管置于磁力架上，按照2.1.4节所述，使磁珠在磁场中吸附至少2分钟。用1 ml移液器移除含有未结合细胞核组分的匀浆液。</li>
	<li>用1 ml洗涤缓冲液洗涤样品3次，每次洗涤时将含有磁珠、结合的细胞核和洗涤缓冲液的1.5 ml离心管从支架上取下，倒置并轻轻混匀数次，然后将离心管放回磁力架中（如步骤2.9所述），用1 ml移液器吸除上清液。</li>
	<li>向结合有目标细胞核的珠子中加入150 μl洗涤缓冲液。这是 分离后 样品。为显微镜分析和后续RNA提取制备样品。
	<ol>
		<li>转移20 μl的 分离后 将样品转移至新的1.5 ml离心管中，用DAPI染色，并按照2.6.2节所述进行分析。计数磁珠捕获的GFP+/DAPI+和GFP-/DAPI+细胞核，以确定富集的GFP+细胞核的纯度 分离后 样品</li>
		<li>向剩余部分加入1 ml Trizol试剂 分离后 样品倒置混匀，于 -20 °C 保存，用于后续 RNA 提取（步骤 3.1）。注意：Trizol 中的样品如有需要可在 -20 °C 保存数周。使用 Trizol 试剂提取 RNA 前无需将细胞核从磁珠上洗脱，因为磁珠不会干扰后续 RNA 分离。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 测定幼虫组织分离的细胞核中的转录本水平
<ol>
	<li>使用基于Trizol的RNA提取标准方案（参见材料PDF），从第2.6.1节和2.11.2节制备的分离前和分离后样品中提取RNA，并作如下修改：
	<ol>
		<li>在RNA沉淀形成沉淀物后，向沉淀中加入19.2 μl无RNase水和0.8 μl RNASecure试剂（参见材料PDF），于60 °C孵育20分钟，以灭活RNase。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用荧光RNA结合染料（如Qubit RNA检测试剂盒，参见材料PDF）和Qubit™ 2.0荧光仪，按照制造商提供的操作说明测定RNA浓度。</li>
	<li>使用扩增型逆转录酶（如EpiScript逆转录酶试剂盒）和oligo(dT)引物，按照制造商说明书合成cDNA。注意：通常50至100 ng RNA足以用于多次基因表达分析。应使用等量的分离前和分离后RNA进行cDNA合成。</li>
	<li>在实时定量PCR（qPCR）分析前，向20 μl cDNA样品中加入180 μl无核酸酶水，使其稀释10倍。此稀释步骤至关重要，因为未稀释的cDNA样品可能抑制qPCR反应。</li>
	<li>配制qPCR主混合液，包含DNA聚合酶和dNTPs，每种上下游引物各4 pmol，用无菌水补足至每反应20 μl的终体积。
	<ol>
		<li>设计qPCR引物时，应靶向目标细胞类型中预期表达的基因，以及组织采集时所处发育阶段的基因。若可能，引物设计应跨内含子，以便区分基因组DNA与cDNA的PCR产物。注意：若目标细胞类型的基因表达谱未知，可使用针对eGFP的引物，因其应在标记的细胞核群体中特异性表达，可用于优化特定细胞类型和组织的实验方案（表1）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过与来自整个组织的cDNA梯度稀释系列进行比较，测定分离前和分离后样品中各目标基因的相对转录水平。目标基因的转录水平应归一化至参考基因（如Rpl32，或更优地，多个参考基因）。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案可用于从果蝇（Drosophila）胚胎或幼虫组织的混合细胞群体中分离或高度富集特定标记的细胞核。采用本方案，可在约1小时内从解剖获得的组织中分离出细胞核。分离所得细胞核的纯度和得率需针对每种细胞类型进行实验测定。由于样本中含有磁珠，使用血细胞计数板在分离后的阶段对磁珠结合的细胞核进行定量较为困难。因此，如果下游应用需要精确的细胞核数量，则必须基于其他方法（如DNA含量）来估算细胞核得率。对于基因表达分析，只要能够成功提取并定量RNA，则无需进行细胞核得率的精确计算。建议采用基于荧光的方法来定量RNA得率，因为我们发现，对于此类低浓度样本，分光光度法测定RNA浓度的结果变异度较高。
影响本实验方案成功与否有两个关键因素：磁珠的选择和抗体的选择。偶联了GFP或蛋白G的磁珠可从多个商业来源获得。然而，强烈建议在本方案所述实验中使用Invitrogen公司提供的蛋白G磁珠，主要原因有两个。首先，Invitrogen磁珠的粒径为2.8 μm，略小于我们所检测细胞类型中细胞核的平均大小（约5 μm）（图2D）。粒径更小的磁珠（...

