Name: RNAscope的原位检测转录活性的人类乳头状瘤病毒在头颈部鳞状细胞癌 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-11T18:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: 学习使用RNAscope技术检测头颈部鳞状细胞癌中高危HPV E6/E7 mRNA的原位表达。该方法可在福尔马林固定石蜡包埋组织切片中实现单分子水平的可视化检测。

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部分由美国国立卫生研究院资助（R43/44CA122444）和美国国防部乳腺癌研究计划资助（W81XWH-06-1-0682）支持，资助对象为YL。

1. 样品、仪器和试剂准备
<ol>
	<li>将组织样本切成3-4 mm厚的组织块，用新鲜的10%中性缓冲福尔马林在室温（25 °C）下固定16-32小时，然后包埋于石蜡中。从FFPE组织块上切下5±1 µm厚的切片，将切片贴附于载玻片上&#160;并自然晾干。注意：载玻片可在干燥条件下于室温保存最多3个月。在进行RNAscope检测前，应将贴附组织的载玻片置于60 °C干烤箱中烘烤1小时。</li>
	<li>将杂交炉预热至40 °C。在湿度控制盘中放入一张加湿纸，并加入50 ml去离子水（dH2O）使其完全润湿。将盖好的湿度控制盘放入杂交炉中，至少预热30分钟后再使用。</li>
	<li>用去离子水（dH2O）稀释10x预处理液，配制700 ml的1x Pretreat 2溶液（10 nl，pH 6柠檬酸盐缓冲液）。将1x Pretreat 2溶液加热至沸腾，并维持温度在100-104 °C之间，同时防止过度沸腾。</li>
	<li>用去离子水（dH2O）稀释预热的50x洗涤缓冲液，配制3 L的1x洗涤缓冲液（0.1x SSC）。</li>
	<li>在通风橱内准备2 × 200 ml二甲苯和2 × 200 ml 100%乙醇，用于脱蜡。</li>
	<li>在通风橱内准备50%苏木精染色液和蓝化试剂（0.01%氨水），用于染色后处理。</li>
	<li>在通风橱内准备200 ml二甲苯、200 ml 70%乙醇以及2 × 200 ml 100%乙醇，用于脱水。</li>
	<li>将靶标探针在40 °C预热10分钟，并将即用型（RTU）检测试剂盒中的试剂恢复至室温，包括RTU Amp1、Amp2、Amp3、Amp4、Amp5-Brown和Amp6-Brown，但DAB显色剂Brown-A和Brown-B除外。</li>
</ol>
2. RNAscope 检测
脱蜡与脱水
烘烤后，将组织切片在二甲苯中脱蜡，每次5分钟，共两次，期间频繁振荡；然后在100%乙醇中脱水，每次3分钟，共两次，期间频繁振荡。室温下晾干5分钟，并使用疏水屏障笔在组织切片周围画出疏水屏障。
预处理
<ol>
	<li>将组织切片与 Pretreat 1 在室温下孵育 10 分钟，以淬灭内源性过氧化物酶活性，随后用 dH2O 冲洗。</li>
	<li>将组织切片与 Pretreat 2 在沸水浴中孵育 15 分钟，以进行 RNA 回收，随后用 dH2O 冲洗两次。</li>
	<li>将组织切片与 Pretreat 3 在 HybEZ 烤箱中于 40°C 孵育 30 分钟，以进行蛋白质消化，随后用 dH2O 冲洗两次。</li>
</ol>
靶标探针杂交
靶标探针HPV-HR 7重混合物包括：HPV16、18、31、33、35、52和58。将HPV探针、泛素C（UBC）探针以及细菌基因dapB探针分别添加至三个相邻的组织切片上。在40 °C烘箱中杂交2小时，然后在1x洗涤缓冲液中室温漂洗，每次2分钟，共漂洗两次。
信号放大
<ol>
	<li>孵育组织切片 Amp1 （预扩增仪）在 40 °C 下孵育 30 分钟， Amp2 （背景减少剂）在 40 °C 下孵育 15 分钟， Amp3 （扩增仪）在 40 °C 下反应 30 分钟， Amp4 在 HybEZ 烤箱中于 40 °C 条件下孵育（标记探针）15 分钟。每次杂交步骤后，在室温下用 1x 洗涤缓冲液漂洗 2 次，每次 2 分钟。</li>
	<li>孵育组织切片 Amp5 30 分钟 Amp6 室温下孵育15分钟。每次孵育步骤后，在1×洗涤缓冲液中室温漂洗2次，每次2分钟。</li>
</ol>
信号检测
将组织切片与1:1 DAB显色液（等体积混合Brown-A和Brown-B）在室温下孵育10分钟，然后用dH2O冲洗两次。
复染
在室温下用50%苏木精溶液染色组织切片2分钟，用dH2O冲洗至载玻片透明而组织仍呈紫色。将载玻片浸入含0.01%氨水的dH2O中5次，随后再在dH2O中浸洗5次。
载玻片封片
将组织切片依次在70%、100%和100%乙醇中各脱水2分钟，二甲苯中处理5分钟，然后使用含二甲苯的封片介质封片。

