Name: 重组β-catenin的降解爪蟾卵提取物 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-17T20:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: 了解利用爪蟾卵提取物无细胞生化系统分析β-catenin蛋白降解的方法。该技术通过放射性标记或荧光素酶融合蛋白追踪降解速率，帮助研究人员识别调控信号蛋白稳定性的关键因子。

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感谢Laurie Lee对本文手稿的审阅。T.W.C. 由美国心脏协会博士前奖学金（12PRE6590007）资助。M.R.B. 由美国国家癌症研究所培训基金（T32 CA119925）资助。S.S.H. 由美国国立卫生研究院资助（R01DK078640）。E.L. 由美国国立卫生研究院资助（R01GM081635 和 R01GM103926）。

1. 制备Xenopus&#160;卵提取物
注意：每只青蛙可获得约 1 ml&#160;可用的卵提取物。通常一次制备 10 只青蛙的提取物，下述缓冲液体积适用于 10 只青蛙的 Xenopus 卵提取物制备。根据卵提取物制备规模的大小，可相应调整缓冲液的体积。采用此方法制备的提取物，蛋白质浓度 consistently 可达 ≥ 50 mg/ml。收集卵并将其加工成提取物的过程由两人协作完成效率最高。（有关基本的青蛙饲养技术，请参见 Sive&#160;et al.33）。
<ol>
	<li>卵的收集
	<ol>
		<li>为诱导青蛙排卵，从新配制的250 U/ml浓度的孕马血清促性腺激素（PMSG）中抽取100 U，注射至每只雌性青蛙体内&#160;储备液。使用 3 ml&#160;27 G结核菌素注射器&#160;用针头进行皮下注射，针尖斜面向上，插入蛙腿部沿长度方向距中线约1厘米处的背侧淋巴囊，该部位可见凹陷状的色素沉着区域。</li>
		<li>将已处理的青蛙置于含20 mM NaCl的水中保存（见&#160;Sive&#160;等33在18 °C下放置5-10天。对于静水养殖系统，每只雌性青蛙约需4 L水。注意：诱导处理至少需要5天才能生效，且其效果在10天后逐渐消失。</li>
		<li>从20倍浓缩的Marc’s改良Ringer液（20x MMR）制备0.5倍浓度的MMR溶液。20x MMR溶液包含2 M氯化钠、40 mM氯化钾、40 mM氯化钙、20 mM氯化镁以及100 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES），pH值调至7.4。</li>
		<li>为所有注射过的青蛙准备水桶（每只青蛙使用一个4升的水桶）。注意：尽管可在同一水桶中放置多只青蛙以收集卵，但如果其中一只青蛙主要产出质量较差的卵，则需要耗费大量精力将低质量卵与适合制备提取物的卵分离开来。因此，为减少卵收集过程中缓冲液的使用量而增加同一水桶中青蛙的数量，并不值得冒此风险。</li>
		<li>使用27 G针头，按照1.1.1节所述方法，向每只青蛙的背淋巴囊注射750 U人绒毛膜促性腺激素（HCG）。</li>
		<li>将每只注射了HCG的青蛙分别放入盛有0.5x MMR溶液的4 L桶中，溶液预先冷却至16 °C。</li>
		<li>将装有青蛙的容器置于16 °C培养箱中过夜（15–16小时）以收集卵。注意：从收集卵到制备卵提取物的整个过程，保持适当的温度至关重要。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>去除卵膜 
	注意：卵子表面覆盖有一层胶状膜，必须在制备提取物前将其去除。卵子产出后，从产卵到提取物制备之间的时间越长，卵子发生自发裂解的可能性越高。因此，应尽快完成以下各步骤。
	<ol>
		<li>制备 4 L 的 1× MMR，50 ml&#160;0.1x MMR 的溶液，以及 400 ml&#160;含2%半胱氨酸、pH 7.7的蒸馏水溶液。所有溶液均保存于16 °C。</li>
		<li>轻轻挤压青蛙的下背部和腹部，以排出更多的卵。</li>
		<li>将青蛙和大部分MMR移除，使每个桶中剩余约1-200 ml的MMR覆盖卵。</li>
		<li>用移液管去除杂质，并评估卵子质量：高质量的卵子通常表现为深色色素分布的动物半球与浅色的植物半球之间界限清晰，且明暗对比度最高。使用移液管弃去呈现丝状、斑驳或裂解（白色且蓬松）的卵子，因其会降低提取物的整体质量。如果 &#62;若10%的卵子质量较差，则应丢弃整批。</li>
		<li>将卵子放入500 ml玻璃烧杯中，并尽可能倒出MMR，同时保持卵子始终浸没。</li>
		<li>用两倍于卵体积的MMR轻柔地旋涡冲洗卵，重复两次，并去除任何碎屑或明显质量差的卵。</li>
		<li>向玻璃烧杯中加入约 100 ml 的 2% 半胱氨酸溶液，轻轻旋转混匀，静置 5 分钟使虫卵沉降&#160;在16 °C下。倒掉半胱氨酸。注意：去胶过程的标志是卵周围的胶状层逐渐浮起，以及卵因失去胶状层而体积缩小、排列更加紧密。</li>
		<li>加入另外100 ml 2%半胱氨酸溶液，轻轻摇晃，静置5分钟，然后缓慢倒出半胱氨酸溶液。重复此步骤，直至卵子紧密聚集（通常在第三次半胱氨酸处理后即可达到）。注意：若卵子在半胱氨酸溶液中停留时间过长，易发生裂解。同样，去胶卵子较为脆弱，若摇晃过于剧烈或暴露于空气中，易发生机械性裂解。一旦完成去胶处理，应迅速进行离心步骤。</li>
		<li>倒掉半胱氨酸溶液，用1×MMR缓冲液轻轻冲洗卵子以去除胶状包膜和其他碎片。沿烧杯壁小心倒出缓冲液。重复两次。&#160;或直至 MMR 溶液不再浑浊。在用 1x MMR 清洗的同时，继续使用移液器去除坏卵。</li>
		<li>用30 ml 0.1x MMR进行最后一次轻柔冲洗，并尽可能将缓冲液倒净。再次去除任何明显异常的卵。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过离心法包装与破碎卵子 
