Name: Subnormothermic的技术前体内肝脏灌注的存储，评估和修复边际移植肝 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: 了解亚常温离体肝脏灌注技术用于边缘供肝的保存与功能评估。该方法在接近生理条件下减少保存损伤，并通过酶学检测和组织学分析实现移植前 viability 评价，为肝移植研究提供新方案。

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本研究得到了罗氏器官移植研究基金会（ROTRF）和安斯泰来公司的研究资助。Markus Selzner 获得了美国移植外科医师学会（ASTS）职业发展奖的支持。Matthias Knaak 获得了安斯泰来研究奖学金的支持。我们感谢 Uwe Mummenhoff 和伯明翰家族的慷慨支持。

本方案的示意图见图1。
<img alt="从热缺血到亚常温灌注的转换示意图，手术操作时间线。" src="/files/ftp_upload/51419/51419fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 研究方案。 本研究采用猪肝脏损伤模型，基于心脏死亡后捐献（DCD）模型设计。在游离所有肝脏血管后，诱导心脏死亡，随后进行45分钟的热缺血。为模拟临床情况下供体与受体医院之间的器官转运过程，器官在冷灌注液双路冲洗后于冰上保存4小时。冷保存结束后，器官接受6小时的亚常温灌注，以评估灌注的稳定性。在移植模型中，灌注时间可能更短，旨在恢复能量储备并评估器官活力。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51419/51419fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
1. 动物
注意：本研究使用了30-35公斤的雄性约克夏猪。所有动物均按照美国国家医学研究协会制定的《实验动物护理原则》以及美国国立卫生研究院出版的《实验动物护理指南》接受人道护理。多伦多综合研究所动物护理委员会批准了所有研究。
2. 器官获取
<ol>
	<li>在灌注或移植前，将雄性约克夏猪饲养于研究设施中1周，以降低应激水平并使动物适应饲养环境。在设施内饲养少于2天将导致应激诱导的生理反应，可能影响灌注结果22,23.</li>
	<li>通过肌肉注射给予猪混合麻醉剂（氯胺酮 25 mg/kg、阿托品 0.04 mg/kg 和咪达唑仑 0.15 mg/kg）进行麻醉。</li>
	<li>插管前，确保猪自主呼吸2 L的O₂2 用5%异氟烷麻醉。在插管前2分钟向声带喷洒2%利多卡因，以避免声带痉挛。例如，对于体重35 kg的猪，使用6.5 Fr气管导管。用3–5 ml室温空气封闭气管导管。</li>
	<li>插管后，使用二氧化碳监测法确认插管位置正确。将异氟烷气体浓度下调至2%。设置呼吸机参数为呼吸频率14-16次/分钟，潮气量为10 ml/kg体重。</li>
	<li>在耳静脉中置入20 G静脉导管，用于输注乳酸林格液（200 ml/小时）。随后对猪进行消毒，并用无菌铺巾覆盖。</li>
	<li>沿中线做切口，并向左侧延伸。用纱布覆盖小肠和大肠，并将其移至左侧。</li>
	<li>分离下腔静脉（IVC）与远端主动脉；结扎主动脉向背部发出的分支；游离并分离肾动脉周围的粘连组织。</li>
	<li>使用电灼分离镰状韧带和三角韧带。</li>
	<li>通过切开胰腺与门静脉之间的腹膜来游离门静脉。结扎从胰腺引流至门静脉的静脉。</li>
	<li>在门静脉下方解剖腹腔干，并逆向追踪至腹主动脉。用2-0丝线环绕肠系膜动脉；环绕腹腔干后方分支的脾动脉和左胃动脉。将腹腔干从门静脉分离。</li>
	<li>结扎肝十二指肠韧带内的淋巴管，以防止淋巴液渗漏。在结扎线之间离断胃右动脉。结扎较细的静脉。游离胆管与韧带的连接，结扎后于远端离断胆管。</li>
	<li>在膈肌后方、心脏与腹腔干之间解剖主动脉；用2-0缝线在主动脉周围结扎。</li>
	<li>使用电凝术从右侧下腔静脉处松解肝脏；使用剪刀处理腔静脉与肝脏之间的上部区域。</li>
	<li>切除胆囊并电凝胆囊床的出血点。</li>