<ol><li>Parkin, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+health+burden+of+infection-associated+cancers+in+the+year+2002%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The global health burden of infection-associated cancers in the year 2002.</a> Int. J. Cancer. 118 (12), 3030-3044 (2006).</li>
<li>Chaturvedi, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+papillomavirus+and+rising+oropharyngeal+cancer+incidence+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Human papillomavirus and rising oropharyngeal cancer incidence in the United States.</a> J. Clin. Oncol. 29 (32), 4294-4301 (2011).</li>
<li>Ang, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+papillomavirus+and+survival+of+patients+with+oropharyngeal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Human papillomavirus and survival of patients with oropharyngeal cancer.</a> N. Engl. J. Med. 363 (1), 24-35 (2010).</li>
<li>Smeets, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+algorithm+for+reliable+detection+of+human+papillomavirus+in+paraffin+embedded+head+and+neck+cancer+specimen%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">A novel algorithm for reliable detection of human papillomavirus in paraffin embedded head and neck cancer specimen.</a> Int. J. Cancer. 121 (11), 2465-2472 (2007).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope%3A+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> J. Mol. Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+regulation+of+NRG1+isoform+expression+by+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Specific regulation of NRG1 isoform expression by neuronal activity.</a> J. Neurosci. 31 (23), 8491-8501 (2011).</li>
<li>Yan, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intestinal+stem+cell+markers+Bmi1+and+Lgr5+identify+two+functionally+distinct+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The intestinal stem cell markers Bmi1 and Lgr5 identify two functionally distinct populations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (2), 466-471 (2012).</li>
<li>Payne, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viable+circulating+tumour+cell+detection+using+multiplex+RNA+in+situ+hybridisation+predicts+progression-free+survival+in+metastatic+breast+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Viable circulating tumour cell detection using multiplex RNA in situ hybridisation predicts progression-free survival in metastatic breast cancer patients.</a> Br. J. Cancer. 106 (11), 1790-1797 (2012).</li>
<li>Bordeaux, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+in+situ+measurement+of+estrogen+receptor+mRNA+predicts+response+to+tamoxifen%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative in situ measurement of estrogen receptor mRNA predicts response to tamoxifen.</a> PLoS One. 7 (5), (2012).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+quantitative+RNA+in+situ+hybridization+for+resolution+of+equivocal+and+heterogeneous+ERBB2+%28HER2%29+status+in+invasive+breast+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">Automated quantitative RNA in situ hybridization for resolution of equivocal and heterogeneous ERBB2 (HER2) status in invasive breast carcinoma.</a> J. Mol. Diagn. 15 (2), 210-219 (2013).</li>
<li>Tubbs, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+RNA+in+situ+Hybridization+for+Detection+of+Restricted+Clonal+Expression+of+Low+Abundance+Immunoglobulin+Light+Chain+mRNA+in+B-Cell+Lymphoproliferative+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Surg.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive RNA in situ Hybridization for Detection of Restricted Clonal Expression of Low Abundance Immunoglobulin Light Chain mRNA in B-Cell Lymphoproliferative Disorders.</a> Am. J. Surg. Pathol. In press, (2013).</li>