果蝇 中枢神经系统等组织包含多种复杂的细胞类型。因此，若要分析特定细胞类型的基因表达谱，需从 黑腹果蝇 组织，首先需要分离出足够数量的特定细胞，以获得同质性的细胞群体，从而满足后续应用的需求。从完整组织中分离细胞的方法包括激光显微切割以及全细胞的荧光激活细胞分选（FACS）。尽管FACS已被用于分离细胞和细胞核 果蝇 胚胎及自 秀丽隐杆线虫 elegans 用于基因表达和染色质分析1-3，对于细胞类型高度混杂或细胞形态不规则（如神经元）的组织，FACS 和激光显微切割技术往往难以成功实施。为克服这一困难，可从特定细胞类型中分离细胞核而非完整细胞，并用于后续的基因表达谱分析。重要的是，基于微阵列的 mRNA 表达分析若采用核 RNA 样本，其结果通常与使用总 RNA 所得结果具有可比性4,5此外，利用核RNA进行基因表达分析已成功应用于研究多种生物体中的基因表达，包括 秀丽隐杆线虫, 拟南芥, 果蝇， 和人类4,52,3.
最近已报道了多种用于分离特定标记细胞核群体的方法 黑腹果蝇 适用于基因表达分析和/或染色质免疫沉淀的组织。基于细胞类型特异性表达核定位绿色荧光蛋白（GFP）的固定细胞核，通过荧光激活细胞分选技术（FACS）分离组织特异性染色质的批量方法（BiTS-ChIP）2该方法已成功用于分析组蛋白修饰和转录因子的分布，通过从中胚层分离的细胞核进行染色质免疫沉淀实现 果蝇 胚胎2然而，基于FACS的方法在分离标记细胞核时可能存在局限性，特别是当标记细胞核在混合群体中仅占很小比例时，由于需要更长的分选时间才能获得足够数量用于后续实验的细胞核。为克服这些限制，多个研究团队已采用基于亲和力的分离技术，以纯化特定细胞类型中带有特异性表位标记的细胞核。其中，针对特定细胞类型中标记细胞核的分离方法（INTACT）是为在 拟南芥6,7 最近已被改进并应用于 果蝇8. 在该方法中，核膜融合蛋白是作为底物的 体内 生物素化与以下成分共表达 大肠杆菌 特定细胞类型中的生物素连接酶BirA。随后可利用链霉亲和素介导的亲和分离法从混合群体中纯化出生物素标记的细胞核。利用该方法，已成功对中胚层中的细胞核进行了标记与分离。 果蝇 在中胚层特异性增强子调控下表达核膜融合蛋白的胚胎8作者还构建了核膜融合蛋白，该蛋白可在Gal4调控序列UAS的控制下于任意细胞类型中表达。9该方法能够快速从混合的细胞核群体中分离出标记的细胞核亚群，但需要三种独立的转基因构建体，因此可能不适用于某些特定的遗传学应用。最近，已有研究描述了一种利用SUN（Sad1 和 联合国含有C-84结构域且定位于核膜内层的蛋白质被标记上荧光蛋白，并在Gal4/UAS系统调控下表达10在非离子型去污剂存在下分离细胞核，以去除核膜外层，并使用与抗GFP抗体偶联的磁珠进行亲和纯化。该方法已成功用于从成年大脑中特定神经元亚型的少量标记细胞核中进行分离。 果蝇10.
此处提供一种从混合细胞群体中分离标记细胞核的实验方案 果蝇 幼虫组织的描述。该方法为独立开发，但与Henry所述的方法相似 等10&#160;首先，利用一种仅在特定细胞类型中表达的荧光标签对细胞核进行标记 黑腹果蝇 以利用基于亲和力的方法从混合群体中后续分离标记的细胞核。为标记细胞核，使用KASH（Klarsicht/Anc-1/Syne h利用了KASH（klarsicht、ANC-1、syne同源）结构域。KASH结构域是一种跨膜结构域，通过与核周间隙中含SUN结构域的蛋白质相互作用，定位于核膜外膜。11. 诸如蛋白质的C端KASH结构域 果蝇 Msp-300 和 Klarsicht 将这些蛋白质锚定于核外膜，而它们的N端结构域则与细胞质中的细胞骨架蛋白（如肌动蛋白或微管蛋白）相互作用12-14构建了包含KASH结构域的重组体 果蝇 Msp-300 与 EGFP 的 C 末端融合，由 pUAST-attB 载体中的 Gal4 调控序列 UAS 控制15,16. 利用phiC31位点特异性整合技术，构建了转基因果蝇，其中的 UAS-EGFP::Msp-300KASH 转基因被插入到 attP2 3L号染色体上的位点17。该 UAS-EGFP::Msp-300KASH 果蝇可与在特定细胞类型中表达Gal4驱动因子的果蝇杂交，从而在目标细胞类型中外核膜上特异性表达EGFP。随后可利用与磁珠偶联的GFP抗体，从混合细胞群体中纯化标记的细胞核。该方法无需使用非离子型去污剂，因为EGFP标签定位于外核膜的胞质侧，因而可被抗体直接识别。
下述方案可用于从特定细胞类型中分离/富集 EGFP 标记的细胞核 果蝇 幼虫组织，以定量分析分离细胞核的纯度和得率，并提取适用于定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）基因表达分析的核RNA。细胞核的分离与亲和纯化（不包括组织解剖）可在一小时以内完成。结果显示，可成功从幼虫视叶和眼成虫盘中分离胶质细胞核，并用于后续的基因表达分析。预计该方法将适用于从胚胎和幼虫组织中分离或富集标记细胞核，尤其适用于目标细胞占总体细胞比例不足5%的情况。所有 果蝇 本研究中构建的菌种和质粒可向作者索取。