	<li>静脉注射肝素，剂量为1,000 iU/kg供体体重。对于DCD模型，在给予肝素3分钟后，通过心内注射40 mval KCl诱导心脏停搏。以心脏停搏作为热缺血开始的时间起点。</li>
	<li>灌注用血的采集：在猪心脏死亡后立即采集1.6 L血液至含CPDA（枸橼酸盐、磷酸盐、葡萄糖、腺苷）抗凝剂的血袋中。进行低速离心（2,000 × g，无刹车）。在无菌条件下（II级生物安全柜内）去除血浆和白细胞层，将红细胞保留在CPDA血袋中用于输注。</li>
	<li>用器官灌注管路插管门静脉和主动脉。结扎先前已放置的股动脉、肾动脉、脾动脉、肠系膜动脉和左胃动脉以及上段主动脉周围的结扎线。对于心脏跳动供体（HBD）模型，需在心脏跳动状态下完成主动脉和门静脉的插管。</li>
	<li>经过45分钟的热缺血后，通过主动脉（加压袋驱动）和门静脉（重力驱动）双通路灌注，用威斯康星大学（UW）溶液冲洗肝脏。</li>
	<li>将猪的肝脏切除，保留所有剩余血管的长度。</li>
	<li>在台式准备期间，使用Satinsky钳夹闭上腔静脉，并通过下腔静脉逆行灌注约0.5 L的UW溶液，对肝脏进行第二次冲洗，直至门静脉流出液变清。</li>
	<li>结扎主动脉和腹腔干的所有动脉分支。使用约0.5 L的UW溶液进行动脉台式压力灌注。</li>
	<li>使用 UW 溶液冲洗胆管。</li>
	<li>使用带有鲁尔锁扣的1/2” x 3/8”变径接头插管下腔静脉的上部和下部；使用带有鲁尔锁扣的3/8” x 1/4”和1/4” x 3/8”变径接头分别插管门静脉和肝动脉。以上、下腔静脉作为静脉引流通道。</li>
	<li>将肝脏放入器官袋中，封好器官袋，并将肝脏置于冰上保存，直至灌注开始。</li>
</ol>
3. 离体 肝脏灌注
<ol>
	<li>配制灌注液，包含 2,000 ml Steen 溶液、400 ml 洗涤红细胞、550 mg 丙酮酸钠、100 ml 氨基酸溶液（10% Travasol）、10 mg 葡萄糖酸钙、1,000 IE 速效胰岛素、1 g 头孢唑林、500 mg 甲硝唑和 10,000 iU 肝素。根据具体研究方案，添加用于血管扩张、免疫抑制、清除活性氧或肝细胞处理的其他分子。</li>
	<li>透析组分使用标准透析液，其中含 3.5 mM 钾、25 mM 碳酸氢盐、27 mM 葡萄糖以及 275 mg/L 丙酮酸盐。</li>
	<li>建立灌注回路（示意图见 图2). 
	<img alt="Liver perfusion diagram; circulatory system setup for organ study; includes pump, dialyzer, oxygenator." src="/files/ftp_upload/51419/51419fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
	图2. 电路设置。 从主储液罐作为起始点和终点，灌注液由离心泵驱动流经氧合器。在溶液完成氧合后，管路分为两条支路：一条较细的管路通向透析器单元以维持电解质平衡，另一条较粗的管路通向白细胞滤器以减少残留的白细胞（WBC）。流经透析器的溶液返回主储液罐。经过白细胞滤器后，管路再次分为两条等径支路：其中一条在较高压力（约60 mmHg）下直接进入主动脉，用于灌注肝动脉；另一条则流入第二个储液罐，由此储液罐对门静脉进行灌注。门静脉灌注的压力取决于该储液罐液面高度所产生的静水压（约2–6 mmHg）。所有液体通过肝下和肝上腔静脉回流至主储液罐。为减少重力影响并实现均匀灌注，肝脏被置于一个盛有温度可控水的水槽中，通过一层不透水膜与水隔离，并悬浮于灌注液中进行灌注。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51419/51419fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
	<ol>
		<li>将管路中的所有液体收集至一个3 L的储液器（主储液器）中，并夹闭出液端。</li>
		<li>将流出端连接至离心泵，再连接商用氧合器。</li>
		<li>在氧合器后方，将管路分为两条。将其中一条连接至透析器，并将其回流至主储液罐。将另一条连接至白细胞减少滤器。</li>