<li>Ukpo, O. C., Flanagan, J. J., Ma, X. J., Luo, Y., Thorstad, W. L., Lewis, J. S. Jr. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-risk+human+papillomavirus+E6%2FE7+mRNA+detection+by+a+novel+in+situ+hybridization+assay+strongly+correlates+with+p16+expression+and+patient+outcomes+in+oropharyngeal+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Surg.+Pathol%22%5BJournal%5D)">High-risk human papillomavirus E6/E7 mRNA detection by a novel in situ hybridization assay strongly correlates with p16 expression and patient outcomes in oropharyngeal squamous cell carcinoma.</a> Am. J. Surg. Pathol. 35 (9), 1343-1350 (2011).</li>
<li>Lewis, J. S. Jr., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptionally-active+high-risk+human+papillomavirus+is+rare+in+oral+cavity+and+laryngeal%2Fhypopharyngeal+squamous+cell+carcinomas--a+tissue+microarray+study+utilizing+E6%2FE7+mRNA+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Transcriptionally-active high-risk human papillomavirus is rare in oral cavity and laryngeal/hypopharyngeal squamous cell carcinomas--a tissue microarray study utilizing E6/E7 mRNA in situ hybridization.</a> Histopathology. 60 (6), 982-991 (2012).</li>
<li>Lewis, J. S. Jr., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+p16+staining+in+oropharyngeal+squamous+cell+carcinoma%3A+extent+and+pattern+correlate+with+human+papillomavirus+RNA+status%5BTitle%5D)+AND+%22Mod.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Partial p16 staining in oropharyngeal squamous cell carcinoma: extent and pattern correlate with human papillomavirus RNA status.</a> Mod. Pathol. 25 (9), 1212-1220 (2012).</li>
<li>Bishop, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+transcriptionally+active+high-risk+HPV+in+patients+with+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+as+visualized+by+a+novel+E6%2FE7+mRNA+in+situ+hybridization+method%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Surg.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Detection of transcriptionally active high-risk HPV in patients with head and neck squamous cell carcinoma as visualized by a novel E6/E7 mRNA in situ hybridization method.</a> Am. J. Surg. Pathol. 36 (12), 1874-1882 (2012).</li>
<li>Schache AG,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+novel+diagnostic+standard+in+HPV-positive+oropharyngeal+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Validation of a novel diagnostic standard in HPV-positive oropharyngeal squamous cell carcinoma.</a> Br. J. Cancer. 108 (6), 1332-1339 (2013).</li>
<li>Mehrad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Papillary+Squamous+Cell+Carcinoma+of+the+Head+and+Neck%3A+Clinicopathologic+and+Molecular+Features+With+Special+Reference+to+Human+Papillomavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Surg.+Pathol.+Jun%22%5BJournal%5D)">Papillary Squamous Cell Carcinoma of the Head and Neck: Clinicopathologic and Molecular Features With Special Reference to Human Papillomavirus.</a> Am. J. Surg. Pathol. Jun. , (2013).</li>
<li>Jordan, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+methods+for+oropharyngeal+cancer+HPV+status+determination+in+US+cooperative+group+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Surg.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Validation of methods for oropharyngeal cancer HPV status determination in US cooperative group trials.</a> Am. J. Surg. Pathol. 36, 945-954 (2012).</li>
<li>Hammond, M. E., et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for immunohistochemical testing of estrogen and progesterone receptors in breast cancer (unabridged version). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHammond%2C+ME+%22Arch.+Pathol.+Lab.+Med%22">Arch. Pathol. Lab. Med</a>. 134 (7), 48-72 (2010).</li>
</ol>