<table><tbody><tr><td>抗chaoptin抗体（小鼠，单克隆）</td><td>发育研究杂交瘤库</td><td>mAB24B10</td><td></td></tr><tr><td>抗GFP抗体（小鼠，单克隆）</td><td>罗氏</td><td>11814460001</td><td>本方案推荐使用该特定抗体，但也可使用其他替代抗体。</td></tr><tr><td>含ROX的2x Bullseye EvaGreen qPCR预混液</td><td>MidSci</td><td>BEQPCR-R</td><td></td></tr><tr><td>DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，盐酸盐）</td><td>Biotium</td><td>40011</td><td></td></tr><tr><td>杜恩斯匀浆器（1 ml）</td><td>VWR</td><td>62400-595</td><td></td></tr><tr><td>杜蒙特#5镊子，11 cm</td><td>世界精密仪器公司</td><td>14095</td><td></td></tr><tr><td>用于免疫沉淀的Dynabeads Protein G磁珠</td><td>Invitrogen</td><td>10003D</td><td>本方案推荐使用该特定品牌的磁珠。</td></tr><tr><td>EpiScript逆转录酶</td><td>Epicentre</td><td>ERT12910K</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.epibio.com/docs/default-source/protocols/episcript-reverse-transcriptase.pdf">http://www.epibio.com/docs/default-source/protocols/episcript-reverse-transcriptase.pdf&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Falcon细胞筛，40 &amp;mu;m孔径</td><td>VWR</td><td>21008-949</td><td>可根据目标细胞核的大小选择其他孔径的筛网。</td></tr><tr><td>磁力架（8 x 1.5 ml离心管）</td><td>Millipore</td><td>LSKMAGS08&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>小型管式旋转混合仪</td><td>Genemate</td><td>H-6700</td><td></td></tr><tr><td>Qubit起始试剂盒</td><td>Life Technologies</td><td>Q32871</td><td>可使用类似的基于荧光的RNA产量定量方法。&lt;a href=&quot;http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp32852.pdf">http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp32852.pdfZ&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>RNAsecure（Ambion）</td><td>Life Technologies</td><td>AM7010</td><td>使用该试剂灭活RNase为可选步骤。</td></tr><tr><td>RT-PCR仪（热循环仪）</td><td>BioRad</td><td>CFX Connect Thermal Cycler</td><td></td></tr><tr><td>硅化处理的9孔玻璃板</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-134</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜荧光适配器（蓝紫色激发光（440-460 nm）+黄色滤光片）</td><td>Nightsea</td><td></td><td>该适配器可使标准解剖显微镜（例如Nikon）用于观察GFP荧光</td></tr><tr><td>带10X广角目镜和通用臂式支架的StereoZoom显微镜83604套装</td><td>Nikon</td><td>SMZ 745</td><td></td></tr><tr><td>热循环仪</td><td>BioRad</td><td>T100</td><td></td></tr><tr><td>Trizol试剂</td><td>Life Technologies</td><td>15596018</td><td>注意：可使用其他RNA提取方法。&lt;a href=&quot;http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf">http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Amresco</td><td>0777-1L</td><td></td></tr></tbody></table>