		<li>将白细胞过滤器后的管路分为动脉管路和门静脉管路：动脉管路向肝动脉供应灌注液，门静脉管路将灌注液输送至第二个储液器，后者通过重力引流进入门静脉。夹闭门静脉入流端。</li>
		<li>将动脉导管连接至引流至主储液器以回收液体的下腔静脉导管。</li>
		<li>为收集腹水或防止灌注液从肝脏渗漏，准备连接至主储液器的吸液管路。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>松开主储液罐的流出夹，用灌注液填充管路。以1,500转/分钟启动离心泵。灌注液将通过动脉管路进入静脉管路，回流至主储液罐。确保所有空气均被排出管路系统。</li>
	<li>打开氧合器的气体供应。</li>
	<li>将肝脏从冰上取出，用生理盐水冲洗以去除UW溶液。</li>
	<li>将肝脏凸面朝下放置，以方便接触血管，理想情况下应在无重力环境中操作，以避免器官在接触面受压。使用可加热和冷却的水浴装置。将循环系统和水浴的初始温度设定为 20 °C用不透水膜覆盖水浴，并将肝脏置于该膜上。通过灌注液浸没肝脏，以减少重力引起的压缩。</li>
	<li>将离心泵转速降至1,000转/分钟，并在动脉和腔静脉管路连接处放置两个夹子，然后在两个夹子之间剪断管路。使用三通接头将两条腔静脉流出管连接，并与腔静脉管路相连。</li>
	<li>松开动脉管路上的夹子，将灌注液倒入动脉插管以排出气泡，然后将管路连接至插管。将离心泵转速调至1,500转/分钟。松开下腔静脉管路上的第二个夹子。</li>
	<li>松开门静脉储液器上的夹子以使其充满。让灌注液流入门静脉套管并连接。特别注意保持门静脉储液器内液面稳定。</li>
	<li>将压力导管连接至动脉、门静脉和下腔静脉插管的鲁尔锁接头。</li>
	<li>为了模拟生理条件，将处理剂注入右侧血管。将葡萄糖注入门静脉而非动脉导管，以建立模拟门静脉葡萄糖梯度升高的梯度，从而诱导糖原合成24,25.</li>
	<li>将肝脏连接至循环系统后，升高温度至 33 °C 60 分钟内</li>
	<li>目标是使动脉起始流量在40 mmHg时约为250 ml/min。当压力升高至70 mmHg时，灌注过程中流量可达到700 ml/min。</li>
	<li>起始温度下，目标门静脉血流为 500–600 ml/min，压力维持在 3–5 mmHg。升温后，监测门静脉血流，其可增至 1,100 ml/min，压力升至 4–6 mmHg。应避免门静脉压力超过生理值（约 8 mmHg），以保护肝窦内皮窗孔结构26避免总流量超过2,000 ml/min，以防止器官损伤。通过降低主储液罐将流出压力设定为-2 mmHg，以防止因功能性流出道梗阻导致肝脏充血。</li>
	<li>将透析组件加入回路中，以使灌注液达到预设值27将透析液流速设置为 500 ml/hr。需特别注意调节透析液流出量，确保灌注液既不被稀释也不被浓缩。在灌注开始的第一个小时内，必须密切观察主储液器！</li>
	<li>通过使用以 O₂ 为主要气体混合成分的方法，确保组织的均匀氧合，以恢复并维持器官功能2 (95-98%) 和 CO2 （2-5%）。灌注过程中使用可变气体，因为肝脏在灌注期间会改变其代谢和pH需求。</li>
	<li>在灌注初期维持较低的pH值，利用pH悖论概念保护器官28 并避免在再氧合过程中因快速恢复至生理pH而造成的严重组织损伤，因为在UW溶液中保存后，器官的pH呈酸性，低于7。调节CO₂分压2 持续降至25-30 mmHg，使pH在1小时内达到生理水平。</li>
	<li>向灌注液回路中加入碳酸氢钠或碳酸氢钾，以达到生理浓度的标准碳酸氢盐水平。在重复进行血气和电解质监测的条件下小心注入。</li>
	<li>通过定期进行静脉和动脉血气以及AST分析来监测灌注情况。静脉PO₂2 在灌注期间保持压力高于175 mmHg。监测血管流量和压力，并通过恒定的血管阻力判断灌注稳定。</li>
	<li>将灌注系统保持稳定长达8小时。在实验结束时 离体 灌流期间，将灌流系统冷却至 20 °C 断开管路与肝脏的连接后，用冰冻的UW溶液双路冲洗肝脏，以排出灌注液。将肝脏再次置于冰上，放入无菌器官袋中保存。</li>
</ol>