所有作者均受雇于并持有Advanced Cell Diagnostics, Inc.的股票。

RNAscope HPV 检测可实现 E6/E7 mRNA 的直接可视化 原位 在HPV相关性头颈部鳞状细胞癌中。RNAscope检测可完全兼容常规固定的肿瘤组织，并能保持组织形态，便于进行组织病理学相关分析。图2）。RNAscope 检测相较于传统 CISH 方法的一个关键优势在于，它能够特异性地扩增杂交信号（图2B 和&#160;2E）而不会放大背景噪声（图2C 和&#160;2F).
在实际操作中，RNAscope HPV 检测可在8小时内完成，也可方便地分两天进行。RNAscope HPV 检测已被用于确定头颈部鳞状细胞癌中的 HPV 状态12-16，以qRT-PCR作为参考方法时，其敏感性为97%，特异性为93%16。传统的染色原位杂交（ISH）检测高危型HPV DNA具有高度特异性，但敏感性约为80%12。针对细胞替代标志物p16的免疫组织化学（IHC）染色具有良好的敏感性，但可能出现假阳性结果15,18，尤其是在非口咽部头颈部肿瘤中15。目前用于检测HPV E6/E7 mRNA的“金标准”方法qRT-PCR需要新鲜冷冻组织才能获得最佳结果，且技术操作复杂，因此仅限于研究实验室使用。此外，该方法需要进行RNA提取，因而无法将高危型HPV E6/E7 mRNA的表达与组织病理学特征进行关联分析。
RNAscope 检测成功的关键因素有多个。首先，为获得最佳结果，应根据 ASCO/CAP 指南19，将组织在室温下用新鲜的 10% 中性缓冲福尔马林固定 16–32 小时。其次，强烈推荐使用 HybEZ 烤箱，因为它能够对探针杂交和信号扩增步骤的温度和湿度实现最佳控制。第三，在每一步操作前必须彻底去除残留缓冲液，但同时需确保组织切片在任何步骤中均不干燥。
本文所述的手动RNAscope实验流程已完全在商用切片自动染色系统上实现自动化10。这将极大促进临床病理实验室中检测条件的标准化，并节省宝贵的人工操作时间。此外，已有专门的图像分析软件被开发出来10，可自动识别数字化切片上的细胞及染色信号，有助于消除主观判断，提高评分的可重复性。
总之，RNAscope HPV 检测可识别高危型 HPV E6/E7 mRNA 转录本的存在 原位 在FFPE组织中，该技术具有临床病理实验室所熟悉的流程，可直接在组织切片中可视化这些目标物。它为检测（FFPE）组织样本提供了理想的平台，并可被诊断病理实验室轻松采用。

高危型人乳头瘤病毒（HR-HPV）感染约占全球所有癌症病例的5%1。在过去几十年中，与HPV相关的口咽癌发病率持续上升，尤其在男性中更为显著。预计在未来20年内，美国大多数头颈部癌症将由HPV阳性的口咽鳞状细胞癌（OPSCC）构成2。由HPV引起的口咽鳞状细胞癌与较好的生存预后相关，肿瘤的HPV状态是生存率的一个强有力且独立的预后因素3。
转录激活病毒癌基因 E6 和 E7 的证据被视为临床上相关人乳头瘤病毒（HPV）存在的金标准4然而，通过RT-PCR技术检测新鲜肿瘤组织中的E6/E7 mRNA在常规临床实践中并不实用，目前仅限于研究实验室使用。近期，我们开发了一种名为RNAscope的新型RNA原位杂交（RNA ISH）技术，可在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织标本中实现单个RNA分子灵敏度的多重检测，并定位到单个细胞水平。5-10我们提供了三条证据支持单分子检测5首先，RNAscope探针设计及信号扩增系统能够检测HeLa和SK-BR-3细胞系中单拷贝的HER2基因组DNA靶标。其次，与HER2基因组DNA信号相比，HeLa细胞中HER2 mRNA信号点的荧光强度分布符合每个信号点对应一个分子的特征。第三，每个细胞中HER2 mRNA信号点的数量与基于溶液的定量检测方法所估算的HER2 mRNA拷贝数高度一致，进一步支持了单分子检测的准确性。此外，在荧光显微镜下使用DAPI或在明场显微镜下使用苏木精对细胞核进行复染，可清晰显示单个细胞核，从而实现对单个细胞水平上RNA靶标的检测与定量。10分析基因表达的能力 原位 在常规临床样本中，RNAscope 成为诊断病理学中一个颇具前景的平台，尤其适用于基于福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织切片的检测10,11我们开发了一种基于RNAscope的HPV检测方法，利用型别特异性探针混合物检测七种高危型HPV基因型（HPV16、18、31、33、35、52和58）的E6/E7 mRNA。我们近期在口咽鳞状细胞癌（OPSCC）中的研究表明，RNAscope HPV检测法在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织中判定HPV状态具有高度敏感性和特异性12-17，并且还对口咽鳞状细胞癌（OPSCC）的预后具有提示作用12,16.
RNAscope 技术的原理此前已有描述5。本文中，我们介绍完整的 RNAscope 检测实验方案，并展示其在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）肿瘤组织切片中检测高危型人乳头瘤病毒（HR-HPV）的应用。