	注意：下文所述用于β-catenin降解的提取物是细胞静止因子提取物（减数分裂II中期阻滞）的一种变体。与用于细胞周期研究的低速和高速提取物不同，中速提取物在β-catenin降解中效果最佳。间期提取物同样可有效促进β-catenin降解，但制备过程更为耗时。
	<ol>
		<li>将亮抑酶肽、抑肽酶、抑胃酶肽混合物（LPA，一种蛋白酶抑制剂）以10 µg/ml（用DMSO中10 mg/ml的母液稀释）和细胞松弛素D以20 µg/ml（用DMSO中10 mg/ml的母液稀释）加入剩余的20 ml 0.1x MMR溶液中。</li>
		<li>加入0.&#160;向洗涤后的卵中加入含LPA和细胞松弛素D的x MMR，轻轻摇动，于室温孵育5分钟&#160;在 16 °C 下。</li>
		<li>将卵转移至预冷至16 °C的50 ml离心管中，静置使卵沉降，并移除管顶部的残余缓冲液。为防止卵暴露于空气中，在用移液器吸取卵进行转移前，先吸入少量缓冲液至移液器中。继续将额外的卵转移至离心管，并移除管顶部的残余缓冲液，直至卵充满离心管顶部，以最大化提取物的产量。</li>
		<li>为收集卵子，将离心管在400 × g下离心60秒&#160;在4 °C下使用固定角转子离心。移除离心管顶部残留的缓冲液。</li>
		<li>对于破碎步骤，将离心管在15,000 x g条件下离心5分钟&#160;在 4 °C 下。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>收集提取物的细胞质层 
	注意：下述方法与通过刺穿离心管侧面以收集细胞质层的经典方法不同。本方案已针对操作简化及特定可重复使用离心管的适配性进行了调整。两种方法在β-catenin降解动力学方面未观察到明显差异。在此阶段，提取物在整个过程中应保持低温，所有步骤均需在4 °C下进行。
	<ol>
		<li>使用 P1000 移液器在脂质层中清理出一个孔洞&#160;尖端</li>
		<li>使用新的P1000移液器吸头收集细胞质层（位于深色色素层与浅色脂质层之间）&#160;转移到洁净的预冷离心管中（图1）。为了获得能有效降解β-catenin的高质量提取物，应尽量减少与胞质层一同吸出的色素层和脂质层的量。</li>
		<li>15,000 × g 离心10分钟以分离提取的细胞质层&#160;在 4 °C 下再次收集细胞质层。重复离心和提取 1 次。注意：提取物应 &#34;淡黄色&#34; 如果此时色素层和脂质层存在严重污染，可再重复离心一次，但过度离心会降低提取物降解β-catenin的能力。</li>
		<li>向提取物中加入LPA和细胞松弛素D，使其终浓度均为10 µg/ml。注意：采用所述方法可获得相对一致的总蛋白浓度，约为50 mg/ml（52.41 ± 5.40 mg/ml，n=3次独立制备） 非洲爪蟾 卵提取物。</li>
		<li>（可选）对于翻译实验，加入加帽mRNA（0.1 mg/ml）、RNAsin（1.5 U/ml）和能量再生混合液（2.2.1），在室温下孵育反应体系2小时（更多信息参见Salic&#160;等2 和 Sive&#160;等33）。立即使用翻译提取物进行β-catenin降解实验，或在液氮中速冻以备后续使用。注意：新鲜制备的提取物具有高效翻译外源添加mRNA的能力，但不幸的是，一旦提取物被冷冻，该能力即会丧失。加帽mRNA可使用市售试剂盒轻松制备。</li>
		<li>在液氮中快速冷冻提取物。注意：提取物应分装为小份（200 µl）用于单次使用，因为反复冻融会迅速丧失降解β-catenin的能力。长期保存时，可将提取物储存于液氮中；短期保存可置于-80 °C，但在-80 °C下长期储存（超过2个月）会显著降低提取物降解β-catenin的能力。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 准备β-catenin降解实验的提取物
<ol>
	<li>耗竭自 非洲爪蟾&#160;提取 
	注意：一个主要优势是 非洲爪蟾 提取物的优势在于能够便捷地耗竭通路中的特定组分，并精确回补特定量的蛋白质，以确定其剂量依赖性效应。
	<ol>
		<li>使用新鲜配制的 非洲爪蟾 卵母细胞提取物或快速解冻冷冻的提取物，并置于冰上。所有操作均需在低温下进行。</li>
		<li>将提取物加入到与抗体沉淀或亲和磁珠体积的1/10相等的体积中（例如，将20 ml压紧的珠子加入200 ml提取物中）。为尽量减少提取物的稀释，在加入提取物之前，使用带有长锥形尖端的凝胶加样吸头尽可能吸除珠子中的液体。</li>
		<li>4 °C下旋转孵育提取物-磁珠混合液1小时。</li>
		<li>在4 °C下，以12,600 x g离心微离心机中的提取液-珠混合物30秒。或者，若使用磁珠，则施加磁场以收集珠子。</li>
		<li>将耗尽的提取物转移至预冷的新微量离心管中，注意勿将珠粒随提取物一同转移。</li>
		<li>通过免疫印迹检测耗竭后的提取物和珠子，以确认耗竭效率。</li>
		<li>按照2.2节所述制备用于β-catenin降解实验的提取物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>优化 非洲爪蟾&#160;β-catenin 降解提取 
	注意：β-catenin 降解在 非洲爪蟾 卵提取物中的过程是依赖能量的，会迅速耗尽内源性ATP储备。因此，需要能量再生系统以维持高效的β-catenin降解。
	<ol>
		<li>配制20倍能量再生（ER）混合液，包含150 mM磷酸肌酸、20 mM ATP、600 µg/ml肌酸磷酸激酶和20 mM MgCl₂2ER 应分装后于 -80 °C 保存。为避免反复冻融，请使用小份冷冻分装样品。</li>
		<li>快速解冻 非洲爪蟾 通过用手揉搓冷冻管来融化卵提取物。在提取物完全融化之前，立即将管子置于冰上。</li>
		<li>加入10 µl&#160;能量再生混合液（20x ER）加入至一份（200 μl）样品中 非洲爪蟾 卵提取物。通过快速弹击管壁并瞬时涡旋混合均匀。瞬时离心后立即置于冰上。</li>
		<li>（可选）β-catenin 的降解可被轻微增强 非洲爪蟾 通过添加泛素（终浓度 1.25 mg/ml）制备卵提取物。也可加入环己酰亚胺（终浓度 0.1 mg/ml），以减少内源性转录本的翻译。</li>