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作者无任何利益冲突需要披露。

在模拟 DCD 肝脏移植的猪模型中，我们证明了使用细胞灌注液进行亚常温肝脏灌注可实现稳定的灌注参数，肝细胞损伤极小，并维持活跃的肝脏代谢。我们的亚常温灌注系统已证实能够恢复肝细胞的内环境稳态和代谢功能，糖原储存得以恢复，代谢废物被有效清除。
离体 将肝脏灌注作为一种器官保存技术，首次为在移植前评估移植物功能和损伤标志物提供了可能。除了对移植物灌注均匀性的宏观评估外，灌注流量值还可作为移植物活力及其先前所受缺血性损伤程度的良好指标。29氧气消耗和胆汁生成是代谢功能的指标。肝酶（如AST）的水平可用于评估肝细胞损伤的程度和动态变化。30这种全面的移植物评估可能有助于可靠地区分可移植与不可移植的边缘器官。
我们在灌注系统中选择了33 °C的亚常温温度，因为该温度足以支持代谢以及ATP和糖原的合成。同时，与常温灌注条件相比，它降低了氧需求，从而额外提供了对抗缺血性损伤的安全性。总体而言，高于30 °C的灌注温度已被证明可最大程度减少冷缺血损伤，并维持足够的代谢活性31。
与其他研究组不同，我们未使用全血作为灌注液，而是采用一种等渗白蛋白溶液（Steen）并添加经洗涤和过滤的红细胞。通过去除血浆成分以及血小板和白细胞，该灌注液旨在最大限度减少灌注过程中的促炎信号 离体 灌注
除了移植物评估外，数小时内的稳定灌注条件还允许对移植物进行处理。许多分子在实验条件下已被证明可减轻再灌注损伤。32然而，迄今为止，几乎没有任何治疗方案进入临床实践。其中一个原因似乎是在冷保存期间缺乏应用这些治疗方法的机会。一种代谢活跃的肝脏在体外灌注系统上 离体 灌注系统适用于施加各种治疗措施。在这方面，不仅可实施改善再灌注条件的治疗，如抑制库普弗细胞活性或清除活性氧物质，还可实施基因治疗等用于预处理移植物的治疗措施， 例如，以对抗丙型肝炎的复发。其他潜在策略可能包括在脂肪变性期间进行减脂 离体 灌注期33.
总之， 离体 肝脏灌注是一种在肝移植前减轻冷缺血损伤并评估边缘性肝移植物的新型策略。 离体 灌注设置为移植前修复和预处理移植物提供了独特的机会。

