用于评估生物材料血管化的全层皮肤缺损模型 体内

本实验的总体目标是可视化组织工程构建物中的血管。通过在小鼠背部创建标准化的全层皮肤缺损来实现该目标。随后，将组织工程材料的样品植入皮肤缺损处。

然后在观察期结束时，将材料植入并放置于透射照明装置中。最后，使用标准数码相机获取血管网络的高分辨率照片。最终，利用Vest egg工具软件对血管网络进行数字分割和定量分析。

与显微镜、计算机断层扫描或磁共振成像等现有方法相比，该技术的主要优势在于能够对生物材料内所有新生功能性血管的血管化过程进行有效的时间和因果关系可视化与定量分析。该方法可为真皮替代材料的血管化过程提供深入见解，也可应用于其他模式生物或其他器官的血管化研究。

首先，使用12毫米的活检打孔器制备支架样本，例如从牛源性胶原蛋白基底皮肤替代材料上获取，并裁剪直径为14毫米的圆形涤纶网片，用于放置在每个支架下方。麻醉小鼠后，通过脚趾夹捏法检测麻醉深度，并根据文本方案去除背部毛发。将动物置于俯卧位，使用细尖永久性记号笔标记小鼠背部的中线。

确定一个切除区域，位置不宜过于靠近中线，以防止动物自行移除支架。使用10毫米活检打孔器，通过将打孔器小心地压向皮肤，制备圆形的双侧缺损。用镊子勾勒切除区域，轻轻提起已标记的皮肤，沿标记的圆形线用手术剪进行切开。

如果出现出血，使用无菌纱布小心按压该区域，以留出放置钛坦网片的空间。在伤口边缘处将皮肤与皮下组织进一步分离，额外扩展两到四毫米。将网片直接置于创面床，并置于伤口边缘下方的缺损处。

然后将支架直接放置在网片上。使用四到六个单结缝合支架，使相邻的伤口边缘略微覆盖支架边缘。接着在缺损部位上方缝合一层透明伤口敷料，以保护支架，同时便于对伤口区域进行观察。

每天通过监测动物的运动活性、体重、疼痛迹象、对敷料的耐受性以及自残行为来评估其总体状态。同时，监测伤口区域是否有出血、局部和全身感染迹象以及敷料的位置。在预定时间点处死动物后。

根据文字方案，使用永久性记号笔标记包含支架的切除部位。使用剪刀或手术刀沿标记线进行钝性切除，切开皮肤，将整个皮肤（包括支架和网片）从下方组织上分离下来，并将组织展开后倒置放入培养皿中。为观察样本，将其放置在透射照明装置上。

在宏模式下，拍摄完整支架以及与之面积相等的正常皮肤区域的图像，并将图像以 TIFF 格式保存，用于后续的数字分析。下载 ves EQ 工具软件后，打开图像，通过按下退格键选择待分析的兴趣区域，然后按下反选按钮。

为了以白色显示血管网络，选择图像血管增强滤波器，进行滞后阈值处理和顶部帽状变换，并计算此前所有步骤中的血管增强效果。滚动以放大或缩小图像。通过选择首个阈值或血管覆盖率来分割血管图，使得所有哪怕略微类似血管的像素均被标记为血管。

点击计算。要预览您的选择，请选择第二个阈值或背景覆盖，以便仅将特别类似血管的像素标记为血管。要计算血管的长度及其覆盖的总面积，请点击图像、图像统计和二值图像统计。

血管长度的最佳估算方法是预先将血管网络进行细化，使其宽度为一个像素。为此，在计算前需对图像进行形态学滤波和骨架化处理。血管面积与血管长度的比值可反映感兴趣区域内的血管尺寸。

如有必要，通过仅选择目标血管来消除伪影。在选择模式下，单击后按退格键将选定的血管复制到新图像中。最后，以相同参数分析天然皮肤区域作为支架对照，将天然组织的值设定为100%，并将支架的数值与该值进行比较。

例如，如果正常组织中白色像素的百分比为30%，而支架中为15%，则表示支架总面积的50%已实现血管化。请注意，这些数值对应于整张图像的面积，因此有必要根据此处所示所选区域的面积进行校正。

植入组织两周后，透射照明可清晰显示整个组织样本中宽度达30微米的血管结构，该样本包含天然组织和植入的支架材料。通过数字分割分析，观察到支架内的血管化水平为62.28 ± 8.6%，与天然皮肤相比具有可比性。在进行该操作时，需注意创建可重复的全层皮肤缺损，并将生物材料可靠地固定于伤口处。

按照此操作步骤，扩增的组织可用于进一步分析，如组织学或RNA与蛋白质表达分析。