		<li>将降解实验所需的适当体积分装至预冷的微量离心管中，置于冰上。对于放射性标记的 β-catenin 降解实验，每个时间点需吸取 2–5 ml 提取物。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 在爪蟾卵提取物中进行放射性标记的β-catenin降解实验
注意：除非另有说明，所有步骤均需在冰上进行。
<ol>
	<li>制备放射性标记的β-catenin
	<ol>
		<li>新鲜配制 体外-合成的 [35S]甲硫氨酸放射性标记蛋白，使用市售试剂盒。注意：生成 35S标记（半衰期87天）的蛋白质可利用市售试剂高效且简便地制备 体外-偶联转录-翻译试剂盒。重要的是，翻译出的蛋白质必须带有足够的标记，以便能够清晰地观察蛋白质转换的变化。</li>
		<li>为确认放射性标记成功，使用0.5 µl进行SDS-PAGE/放射自显影&#160;翻译蛋白的放射性条带强度，使用 ImageJ、ImageQuant 或其他定量软件进行定量分析。注意：放射性标记的 β-catenin 蛋白条带应在数小时内（4–6 小时）在胶片上清晰可见。</li>
		<li>将放射性标记的蛋白质在液氮中速冻，保存至使用。注意：长期保存（&#62;2 个月）以及多次冻融（超过 2 次）会严重影响放射性标记的 β-catenin 稳健降解的能力 非洲爪蟾 卵提取物。通常，放射性标记蛋白的稳定性在1小时后会显著下降&#160;在-80 °C储存一个月后；因此，在这些降解实验中，相对新鲜制备的放射性标记β-catenin可获得最佳结果。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行β-catenin降解实验
	<ol>
		<li>加入 1-3 µl&#160;（根据放射性标记条带信号的强弱） 体外-将翻译的β-catenin（及其他被测试的蛋白质、小分子等）转入20 µl&#160;的 非洲爪蟾 将反应混合物置于冰上。通过快速弹击离心管并短暂涡旋振荡充分混匀；此步骤至关重要，因为 非洲爪蟾 卵提取物非常黏稠，混合不充分会影响结果的一致性。脉冲离心后置于冰上。</li>
		<li>通过将试管转移至室温（RT）来启动β-catenin降解反应。</li>
		<li>在指定时间点，取出1–5 ml样品，立即与5倍体积的SDS上样缓冲液混合以终止反应。为确保降解反应完全终止，轻轻弹击离心管数次，并剧烈涡旋振荡。</li>
		<li>进行SDS-PAGE/放射自显影。上样1 ml&#160;每个时间点/泳道加入等量提取物（约50 mg蛋白）。β-catenin的降解在 非洲爪蟾 放射性标记的β-catenin条带强度应随时间推移而减弱，以此证明卵提取物的作用 图2必要时使用 ImageJ、ImageQuant 或其他首选成像软件对结果进行定量分析。</li>
		<li>（可选）在干燥前将SDS-聚丙烯酰胺凝胶浸泡于固定液（含10%乙酸和30%甲醇的蒸馏水溶液）中，以降低背景放射性并提高成像质量。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 爪蟾卵提取物中β-catenin-荧光素酶降解实验
除非另有说明，所有步骤均需在冰上进行。
<ol>
	<li>制备β-catenin-荧光素酶
	<ol>
		<li>使用转录-翻译偶联系统和完全氨基酸混合物合成非放射性标记的荧光素酶标记β-catenin。</li>
		<li>通过测量0.5–1 µl样品中的荧光素酶活性，确认荧光素酶标记的β-catenin的表达&#160;反应的背景发光，可通过测量未翻译反应混合物的发光值来评估。注：目前有多种商业试剂盒可用于检测荧光素酶活性，但长时发光信号特别适用于降解实验。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行β-catenin-荧光素酶降解实验
	<ol>
		<li>解冻与准备 非洲爪蟾 2.2 节所述的卵提取物</li>
		<li>添加 体外-将翻译后的β-catenin-luciferase融合蛋白（来自4.1）转入已制备的 非洲爪蟾 将来自步骤2.2的反应混合物置于冰上，并按照3.2.1中的方法充分混匀。注意：加入提取物中的β-catenin荧光素酶活性通常为每毫升提取物20 - 50,000相对发光单位（RLU/mL）（依据4.1.2中测得的结果）。起始信号应约为100,000 RLU（2-5 mL的 体外- 转化后的β-catenin-luciferase融合蛋白</li>
		<li>将提取物转移至室温 以启动降解反应。</li>
		<li>在指定时间点取出反应液等分试样，立即在液氮中速冻。注意：每个时间点通常需取三个重复样品用于分析。冷冻提取物可于 -80 °C 保存。 直到准备进行分析为止。</li>
		<li>将样本在冰上解冻，转移至预冷的白色标准96孔板中，并进行荧光素酶活性检测。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Trinkle-Mulcahy, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+specific+protein+interaction+partners+using+quantitative+mass+spectrometry+and+bead+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes.</a> J Cell Biol. 183, 223-239 (2008).</li>
<li>Tan, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signalling+pathway+parameters+for+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Wnt signalling pathway parameters for mammalian cells.</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