对于终末期肝病或晚期肝细胞癌患者，肝移植是唯一的治疗选择。在过去25年中，等待移植的患者数量逐渐增加，已超过可用供体器官的数量。过去十年来，心脏跳动的供体数量有所减少。与此同时，边缘性供体器官的数量不断增加，例如心脏死亡后捐献（DCD）以及老化和脂肪变性的肝脏1,2。
边缘性供肝常因原发性移植肝无功能或功能延迟发生率较高而被弃用。在心脏死亡捐献（DCD）供肝中，缺血性胆道狭窄（ITBS）的发生尤为令人关注。采用传统的静态冷保存技术时，约有10%-40%的DCD供肝会发生ITBS。在大多数患者中，ITBS将导致再次肝移植或患者死亡。尤其是较长的热缺血时间和冷缺血时间被认为是ITBS的重要危险因素3-7。供体年龄、遗传易感性（如CCR5 delta 32）、以及保存液的选择也被讨论为其他潜在的危险因素7-10。部分学者提出，肝移植后DCD供肝发生ITBS的可能机制为胆管周围血管的部分微血栓形成11。
在肝脏移植临床应用之前 离体 肝脏灌注已被用于研究肝脏代谢与生理学12,1320世纪60年代肝移植进入临床应用后，人们已进行了无数次尝试以利用该技术 离体 通过模拟生理条件下的营养和氧合状态，将肝脏灌注作为一种器官保存方法。过去十年中，其在边缘性供肝保存中的应用价值已得到研究，但尚未成为临床常规。我们近期报道了在心脏死亡后捐献（DCD）肝移植中，采用该方法可减轻胆管损伤 离体 灌注保存14采用了不同的灌注液方案。选择范围包括细胞类溶液，如供体动物的全血或浓缩红细胞联合人血浆，以及无细胞溶液，如机器用威斯康星大学溶液（University of Wisconsin solution）、IGL溶液或Steen溶液。14-19.
温度范围为 4-37 °C20。低温、亚常温和常温的术语使用差异较大，缺乏一致性。所有不同的技术、灌注液和温度设置均旨在实现以下目标：1）维持稳定的灌注条件，2）保证充分的氧合，3）恢复器官功能。与低温灌注相比，常温和亚常温灌注虽然具备更强的器官保存能力，以及在灌注过程中对器官进行评估和治疗的优势，但其技术复杂性和成本也更高20,21。
我们已开发出一种亚常温 离体 4年来肝脏灌注系统的应用。该系统可用于：1）补充肝脏能量储备，2）评估移植物质量，以及3）在移植前修复边缘性肝脏。以下方案包含了实现稳定肝脏灌注所需的全部信息。

<table><tbody><tr><td>回路</td><td>Maquet（Hirrlingen，GER）</td><td>定制</td><td>主储液罐（3 L，3/8&quot; 流出&lt;br /&gt;
门静脉储液器（1.5 L，1/4）&quot;，流出&lt;br /&gt;
离心泵&lt;br /&gt;
氧合器&lt;br /&gt;
白细胞过滤器&lt;br /&gt;</td></tr><tr><td>管路（1/4&quot; x 1/16&quot;)</td><td>Raumedic（Helmbrechts，GER）</td><td>MED7506</td><td></td></tr><tr><td>管路（3/8&quot; x 3/32&quot;)</td><td>Raumedic（Helmbrechts，GER）</td><td>MED7536</td><td></td></tr><tr><td>管路连接器</td><td>Raumedic（Helmbrechts，GER）</td><td></td><td>不同规格</td></tr><tr><td>透析滤器，Optiflux F160NR</td><td>Fresenius Medical Care (Waltham, MA)</td><td>F160NR</td><td></td></tr><tr><td>斯蒂恩溶液</td><td>XVIVO (G&amp;ouml;哥德堡，瑞典</td><td>19004</td><td>2 L</td></tr><tr><td>透析用酸性浓缩液 A</td><td>Baxter（密西沙加，安大略省）</td><td>D12188M</td><td>45 ml</td></tr><tr><td>氨基酸，Travasol 10%</td><td>Baxter（密西沙加，安大略省）</td><td>JB6760</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）</td><td>P2256</td><td>1.1 g</td></tr><tr><td>肝素</td><td>Sandoz Canada Inc (Toronto, ON)</td><td>10750</td><td>40,000 iU</td></tr><tr><td>葡萄糖酸钙</td><td>加拿大制药合作伙伴公司（安大略省，列治文山）</td><td>C31110</td><td>10 mg</td></tr><tr><td>速效胰岛素</td><td>不同供应商</td><td></td><td>1,000 iU</td></tr><tr><td>头孢唑啉</td><td>多个供应商</td><td></td><td>1 g</td></tr><tr><td>甲硝唑</td><td>Baxter（密西沙加，安大略省）</td><td>JB3401</td><td>500 mg</td></tr></tbody></table>