<table><tbody><tr><td>SuperFrost Plus 载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>HybEZ 烤箱、托盘和支架</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310011, 310012, 310014</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope 2.0 FFPE 试剂盒 - 棕色</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310035</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope HPV-HR7 探针（针对 HPV 16、18、31、33、35、52 和 58 型 E6/E7 mRNA）</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>312351</td><td></td></tr><tr><td>ImmEdge 疏水屏障笔</td><td>Vector Laboratory</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>100% 乙醇</td><td>American Master Tech Scientific</td><td>ALREAGAL</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3P-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>吉氏苏木精 I</td><td>American Master Tech Scientific</td><td>HXGHE1LT</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化铵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320145-500mL</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片 24 mm × 50 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-F</td><td></td></tr><tr><td>加热板</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-300-49SHP</td><td></td></tr><tr><td>干燥烤箱</td><td></td><td></td><td>能够维持温度在 60&amp;plusmn;1 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>水浴锅</td><td></td><td></td><td>能够维持温度在 40&amp;plusmn;1 &amp;deg;C</td></tr></tbody></table>

rnascope技术 原位 头颈部鳞状细胞癌中转录活性人乳头瘤病毒的检测

RNAscope for In situ Detection of Transcriptionally Active Human Papillomavirus in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

检测致癌性人乳头瘤病毒（HPV）的“金标准”是在肿瘤组织中检测出转录活跃的高危型HPV。然而，通过定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）检测E6/E7 mRNA需要提取RNA，这一过程会破坏肿瘤组织的结构背景，而该背景对于形态学相关性分析至关重要，因此该方法难以在常规临床实践中推广应用。我们近期开发的RNA 原位 杂交技术，RNAscope，可实现对福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）组织中RNA的直接可视化，具有单分子敏感性和单细胞分辨率，从而实现高灵敏度和高特异性 原位 在常规临床样本中对任何RNA生物标志物进行分析。RNAscope HPV检测采用基因型特异性探针混合物，用于检测七种高危型HPV基因型（HPV16、18、31、33、35、52和58）的E6/E7 mRNA。该方法在检测E6/E7 mRNA方面，相较于目前的“金标准”定量逆转录PCR（qRT-PCR）方法，表现出优异的灵敏度和特异性。通过RNAscope检测确定的HPV状态对口咽癌患者的临床预后具有显著的预测价值。

RNAscope HPV 检测工作流程
RNAscope 检测具有高度简化的实验流程，类似于免疫组化（IHC）（图1）。该流程包括四个主要步骤：预处理、杂交、信号扩增和检测。该方法采用独特的探针设计策略，可确保高保真的信号扩增5。在 RNAscope HPV 检测中，七种高危型 HPV 探针组被混合使用，均由同一套连接辣根过氧化物酶（HRP）的信号扩增系统识别。特异性杂交信号通过 HRP 催化的显色反应生成棕色沉淀物，以 DAB 作为底物，可在标准明场显微镜下清晰观察到。
HPV 检测的代表性染色
图2展示了头颈部鳞状细胞癌FFPE切片染色后的示例图像。在HPV阳性病例中（图2A），高危型HPV（HR-HPV）探针在肿瘤细胞中检测到强烈的点状信号。UBC探针在肿瘤细胞和间质细胞中均检测到大量点状胞质信号（图2B）。细菌基因dapB探针显示出清晰的背景（图2C）。在HPV阴性病例中，HR-HPV探针和dapB探针均未检测到信号（图2D和2F），而UBC探针则检测到强信号（图2E）。本检测中，UBC作为阳性对照用于评估组织RNA质量，dapB作为阴性对照用于评估背景信号。HPV状态的判读需对每个病例的三张切片进行观察。以阴性对照切片（dapB）的染色水平作为阈值：当出现高于dapB切片信号的点状胞质和/或核染色时，定义为HPV阳性。
<img alt="RNAscope 流程图：脱蜡、预处理、探针杂交、信号放大。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51426/51426fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51426/51426fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. RNAscope 检测流程图。 RNAscope 检测工作流程示意图。RNAscope 检测包含四个主要步骤：预处理、靶标探针杂交、信号放大和信号检测。整个检测过程可在 8 小时内完成。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51426/51426fig1highres.jpg" target="_blank">点击此处查看大图。</a>
<img alt="HPV、UBC、dapB 标记物的组织学分析、组织切片、免疫染色结果。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51426/51426fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51426/51426fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. RNAscope 染色切片的示例图像。 来自两例头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）病例的石蜡包埋组织切片，使用高危型 HPV（HR-HPV）、UBC（阳性对照）和 dapB（阴性对照）探针进行染色。A-C。HPV 阳性病例。A，肿瘤细胞中 HR-HPV E6/E7 mRNA 的表达。插图：40× 放大倍数，显示点状信号。B 和 C）相邻组织切片分别显示 UBC 阳性染色（B）和 dapB 阴性染色（C）。D-F）HPV 阴性病例。D）HPV E6/E7 mRNA 无染色，与 dapB 阴性对照（F）相似。E）UBC 阳性染色。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51426/51426fig2highres.jpg" target="_blank">点击此处查看高清图像。</a>