Xenopus 卵提取物是研究 β-catenin 降解的强有力生化体系。Xenopus 卵提取物中 β-catenin 的浓度约为 25 nM&#160;2。在最佳条件下，该卵提取物降解 β-catenin 的速率为 50–100 nM/hr，其半最大降解速率出现在 200 nM24。利用 Xenopus 卵提取物成功重建 β-catenin 降解过程涉及多个关键步骤，包括：1）制备高质量的 Xenopus 卵提取物以及提取物的制备方式；2）制备高质量的放射性标记 β-catenin 和 β-catenin-荧光素酶蛋白；3）优化反应条件以支持 β-catenin 的降解；4）正确处理反应时间点。
制备高质量的Xenopus卵提取物，使其能够有效降解β-catenin，取决于卵的质量以及在破碎步骤前对卵的处理方式，以及后续通过离心获得最终提取物的操作。如实验方案所述，必须确保仅使用高质量的卵（表现为深色动物极与浅色植物极之间对比清晰），在整个过程中...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/51425">Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract</a>. At the time of publication there were some instances where an incorrect volume notation was used. These instances were corrected from:
2.1.2. Add extract to 1/10 the volume of pelleted antibody or affinity beads (e.g., 20 ml pelleted beads to 200 ml extract). In order to minimize dilution of the extract, withdraw as much liquid from the beads as possible before addition of the extract using gel loading tips with long, tapered tips.
2.2.5. Aliquot the appropriate volumes for degradation assay into pre-chilled microfuge tubes on ice. For radiolabeled &#946;-catenin degradation assays, withdraw 2-5 ml extract for each time point.
3.2.3. At the designated time point, remove 1-5 ml of the sample and mix immediately with SDS sample buffer (5x volume) to stop the reaction. To make sure the degradation reaction is completely terminated, flick tube several times and vortex vigorously.
3.2.4. Perform SDS-PAGE/autoradiography. Run 1 ml equivalents (~50 mg of protein) of the extract for each time point/lane. Degradation of &#946;-catenin in Xenopus egg extract should be evidenced by the time-dependent decrease in intensity of the radiolabeled &#946;-catenin band Figure 2. Quantify results using ImageJ, ImageQuant, or other preferred imaging software if necessary.
4.2.2. Add in vitro-translated &#946;-catenin-luciferase fusion (from 4.1) into prepared Xenopus reaction mix (from 2.2) on ice and mix well as in 3.2.1. NOTE: The activity of the &#946;-catenin luciferase that is added to the extract is typically between 20 - 50,000 relative luminescence units (RLU)/ml of extract (based on measurements obtained from 4.1.2). Starting signal should be approximately 100,000 RLU (2-5 ml of the in vitro-translated &#946;-catenin-luciferase fusion).
to:
2.1.2. Add extract to 1/10 the volume of pelleted antibody or affinity beads (e.g., 20 &#181;l pelleted beads to 200 &#181;l extract). In order to minimize dilution of the extract, withdraw as much liquid from the beads as possible before addition of the extract using gel loading tips with long, tapered tips.
2.2.5. Aliquot the appropriate volumes for degradation assay into pre-chilled microfuge tubes on ice. For radiolabeled &#946;-catenin degradation assays, withdraw 2-5 &#181;l extract for each time point.
3.2.3. At the designated time point, remove 1-5 &#181;l of the sample and mix immediately with SDS sample buffer (5x volume) to stop the reaction. To make sure the degradation reaction is completely terminated, flick tube several times and vortex vigorously.
3.2.4. Perform SDS-PAGE/autoradiography. Run 1 &#181;l equivalents (~50 mg of protein) of the extract for each time point/lane. Degradation of &#946;-catenin in Xenopus egg extract should be evidenced by the time-dependent decrease in intensity of the radiolabeled &#946;-catenin band Figure 2. Quantify results using ImageJ, ImageQuant, or other preferred imaging software if necessary.
4.2.2. Add in vitro-translated &#946;-catenin-luciferase fusion (from 4.1) into prepared Xenopus reaction mix (from 2.2) on ice and mix well as in 3.2.1. NOTE: The activity of the &#946;-catenin luciferase that is added to the extract is typically between 20 - 50,000 relative luminescence units (RLU)/&#181;l of extract (based on measurements obtained from 4.1.2). Starting signal should be approximately 100,000 RLU (2-5 &#181;l of the in vitro-translated &#946;-catenin-luciferase fusion).