亚常温技术 离体 用于边缘性肝移植物保存、评估与修复的肝脏灌注技术

Technique of Subnormothermic Ex Vivo Liver Perfusion for the Storage, Assessment, and Repair of Marginal Liver Grafts

肝移植的成功导致了器官严重短缺。在大多数移植地区，等待肝移植的患者中有20%-30%在未获得器官移植前死亡，或因病情进展而被移出等待名单。扩大供体池的一种策略是利用边缘性移植物，例如脂肪肝、老年供体的移植物，或心脏死亡后捐献（DCD）的器官。目前常用的冷静态保存技术对边缘性肝脏的耐受性较差，会导致显著的器官损伤。此外，冷静态器官保存无法在移植前对移植物进行评估或修复。
低温静态保存的这些缺陷促使人们关注常温灌注器官保存技术，以减少冷缺血损伤，在保存期间评估肝脏移植物，并探索在移植前修复边缘性肝脏的可能性。过去，关于最佳灌注压力和流量条件、灌注温度、灌注液成分以及是否需要氧载体等问题一直存在争议。
尽管在多项动物研究中取得了有前景的结果，但其复杂性和高昂的成本迄今仍限制了更广泛的临床应用。近年来，随着技术的进步以及对肝脏生理学在 离体 灌注 温血肝脏灌注的效果已得到改善，且能够持续获得良好的结果。
本文将介绍猪肝脏的获取、保存技术以及离体肝脏灌注的相关信息。我们将阐述 a) 确保器官获得充足氧气供应所需满足的条件，b) 灌注设备和灌注液的技术要点，以及 c) 离体器官的生物化学特性。

以下展示了在开始亚常温灌注前，经历45分钟热缺血和4小时冷缺血的DCD供体移植物的5次灌注实验结果 离体 灌注
一个主要目标是 离体 肝脏灌注的目的是确保器官获得充足的氧气供应。缺血会引起血管收缩，从而增加灌注阻力。在稳定压力下实现恒定的血管流量是氧合充分的良好指标。在1-2小时的诱导期内，灌注液和器官被逐渐升温至 33 °C，从而降低肝脏的血管阻力。一旦达到目标温度 33 °C 达到后，在剩余的6小时灌注时间内，流速值保持在接近生理范围的恒定水平（图3A-3D).
与此同时，器官的代谢活动增强。 图 4A 显示静脉血氧分压 pO₂2，一种氧气消耗的标志物。在最初的2小时内，静脉血氧分压（pO₂）2 下降至一个稳定的平台期。在此代谢活跃状态下，肝脏开始产生胆汁（图4B）。透析器可维持电解质稳态平衡（图4C-4D）。初始的高钾血症会迅速得到纠正。在线AST测定用于监测肝细胞损伤。 图5 在整个灌注期间仅表现出轻微的线性AST升高。H&amp;灌注6小时后的伊红染色显示肝细胞坏死 &lt;5% 且小叶和窦状隙结构完整（图6）。同一时间点的PAS染色显示，与冷保存的DCD移植物中耗竭的糖原储存相比，细胞糖原储存已得到补充图7).
<img alt="四幅图表显示随时间变化的肝动脉（HA）和门静脉（PV）血流与压力变化。" src="/files/ftp_upload/51419/51419fig3highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 灌注血流与压力（n = 5，误差条表示标准差）。(A,B) 肝动脉（HA）血流与压力：在复温阶段的前1-2小时内，血流在压力稳定的情况下增加，之后保持恒定。观察门静脉压力逐渐降低(C)，灌注末期HA血流的升高可能是肝脏的自身调节反应。(C,D) 门静脉（PV）血流在复温开始的前2小时内随HA血流相应增加，压力则保持相对稳定。
<img alt="显示静脉血氧分压、胆汁流量、钠和钾水平变化的时间过程线图。" src="/files/ftp_upload/51419/51419fig4highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. 监测参数（n = 5，误差条表示标准差）。(A) 静脉血氧分压（pO2）作为氧需求和代谢活性的指标，在复温初期由于细胞代谢被激活而下降；随后保持稳定。(B) 胆汁生成作为代谢活性的指标，起始于约 30 °C 的温度，因此出现在灌注的第 1 至第 2 小时之间。(C,D) 透析器可维持电解质稳态；初始的高钾血症迅速得到纠正。
<img alt="AST level vs. time graph, enzyme activity analysis with trend over 6 hours." src="/files/ftp_upload/51419/51419fig5highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 5"> 
图5. AST（n = 5，误差条表示标准差）。 AST 是肝细胞损伤的敏感标志物；轻度升高提示在此期间无明显损伤 离体 灌注
<img alt="肝组织病理学比较，显微镜图像，分析细胞结构差异。" src="/files/ftp_upload/51419/51419fig6highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图6"> 
图6. H&amp;E染色（20倍放大）。（A） 热缺血前的假手术肝脏样本，一个具有完整结构的代表性肝小叶。（B） 经45分钟热缺血、4小时冷缺血及6小时亚常温灌注后的肝脏样本，肝小叶结构完整，无坏死，仅见轻微细胞肿胀，与假手术样本相比，窦状隙轻度扩张。