高危型人乳头瘤病毒（HPV）存在于头颈部肿瘤组织中与较好的预后相关。近年来新开发的 RNA 原位 一种名为RNAscope的杂交技术可实现对福尔马林固定石蜡包埋组织切片中HPV E6/E7 mRNA的直接可视化。

RNAscope技术 原位 头颈部鳞状细胞癌中转录活性人乳头瘤病毒的检测

检测致癌性人乳头瘤病毒（HPV）的“金标准”是证明肿瘤组织中存在转录活跃的高危型HPV。然而，检测……

以下实验的总体目标是通过一种名为RNA scope的新型RNA原位杂交技术，实现对头颈部肿瘤细胞中高危型HPV E6、E7 mRNA的高灵敏度和高特异性检测。该方法首先对载玻片上的组织样本进行热处理和蛋白酶预处理，以增加细胞通透性，便于探针进入。第二步是将载玻片与靶向七种高危型HPV的HPV探针混合物共同孵育，该探针可与E6、E7 mRNA发生杂交。接下来，通过依次杂交预扩增剂和HRP偶联的标记探针来扩增杂交信号。然后使用显色剂检测信号，并在标准明场显微镜下观察，获得的结果显示HPV E6/E7 mRNA信号在HPV阳性肿瘤中表现为点状棕褐色沉淀物，而在HPV阴性肿瘤中则无此现象。RRA探针检测法采用了一种新颖且专有的探针设计策略，用于昆虫杂交。它能够实现单分子可视化和靶标定量。该技术为生物标志物研究和诊断试剂开发领域的研究人员提供了途径，可用于识别和验证通过宏转录组学或下一代测序研究发现的任何RNA生物标志物。大多数具有IHC或原位杂交实验经验的科研人员均可快速掌握该方法。现在我将为您演示整个操作流程，重点介绍关键步骤，以帮助您掌握该技术。用于此RNA原位杂交技术检测的组织样本需经过福尔马林固定，并包埋于石蜡中，切片厚度为5±1微米，置于载玻片上，检测前至少放置1小时。将载玻片放入干燥烘箱中，在 60 摄氏度下烘烤；同时准备杂交炉，将温度升至 40 摄氏度，并在湿度控制托盘中放入加湿纸。加入 50 毫升蒸馏水至加湿纸上，使其完全润湿。将盖好的托盘插入烘箱中，使用前至少预热 30 分钟。通过将 10 倍预处理溶液用蒸馏水稀释，配制 700 毫升 1 倍预处理二号溶液。将1×预处理液2加热至沸腾，并将温度维持在100至104摄氏度之间，同时防止过度沸腾。在通风橱内，通过将预热的50×洗涤缓冲液用蒸馏水稀释，配制3升1×洗涤缓冲液。准备二甲苯、70%乙醇和100%乙醇用于脱蜡和脱水。配制50%伊红染色液以及0.01%氨水或蓝化试剂用于染色后处理。将目标探针于40摄氏度预热10分钟。将RTU检测试剂盒中的所有试剂（除DAB显色剂A液和B液外）恢复至室温。开始检测前，将烘烤过的组织切片浸入二甲苯中脱蜡两次，每次5分钟，期间频繁振荡。再用100%乙醇脱水两次，每次3分钟，期间频繁振荡。室温下空气干燥5分钟，然后使用疏水屏障笔在组织切片周围画出疏水屏障。通过将组织切片在预处理液一中室温孵育10分钟，开始切片的预处理。此步骤可淬灭内源性过氧化物酶活性。用蒸馏水冲洗。随后，将组织切片在预处理液二中于沸水浴条件下孵育15分钟，以回收RNA；孵育结束后，用蒸馏水冲洗两次，用于蛋白质消化。