基于亲和力的标记细胞核分离 果蝇 用于基因表达分析的组织样本

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila melanogaster 胚胎和幼虫组织通常包含高度异质性的多种细胞类型，这可能会使这些组织中基因表达的分析变得复杂。因此，为了分析 Drosophila 组织中特定细胞的基因表达谱，可能需要以高纯度并获得足够产量来分离特定细胞类型，以满足转录谱分析和染色质免疫沉淀等下游应用的需求。然而，诸如中枢神经系统等组织中细胞形态不规则，加之特定细胞类型在组织中所占比例稀少，使得激光显微切割和荧光激活细胞分选（FACS）等传统的细胞分离方法面临挑战。本文描述了一种替代方法，即通过基于亲和力的标记细胞核分离（而非完整细胞）来表征特定细胞的基因表达谱。利用 Gal4/UAS 双元表达系统，可使目标特定细胞类型中的细胞核通过定位于核膜的 EGFP 标签实现遗传标记。这些带有 EGFP 标签的细胞核可通过与磁珠偶联的抗 GFP 抗体进行分离。本方案所述方法能够从 Drosophila 幼虫中枢神经系统中稳定地高纯度分离特定细胞类型的细胞核，且产量足以用于表达分析，即使这些细胞类型在组织总细胞群中所占比例不足 2%。该方法可结合特异性的 Gal4 驱动子，用于分离多种 Drosophila 胚胎和幼虫细胞类型的细胞核，并可能适用于那些不适合采用 FACS 或激光显微切割的细胞类型的细胞核分离。

在发育的多个阶段，repo-GAL4 驱动子（Bloomington 菌株编号 7415）在 Drosophila 神经系统中的胶质细胞中特异性表达18。利用标准遗传学技术，构建了在 repo-GAL4 驱动子控制下稳定表达 UAS-EGFP::Msp-300KASH 的果蝇品系。为表征这些果蝇中 EGFP::KASH 转基因的表达模式，使用共聚焦显微镜检测了三龄幼虫解剖所得视叶和眼成虫盘中 GFP 的表达模式。解剖的组织用 DAPI 复染以标记 DNA，并用 α-chaoptin19 抗体（mAb24B10， 参见材料 PDF）标记感光神经元轴突。图1A 显示，由 repo-GAL4 驱动的 EGFP::KASH 转基因在视叶和眼成虫盘的胶质细胞中表达，表达模式符合预期。在更高倍镜下观察，EGFP 表达呈环状分布，包围 DAPI 阳性的 DNA，与 EGFP::KASH 标签定位于核膜的特征一致（图...