Erratum: Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis 卵提取物已被广泛用于研究多种细胞生物学过程，包括细胞骨架动态、核组装与核输入、细胞凋亡、泛素代谢、细胞周期进程、信号转导以及蛋白质 turnover1-17。该 非洲爪蟾 卵母细胞提取物系统适用于对大量细胞过程进行生化分析，因为卵母细胞提取物本质上是未稀释的细胞质，含有执行这些过程所需的所有基本胞质组分，从而支持相关研究。可一次性制备大量卵母细胞提取物，用于需要大量材料的生化操作。例如蛋白质纯化或高通量筛选18-20另一个优点是，特定蛋白质的浓度在 非洲爪蟾 通过添加重组蛋白和/或对内源性蛋白进行免疫耗竭，可精确调控卵提取物中的蛋白水平，而转染质粒DNA时，目标蛋白的表达水平则难以控制。此外，可通过添加编码目标蛋白的转录本以弥补重组蛋白的缺乏，从而利用新鲜制备的 非洲爪蟾 卵提取物高效翻译外源添加mRNA的能力
蛋白质降解的调控对于控制许多细胞通路和过程至关重要21。Xenopus 卵提取物已被广泛用于研究蛋白质降解，因为该系统允许以多种方式监测蛋白质转换，同时避免转录和翻译的干扰影响。Wnt 信号通路是一条高度保守的信号通路，在发育和疾病中发挥关键作用。作为 Wnt 通路主要效应分子的 β-catenin，其转换受到高度调控，而 β-catenin 稳态水平的升高对于 Wnt 靶基因的激活至关重要。β-catenin 降解的重要性体现在：在约 90% 的散发性结直肠癌病例中，均发现 Wnt 通路中抑制 β-catenin 降解的突变22。Wnt 通路组分介导的 β-catenin 降解可在 Xenopus 卵提取物中被真实重现，从而用于研究其转换机制，并鉴定调控其降解的新型小分子调节剂2,19,20,23-29。
制备方法 非洲爪蟾 用于研究细胞周期的卵提取物已在先前文献中有所描述 乔维 出版物30-32. 本方案描述了这些方法的一种改进，且已优化用于降解[35S]-放射性标记的β-catenin和荧光素酶标记的β-catenin在 非洲爪蟾 卵提取物。放射性标记降解实验可通过放射自显影直接观察蛋白质水平。[35S]甲硫氨酸通过使用一种 体外 翻译反应可直接加入降解反应体系中。此外，放射性标记的蛋白质转换实验无需针对目标蛋白的特异性抗体或表位标签，从而避免了这些元件可能对蛋白质稳定性造成的影响。由于放射性标记蛋白条带强度的变化能够灵敏地反映蛋白质水平的微小改变，因此通过放射自显影即可清晰观察到这些变化，[35S标记的降解实验是用于可视化蛋白质 turnover 的一种非常有用的方法2.
将β-catenin与萤火虫荧光素酶（下文简称为&#34;luciferase&#34;）融合，可实现对蛋白水平的精确且简便的定量检测，从而确定β-catenin降解的动力学特性19,20。荧光素酶检测的主要优势在于其提供了一个高度定量的系统，且易于扩大规模。以下方案提供了检测β-catenin降解的简便方法，以及一种稳健、高效且适用于高通量筛选新型β-catenin调节剂的方法。

