重组β-catenin的降解爪蟾卵提取物

的方法被描述为使用放射性标记和荧光素酶融合蛋白在非洲蟾蜍卵提取物和其适应高通量筛选用于蛋白质降解的小分子调节剂进行分析的蛋白质降解。

以下实验的总体目标是使用无细胞生化非洲爪蟾卵提取物系统分析周转中的 β catine。这是通过首先向活化的 xip 卵提取物中添加和/或耗尽可疑效应子来实现的，以鉴定 β-catenin 周转的调节剂，作为第二步 体外外源性、转录和翻译的 β-catenin，用 S 35 标记的无线电或与荧光素酶融合添加到 XUS 卵提取物中，其在天然条件下被主动降解。接下来，收集时间点以评估 β katine 和蛋白质水平随时间的变化。

获得的结果表明，基于自动射线照相和/或发光检测，非洲爪蟾卵提取物的特定调节是否会增加或降低 β catine 和降解的速率。与其他现有方法（例如培养细胞中的脉冲追踪或循环海德追踪实验）相比，该技术的优势在于非洲爪蟾卵提取物提供了一个无细胞的生化系统，可以在其中分析蛋白质水平的蛋白质调控，并且它缺乏活性转录的额外复杂性。该方法可以通过识别关键信号转导蛋白（如 β catina）的调节因子来帮助回答信号转导领域中的关键问题。

使用非洲爪蟾提取物使用户能够轻松耗尽途径的成分并添加回规定量的蛋白质。为了确定其剂量依赖性效应，使用新鲜制备的 XUS 鸡蛋提取物或快速解冻、冷冻提取物并置于冰上。在冷环境中进行所有作，以提取物体积的十分之一制备沉淀抗体或亲和珠子，以尽量减少提取物的稀释，在添加提取物之前从珠子中吸取尽可能多的液体。

此处使用具有长锥形末端的凝胶上样吸头，将提取物添加到 GST 结合树脂中。将提取珠混合物在 4 摄氏度下旋转 1 小时。然后将提取珠混合物在 4 摄氏度的微量离心中以 12， 600 G 的速度旋转 30 秒。

注意不要将任何珠子与提取物一起转移。将耗尽的提取物转移到冰上的新鲜微量离心管中。通过免疫印迹确认去除效率，包括去除的提取物和珠子。

因为 T 和降解是能量依赖性的，所以它会迅速耗尽内源性 A TP 储存。因此，为了保持稳健的 T 降解，必须使用能量再生混合物。按照文本协议中的详细说明准备 20 x 能量再生或 ER 混合物。

用手摩擦冰冻的管子，快速解冻 opus egg 提取物。在所有提取物融化之前将试管放在冰上。添加 10 微升能量再生。

混合成等分试样的非洲爪蟾蛋提取物。快速轻弹试管和脉冲涡旋脉冲旋转，充分混合，然后立即置于冰上。将用于降解测定的适当体积分装到冰上预冷的微量离心管中。

为了准备放射性标记的 β katine 和降解测定，在每个时间点提取 2 至 5 微升提取物，以在 XUS 卵提取物中进行放射性标记的 β-连环蛋白降解测定。首先，按照文本协议中的说明准备标记为 β-catenin 的无线电。然后，通过快速轻弹试管和短促的涡旋脉冲，将 1 至 3 微升体外翻译的 β-catenin 加入 20 微升冰上的 xip 反应混合物中。

这是重要的一步。XUS 鸡蛋提取物非常粘稠，不完全混合会影响结果脉冲、旋转和冰上放置的一致性。通过在指定时间点将试管移至室温来开始 β-catenin 降解反应。

取出 1 至 5 μL 样品，立即与 5 倍体积的 SDS 样品缓冲液混合以终止反应，以确保降解反应完全终止。轻弹试管数次并剧烈涡旋以执行 SDS 页面。自动射线照相为每个泳道的每个时间点运行一微升当量的提取物。

可以使用图像、J 图像定量或其他首选成像软件对结果进行定量。xap 鸡蛋提取物中 β-catenin 的降解应由带中无线电标记的 β kaine 强度的时间依赖性降低来证明。为了制备 β-catenin 荧光素酶，合成非放射性标记的荧光素酶标记的 β-catenin。

使用具有完整氨基酸混合物的转录翻译偶联系统。通过测量 0.5 至 1 μL 反应的荧光素酶活性，确认荧光素酶标记的 β-catenin 的产生。通过测量来自非翻译反应混合物的发光来评估背景发光，以进行 β 猫嘻萤酶降解测定首先解冻并像以前一样制备非洲爪蟾卵提取物。

然后将体外翻译的 β catine 和荧光素酶融合物加入制备的 xip 反应中。在冰上混合并充分混合。和以前一样，将提取物转移到室温以开始降解反应。

在指定时间点取出等分试样的反应，并在液氮中快速冷冻。在每个时间点去除一式三份样品进行分析。冷冻提取物可以储存在零下 80 摄氏度，直到准备好进行分析。

在冰上解冻样品，并在处理前将样品转移到冰上的标准白色 96 孔板中。对于荧光素酶活性，使用 XUS 卵提取物可以很容易地以多种方式证明 β-catenin 的 GS GSK 三种依赖性降解。通过添加蛋白酶体抑制剂 MG 1 32 可抑制 XUS 提取物中 S 35 放射性标记的 β-catenin 的降解。

相对于野生型甜菜碱，β-catenin 突变体在 XUS 卵提取物中稳定，GSK 的蛋白抑制剂 3 同样抑制 β-catenin 的降解。最后，xip 鸡蛋提取物中 GSK 3 的消耗抑制了 β-catenin 降解的降解，可以通过添加外源性 GSK 3 来挽救。xip 鸡蛋提取物中的 β-catenin 荧光素酶降解测定用于评估 β katine 和荧光素酶的降解。

β katine 和荧光素酶的降解速率与未标记的 β-catenin 蛋白相似。β katine 和荧光素酶融合的降解调节与非融合蛋白基本相同。由于氯化锂的添加导致 β catine 和荧光素酶周转的抑制，β catina 的放射性信号发生变化。

荧光素酶蛋白与荧光素酶活性随时间的变化相似 在尝试此过程时。在尝试此检测之前，将所有试剂保存在冰上并彻底混合反应物非常重要。观看此视频后，您应该对如何使用无细胞非洲爪蟾卵提取物系统识别调节因子和分析 β catine 和周转率有很好的了解。