Drosophila 组织通常包含多种不同类型的细胞混合物。&#160;为了研究特定组织中某类特定细胞的基因表达情况，可通过遗传标记标记细胞核，并随后利用亲和结合方法将其分离。分离得到的细胞核可用于基因表达分析、染色质免疫沉淀等后续实验。

黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的胚胎和幼虫组织通常包含高度异质性的多种细胞类型，这可能会使基因表达分析变得复杂……

affinity-based-isolation-tagged-nuclei-from-drosophila-tissues-for

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

标记的细胞核从亲和力为基础的隔离<em&gt;果蝇</em&gt;组织的基因表达分析

Drosophila melanogaster 的睾丸可通过解剖针从成年雄性个体中快速高效地分离。经过练习，可在一至两天内分离出足量的睾丸组织，用于高通量测序或更传统的分子生物学方法对 DNA 或 RNA...

Drosophila melanogaster 睾丸的分离

此处我们描述一种整体荧光标记方法 原位 杂交（FISH）方案，用于确定果蝇胚胎发育期间表达的RNA的表达与定位特性， 黑腹果蝇.

完整组织 RNA 荧光 原位 杂交检测 Drosophila 胚胎

本出版物旨在对从黑腹果蝇（Drosophila...

果蝇（Drosophila Melanogaster）中微小RNA种类的增强型Northern印迹检测

我们描述了一种多靶点显色整体原位杂交 原位 杂交（MC-WISH）过程在完整样本中 果蝇...

多靶标显色整体原位杂交 原位 杂交法用于比较基因表达区域 果蝇 胚胎

所描述的RNA 原位 杂交方案可实现对完整组织中RNA的检测 果蝇...

高分辨率荧光 原位 杂交 果蝇 使用酪酰胺信号放大法的胚胎与组织检测

本方案旨在可视化Drosophila多线细胞中的异染色质聚集体。...

用于可视化异染色质相关蛋白的免疫荧光染色 果蝇 唾液腺

本文介绍了一种细胞核制备的实验方案。在将心脏组织经显微解剖和酶解离为单个细胞后，祖细胞被冷冻保存，随后分离出纯度高且具有活性的细胞，用于单核RNA测序以及基于高通量测序的单核转座酶可及性染色质分析。...

从小鼠心脏前体细胞中分离细胞核用于单细胞分辨率下的表观基因组和基因表达谱分析

扩增辅助迭代荧光原位杂交（EASI-FISH）是一种强大的技术，结合了扩增显微镜与荧光原位杂交（FISH），用于在厚组织中检测多个基因的表达。本方案概述了该方法的最新进展及其在完整Drosophila中枢神经系统标记中的应用。...

完整组织中基因表达的多重检测 果蝇 利用扩增辅助迭代荧光技术研究大脑 原位 杂交

该方案描述了一种对单核苷酸多态性敏感的荧光原位杂交（SNP-FISH）方法，用于区分源自黑腹果蝇（Drosophila...

单核苷酸多态性敏感的FISH检测法用于果蝇（Drosophila melanogaster）位点特异性核糖体RNA转录的检测

该方案描述了进行杂交链式反应荧光检测所需的步骤 原位 杂交（HCR-FISH）在 黑腹果蝇...

杂交链式反应FISH在发育过程中的应用 果蝇 视叶

学习基于亲和力的细胞核分离技术，用于从果蝇组织中分离遗传标记的细胞核，进行基因表达分析和染色质免疫沉淀，揭示特定细胞类型的基因表达特征。

基于亲和力的标记细胞核分离果蝇用于基因表达分析的组织样本

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