边缘性移植物，例如脂肪肝、来自高龄供体的移植物，或心脏死亡后获取的肝脏（DCD），对传统的冷静态保存耐受性较差。我们开发了一种新型的亚常温 离体 用于移植前对边缘性肝移植物进行保存、评估和修复的肝脏灌注

肝移植的成功导致了器官严重短缺。在大多数移植地区，等待名单上的患者中有20-30%

该操作的目的是在接近生理条件下保存和评估肝脏移植物。首先从供体猪体内获取肝脏移植物，随后对肝脏进行插管，并将移植物连接至离体灌注回路，从而实现上述目标。在最后一步中，监测灌注特性和肝脏移植物特征，直至达到所需的灌注时间。最终，通过检测天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平以及对实质组织活检进行组织学分析，以评估肝脏移植物的损伤程度和活性保存情况。与现有的保存方法（如静态冷保存）相比，该技术的主要优势在于，在生理条件下进行保存可减少保存相关损伤，并可在实际器官移植前对移植物进行功能评估和干预治疗。通过静脉注射氯化钾诱导心脏死亡后，立即从一头30至35千克重的雄性约克夏猪体内采集1.6升血液至CPDA血袋中，关闭腹腔，将肝脏保留在腹腔内45分钟，以诱导热缺血损伤。在热缺血结束前立即进行血管插管，分别在主动脉和门静脉接入器官灌注管路。采用双通路灌注法，通过主动脉加压和门静脉重力驱动的灌注袋，用威斯康星大学溶液（University of Wisconsin solution）对肝脏进行灌洗。然后将猪的肝脏切除，保留所有剩余血管的长度，并将其放入器官袋中。使用½英寸转⅜英寸带螺口接头的变径管，对下腔静脉的肝上段和肝下段进行插管。使用⅜英寸转¼英寸以及¼英寸转⅜英寸的变径管，对门静脉和肝动脉进行插管。此时也需使用诱饵锁进行减量。然后封好袋子，将肝脏置于冰上保存，直至灌注。为建立离体灌注回路，将主储液器的流出端连接至离心泵，并将商用氧合器接在氧合器之后。将管路分为两条。将其中一条连接至透析器，使其回流至主储液罐。将另一条连接至白细胞过滤器。在白细胞过滤器后将管路分为动脉支路和门静脉支路：动脉支路用于向肝动脉灌注灌注液八，门静脉支路用于将灌注液八输送至第二个储液器，该储液器通过重力引流至门静脉。夹闭门静脉入口，然后将动脉支路连接至引流至主储液器的下腔静脉回路。为实现液体回收，将循环系统和水浴的初始温度设置为20摄氏度。然后用不透水膜覆盖灌注浴，以收集腹水或灌注液的渗漏。将由滚压泵驱动的吸液管连接至主储液罐。随后松开主储液罐的流出夹，用灌注液充满整个管路系统。将离心泵启动至每分钟 1,500 转，确保管路中的所有空气被完全排出。然后开启氧合器的气体供应。将肝脏连接至管路是该操作中最困难的部分。注意避免管道弯曲，并清除所有气泡，以防止阻碍肝脏流出。还必须密切观察门静脉储液罐的液位，切勿使其排空。将肝脏从冰上取出，用生理盐水冲洗出威斯康星大学溶液。然后将肝脏放置在水浴上方的膜上。将离心泵的速度降低至每分钟1000转，并在下腔静脉回路的动脉侧放置两个夹子。