接着用预处理液三处理组织切片，并在杂交炉中于40摄氏度孵育30分钟。30分钟孵育结束后，用蒸馏水将组织切片冲洗两次。下一步是使用探针混合物进行靶标探针杂交，该探针混合物可检测七种高危型HPV基因型（HPV 16、18、31、33、35、52和58）的E六E七mRNA。将HPV探针、泛素C探针和细菌基因DAP B探针对应分别加到三个相邻的组织切片上。在杂交炉中40摄氏度孵育两小时，于两小时孵育结束后进行。在室温下用洗涤缓冲液漂洗组织切片两次，每次两分钟，以进行信号扩增。首先，在杂交炉中40摄氏度条件下，用AMP 1预放大剂孵育组织切片30分钟。在室温下用洗涤缓冲液冲洗两次，每次两分钟。后续信号放大步骤包括在40摄氏度下，按照指定时间依次孵育组织切片与以下试剂，并在每次孵育后于室温下用洗涤缓冲液冲洗两次。每次孵育后，加入AMP 2背景抑制剂，孵育15分钟。将AMP三号放大剂作用30分钟，AMP四号标记探针作用15分钟。随后，在用洗涤缓冲液冲洗两次后，于室温下用AMP五号孵育组织切片30分钟，再于室温下用AMP六号孵育15分钟，接着再次用洗涤缓冲液冲洗两次。进行信号检测时，通过等体积混合棕色A液和棕色B液，配制1:1的DAB显色液。将该溶液加入载玻片，室温孵育10分钟。用蒸馏水冲洗两次。将组织切片在50%苏木精溶液中室温复染2分钟，然后用蒸馏水冲洗，直至载玻片透明而组织仍保留着色。将载玻片在0.01%氨水溶液中浸染5次，随后在蒸馏水中浸洗5次。接着将组织切片依次在70%乙醇、100%乙醇和100%乙醇中各孵育2分钟进行脱水，最后在二甲苯中处理5分钟。最后，使用基于二甲苯的封片介质封片。以下是头颈部鳞状细胞 Sonoma 的福尔马林固定石蜡包埋切片染色后的示例图像。在 HPV 阳性病例中，高危型 HPV 探针在肿瘤细胞中检测到强烈的点状信号，插图中 40 × 放大倍数下可清晰观察到该结果。阳性对照UBC探针在肿瘤细胞和间质细胞中均检测到多个点状的胞质信号。在HPV阴性病例中，阴性对照DAP B探针显示背景干净；HR HPV探针和DAP B探针均未检测到信号，而UBC探针检测到强信号。HPV状态判定的评分需对每例病例的三张切片进行全面观察。以阴性对照DAP B切片的染色水平作为临界值，HPV阳性定义为在DAP B切片信号基础上出现点状、胞质和/或核内染色。若操作正确，RNA scope检测可在八小时内完成。每一步均需加入足量溶液，完全覆盖整个组织区域，这一点至关重要。在各步骤之间，通过轻弹载玻片去除任何残留缓冲液也非常重要，同时需保持载玻片呈白色。Rescope 技术可用于检测任何物种的任何细胞或组织中的几乎所有 RNA 生物标志物。

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RNAscope的<em&gt;原位</em&gt;检测转录活性的人类乳头状瘤病毒在头颈部鳞状细胞癌

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