<table><tbody><tr><td>孕马血清促性腺激素（PMSG）</td><td>ProSpec</td><td>hor-272-A</td><td>使用前用蒸馏水重悬。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>人绒毛膜促性腺激素</td><td>Sigma</td><td>CG10-10VL</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Fisher</td><td>BP366-1</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Research Products International</td><td>S23020-5000.0</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Fisher</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Acros Organics</td><td>AC42352-5000</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-1</td><td></td></tr><tr><td>半胱氨酸</td><td>Acros Organics</td><td>AC17360-1000</td><td></td></tr><tr><td>亮抑酶肽</td><td>Sigma</td><td>L2884-10MG</td><td></td></tr><tr><td>抑肽酶</td><td>Sigma</td><td>A1153-10MG</td><td></td></tr><tr><td>胃蛋白酶抑制剂</td><td>Sigma</td><td>P4265-5MG</td><td></td></tr><tr><td>细胞松弛素B</td><td>Sigma</td><td>C8273-10MG</td><td></td></tr><tr><td>3 ml 注射器：鲁尔锁头</td><td>Becton Dickinson</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>27 G 针头</td><td>Becton Dickinson</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>96孔实底白色聚苯乙烯微孔板，圆底</td><td>Corning</td><td>3605</td><td></td></tr><tr><td>Steady-Glo 萤光素酶检测试剂系统</td><td>Promega</td><td>E2520</td><td>长期储存于 -80 &amp;deg;C，可在 -20 &amp;deg;C 储存长达1个月</td></tr><tr><td>TNT Sp6 偶联网织红细胞裂解物系统</td><td>Promega</td><td>L4600</td><td></td></tr><tr><td>TNT Sp6 高产小麦胚芽蛋白表达系统</td><td>Promega</td><td>L3260</td><td>通常比网织红细胞裂解物产量更高&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>EasyTag Express 蛋白标记混合物 [S35]</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG772007MC</td><td></td></tr><tr><td>磷酸肌酸</td><td>Sigma</td><td>27920-5G</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A2383-5G</td><td></td></tr><tr><td>肌酸磷酸激酶</td><td>Sigma</td><td>C3755-35KU</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma</td><td>D8418-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Dual-Glo 萤光素酶检测试剂系统</td><td>Promega</td><td>E2920</td><td>储存条件与 Steady-Glo 相同</td></tr><tr><td>50 ml 离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>0556214D</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall SS-34 固定角转子</td><td>Thermo Scientific</td><td>28020</td><td></td></tr><tr><td>115 V 50/60 Hz 微型离心机</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-090-128</td><td></td></tr><tr><td>mMessage mMachine Sp6 试剂盒</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>抗萤火虫萤光素酶抗体</td><td>Abcam</td><td>ab16466</td><td></td></tr><tr><td>抗GSK3抗体</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>610201</td><td></td></tr><tr><td>FLUOStar Optima</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall RC-6 Plus 离心机</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>16 &amp;deg;C 培养箱</td><td>Percival Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