然后在夹子之间剪断管路，将两条下腔静脉流出管连接到下腔静脉管线上。松开动脉管路上的夹子。将灌注液八倒入动脉插管以排出气泡，然后将管路连接至插管。将离心泵转速提高至每分钟 1,500 转，松开静脉灌注管路上的第二个夹子，同时松开门静脉储液器上的夹子以使其充满灌注液。让灌注液流入门静脉插管，然后将其连接。注意保持门静脉储液器中的液面稳定。将肝脏连接到循环系统后，在接下来的60分钟内将水浴温度升至33摄氏度。起始动脉流速应约为250毫升/分钟，压力为40毫米汞柱。灌注期间，流速可能达到700毫升/分钟。当压力升高至70毫米汞柱时，应使门静脉血流在3至5毫米汞柱下达到每分钟500至600毫升。升高温度后，门静脉血流量将增加至每分钟1,100毫升。降低主储液器以将流出压力设定为负2毫米汞柱，以防止因功能性流出道梗阻导致肝脏充血，并确保腔静脉管路中无气泡滞留。将透析八号流速设置为每小时500毫升。注意调节透析液流出量，使八号灌注液既不被稀释也不被浓缩。在灌注开始阶段维持较低的pH值，以保护器官。持续降低二氧化碳分压至25至30毫米汞柱，使pH值在一小时内达到生理水平。为模拟生理条件，持续向门静脉注射葡萄糖和胰岛素。在重复进行血气和电解质监测的条件下，小心地向循环系统中注射碳酸氢钠或碳酸氢钾，并通过定期的静脉和动脉血气分析及ST分析监测灌注情况。监测血管血流和压力。稳定的灌注将在离体灌注期结束时维持恒定的血管阻力。关闭灌注系统，然后在将管道从肝脏上断开后，使用冰冻的威斯康星大学溶液双路冲洗 PERFUSE 液体，将其从肝脏中彻底冲洗出来。最后将肝脏置于无菌器官袋中并冰上保存，以待移植。维持稳定的血管流量和压力是氧合充分的良好指标。当达到33摄氏度的目标温度后，在灌注期的剩余时间内，流量值稳定在一个接近生理范围的恒定水平，同时器官开始呈现代谢活性。该图显示了静脉血氧分压，这是反映氧气消耗的指标。在最初的两小时内，静脉血氧分压下降至一个稳定的平台期。在此代谢活跃状态下，肝脏开始产生胆汁，透析器则维持电解质稳态平衡。在线AST检测可作为肝细胞损伤的监测指标。例如，在本实验中，整个灌注期间仅观察到AST轻微升高。灌注六小时后进行H&E染色，显示肝细胞坏死率低于5%，且肝小叶结构和窦状隙结构保持完整。在同一时间点，离体灌注肝脏的BAS染色显示细胞糖原储存得到重新补充，而冷保存的心脏死亡供体移植物则表现出糖原储存耗竭。通过该操作，可进行肝脏移植等器官再灌注模型实验，以研究离体肝脏灌注对再灌注损伤及器官功能的影响。

technique-subnormothermic-ex-vivo-liver-perfusion-for-storage

Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

Subnormothermic的技术<em&gt;前体内</em&gt;肝脏灌注的存储，评估和修复边际移植肝

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