在xenopus卵提取物中重建β-catenin降解过程

Reconstitution Of &#946;-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract

Xenopus laevis 卵提取物是一种经过充分表征且稳定的系统，可用于研究多种细胞过程的生物化学机制。Xenopus 卵提取物已被广泛应用于多种细胞环境中的蛋白质降解研究，包括细胞周期和信号转导通路1-3。本文描述了一种优化后的Xenopus 卵提取物制备方法，该方法可有效促进Wnt信号通路关键组分β-catenin的降解。文中介绍了两种评估Xenopus 卵提取物中β-catenin蛋白降解的方法：一种方法具有良好的视觉可读性（使用[35S]放射性标记蛋白），另一种则更易于扩展用于高通量检测（使用萤光素酶标记的融合蛋白）。所述技术可用于但不限于评估β-catenin蛋白的周转速率，并鉴定参与其降解的分子组分。此外，能够大量制备均一的Xenopus 卵提取物，结合萤光素酶标记蛋白所具有的定量性和操作简便性，使得该系统可轻松适用于针对β-catenin降解调节剂的高通量筛选。

β-catenin降解的示意图 非洲爪蟾 卵提取物如图所示 图 2A. 35S标记的β-catenin在 非洲爪蟾 卵提取物，在适当时间点取出等分试样（相当于1 ml提取物），样品经SDS-PAGE后进行放射自显影。Wnt信号通路组分介导的β-catenin降解由泛素-蛋白酶体系统完成2，以及[35S]-放射性标记的 β-catenin 在 非洲爪蟾 添加蛋白酶体抑制剂MG132可抑制该提取物的活性 图2BWnt 通路组分对 β-catenin 的降解依赖于 GSK3 对其的磷酸化34GSK3依赖性降解可通过多种方法轻松验证 非洲爪蟾 卵提取物：1) β-catenin(SA)突变体（GSK3磷酸化位点突变为丙氨酸）在其中保持稳定 非洲爪蟾 与野生型β-catenin蛋白相比的卵提取物 图2B2）GSK3的小分子抑制剂（LiCl）同样可抑制β-catenin的降...

本文描述了一种利用放射性标记和荧光素酶融合蛋白在Xenopus卵提取物中分析蛋白质降解的方法，并介绍了该方法在小分子蛋白质降解调节剂高通量筛选中的应用。

在Xenopus卵提取物中重建β-catenin降解过程

非洲爪蟾（Xenopus laevis）卵提取物是一种经过充分表征且稳定的系统，可用于研究多种细胞过程的生物化学机制。非洲爪蟾卵提取物具有……

以下实验的总体目标是利用无细胞生化非洲爪蟾卵提取物系统，分析β-catenin的降解过程。首先，向活化的Xip卵提取物中添加或去除疑似效应分子，以鉴定调控β-catenin降解的因子；作为第二步，在体外将外源性的、经转录和翻译的β-catenin（用³⁵S放射性标记或与荧光素酶融合）加入XUS卵提取物中，该蛋白在天然条件下会主动降解。随后，收集不同时间点的样本，以评估随时间变化的β-catenin蛋白水平变化。获得的结果可显示特定的非洲爪蟾卵提取物调控是否会增加或减少β-catenin的降解速率，该结果基于放射自显影和/或化学发光检测。该技术相较于其他现有方法（如在培养细胞中进行的脉冲追踪或环己酰亚胺追踪实验）的优势在于，非洲爪蟾卵提取物提供了一种无细胞的生物化学体系，可在蛋白质水平上分析蛋白质的调控，且避免了活跃转录带来的额外复杂性。该方法有助于通过鉴定关键信号蛋白（如β-catenin）的调控因子，回答信号转导领域中的关键科学问题。使用非洲爪蟾（xenopus）提取物可使研究人员轻松耗竭信号通路中的特定组分，并回补特定量的目标蛋白。为确定其剂量依赖性效应，应使用新制备的XUS卵提取物，或快速解冻冷冻保存的提取物，并立即置于冰上。所有操作均需在低温条件下进行；制备抗体或亲和 beads 时，其体积应为提取物体积的十分之一，以尽量减少对提取物的稀释；在加入提取物前，应尽可能吸除 beads 中的液体。使用具有长锥形末端的凝胶上样枪头，将提取物加入 GST 结合树脂中。在 4°C 条件下旋转孵育提取物与珠粒的混合物 1 小时。然后在 4°C 条件下，以 12,600 G 离心 30 秒。注意在转移提取液时避免带入任何珠粒。将去除了目标成分的提取液转移至冰上预冷的新微量离心管中。通过免疫印迹法检测去除非目标成分的效率，需同时检测去除非目标成分后的提取液及珠粒。由于T和降解过程依赖能量，会迅速耗尽内源性ATP储存。因此，为了维持高效的T降解，必须使用能量再生体系。按照文本方案中的说明，配制20倍浓度的能量再生（ER）混合液。通过用手搓动冷冻管快速融化opus卵提取物。在提取物完全融化之前，立即将管子置于冰上。加入10 µL能量再生液。取适量非洲爪蟾卵提取物，加入其中。通过快速弹击管壁并短暂涡旋振荡以充分混匀，立即置于冰上。在预冷的微量离心管中，于冰上分装适当体积用于降解实验。为进行放射性标记的β-连环蛋白降解实验，每个时间点从提取物中取出两到五微升，用于在XUS卵提取物中开展放射性标记β-连环蛋白降解分析。首先，按照文本方案所述制备放射性标记的β-连环蛋白。然后，将一至三微升体外翻译的β-连环蛋白加入20微升xip反应混合液中，置于冰上，通过快速轻弹管壁并短暂涡旋，充分混匀。这是一个重要的步骤。XUS 卵提取物非常黏稠，混合不充分会影响结果的一致性。进行脉冲、离心

reconstitution-of-catenin-degradation-in-xenopus-egg-extract

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

重组β-catenin的降解<em&gt;爪蟾</em&gt;卵提取物

粗制和分级的非洲爪蟾卵提取物可用于提供重建细胞过程所需的组分，以进行形态学和生物化学分析。通过卵细胞裂解及差速离心法制备粗制提取物，进而用于制备分级提取物和轻质膜组分。...

非洲爪蟾卵提取物的制备与分级分离

核膜组装是细胞分裂周期中的关键步骤；该过程可通过在试管中结合非洲爪蟾精子染色质、细胞质提取物和轻质膜组分来体外重现。由此形成的完整细胞核包含带有核孔复合体的核膜，并且这些重建的细胞核能够执行正常的核功能。...

利用分离的非洲爪蟾卵提取物进行体外核组装

本视频方案演示了一种通过将转基因导入精子细胞核，随后将其移植到未受精卵中，从而生成转基因Xenopus...

通过限制性内切酶介导的整合与核移植技术生产转基因Xenopus laevis

Xenopus 卵提取物是研究DNA损伤检查点的一个有用模型系统。本方案介绍了Xenopus...

使用Xenopus卵提取物研究DNA损伤检查点

Xenopus tropicalis 卵提取物的制备用于鉴定微管相关RNA

蛋白质合成的调控主要发生在翻译起始阶段，该过程的缺陷与多种疾病相关。为了更好地理解这些疾病的病因，本文描述了一种利用非洲爪蟾（Xenopus laevis）卵母细胞评估在翻译起始因子 eIF4G1 突变体存在条件下 mos...

Xenopus laevis 作为鉴定翻译障碍的模型

染色体高度凝缩的有丝分裂染色质去凝缩的分子机制尚不明确。我们提出一种基于从HeLa细胞分离的有丝分裂染色质簇建立的无细胞检测方法 Xenopus laevis 能够真实重建解凝过程的卵提取物 体外.

一种无细胞体系检测方法用于研究有丝分裂末期染色质去凝集过程

细胞及细胞内比例调控的机制仍不明确。Xenopus...

使用Xenopus laevis胚胎提取物研究细胞核大小调控机制的无细胞实验

蛋白质通常包含多个可发挥不同细胞功能的结构域。基因敲除（KO）无法考虑这种功能多样性。本文中，我们报道了一种基于重组介导的盒式交换（RMCE）的结构-功能研究方法，该方法应用于基因敲除的胚胎干细胞，可实现对蛋白质不同功能结构域或变异体的分子解析。...

利用重组酶介导的盒式交换在小鼠胚胎干细胞中进行结构-功能研究

我们提出了一种用于生成 体外 通过包封卵母细胞提取物在单细胞水平实现自我维持的有丝分裂振荡 非洲爪蟾...

在无细胞微乳液中重建细胞周期振荡 非洲爪蟾 卵母细胞提取物

我们描述了一种制备和实时成像非洲爪蟾（Xenopus...

Xenopus laevis 卵提取物制备及活体成像方法用于可视化动态胞质结构

了解利用爪蟾卵提取物无细胞生化系统分析β-catenin蛋白降解的方法。该技术通过放射性标记或荧光素酶融合蛋白追踪降解速率，帮助研究人员识别调控信号蛋白稳定性的关键因子。

在Xenopus卵提取物中重建β-catenin降解过程

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