Name: 谱系重编程的成人大脑的周细胞源性细胞诱导成神经细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-12T21:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: 了解如何利用逆转录病毒载体将人脑周细胞重编程为诱导神经元。该方法通过表达Sox2和Ascl1转录因子实现谱系转换，为脑损伤修复提供了无需移植的内源性细胞治疗新策略。

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我们感谢 Magdalena Götz 博士在本实验方案开发过程中提供的建议。感谢 Marius Wernig 博士（斯坦福大学）慷慨提供 sox2 编码序列。我们还非常感谢 Alexandra Lepier 博士在病毒制备方面的帮助。本研究得到了德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft，项目号：BE 4182/2-2）和德国联邦教育与研究部（BMBF，项目号：01GN1009A）对 B.B. 的资助，以及巴伐利亚州科学、研究与艺术部对 M.K. 和 B.B. 的资助。C.S. 获得了德-斯洛文尼亚双边 SYSTHER-INREMOS 虚拟研究所（德国和斯洛文尼亚联邦教育与研究部）以及德国研究基金会（DFG，SFB 824）的经费支持。

1. 成人人类脑细胞的分离与培养
涉及人体组织的实验应遵循所有关于将人体材料用于科研目的的相关政府和机构法规。本方案的制定已获得慕尼黑大学医学院伦理委员会的批准，并取得了所有患者的书面知情同意。
本方案采用患有颞叶癫痫或其他深部非创伤性、非恶性病变的男女患者的标本，建立了人成年大脑皮层的培养方法。手术室获取的组织仅包含通向脑部病变区域的路径部分，因此被视为健康组织。患者的年龄范围为19至70岁。
<ol>
	<li>通过向含 GlutaMAX 的高糖 DMEM 培养基中加入热灭活的胎牛血清（FCS），配制终浓度为 20% FCS 的生长培养基。在总共 500 ml 的生长培养基中加入 5 ml 青霉素/链霉素。所有需要无菌培养条件的操作步骤均须在适当的层流罩内进行。</li>
	<li>将手术室获取的成人人类脑活检组织置于含 CaCl2 和 MgCl2 的 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）中，并添加 HEPES（终浓度 10 mM），冰上保存直至处理。应尽快开始处理。</li>
	<li>为开始组织解离成单细胞，将组织转移至 65 mm 培养皿中，使用两把无菌的一次性解剖刀将其切碎成小块。用于酶解消化时，在 15 ml 锥形管中加入 3–6 ml TrypLE，于 37 °C 水浴中孵育 15–30 分钟。</li>
	<li>加入 1 体积预热的生长培养基以促进解离，先用 5 ml 一次性移液管，再用玻璃巴斯德移液管，轻柔地将含有组织碎片的溶液上下吹打，直至细胞悬液均匀。通常仍会残留少量组织碎片，主要为白质成分。</li>
	<li>以 157 × g 离心 5 分钟，将沉淀重悬于适量生长培养基中（每未包被的 T75 培养瓶加 10 ml）。每 5–10 mm 直径大小的活检组织使用一个 T75 培养瓶，更大样本可依此比例推算。</li>
	<li>将细胞置于 37 °C、含 5% CO2 和 5% O2 的培养箱中培养。</li>
	<li>每 3–4 天更换一半培养基，直至细胞达到汇合状态。此过程通常需要最多两周时间（称为第 0 代 [P0]）。</li>
</ol>
2. 体外 成人人类脑细胞的扩增与表征
<ol>
	<li>体外扩增：
	<ol>
		<li>吸除培养基，并用室温保存的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，然后加入 3 ml TrypLE。</li>
		<li>在 37 °C 下孵育 5–10 分钟，直至大多数细胞脱落；轻轻敲击培养瓶以促进细胞脱落；加入 3 倍体积的生长培养基后，将细胞转移至 15 ml 锥形管中，在 157 × g 条件下离心 5 分钟，随后将细胞重悬于适量的生长培养基中。</li>
		<li>以 1:3 的传代比例将细胞接种至新的 T75 细胞培养瓶中，以获得最佳产量。 
		注意：这些细胞已传代至 P5 代，未见重编程效率下降的迹象。在 P0 代时，培养物中含有相当比例的内皮细胞（通过 CD34 表达评估），但在后续传代中其数量变得可忽略不计。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>成人人类脑细胞培养物的表征：
	<ol>
		<li>免疫细胞化学：
		<ol>
			<li>为进行细胞表征，将约 60,000 个细胞接种于 24 孔组织培养板中经多聚-D-赖氨酸包被的玻璃盖玻片上，每孔加入 500 μl 新鲜生长培养基，在 37 °C、5% CO2 和 5% O2 条件下孵育。</li>
			<li>对培养的人类脑细胞进行免疫细胞化学分析时，移除培养基，并用 1 ml PBS 洗涤 3 次&#160;。</li>
			<li>加入 500 μl 含 4% 多聚甲醛的 PBS，在室温下固定 15 分钟。</li>
			<li>将玻璃盖玻片转移至适当的湿化染色盒中，用含 3% 牛血清白蛋白（BSA）和 0.5% Triton X-100 的 80 μl PBS 在室温下封闭 1 小时。</li>
			<li>将一抗用相同溶液稀释（稀释比例见特定试剂与设备表），在 4 °C 过夜孵育或室温孵育 1 小时。 
			注意：在此培养阶段，有相当比例但数量可变的细胞对血小板源性生长因子受体 β（PDGFRβ）、分化簇 146（CD146）、NG2 硫酸软骨素蛋白聚糖以及平滑肌肌动蛋白（SMA）呈免疫阳性，即微血管相关周细胞的特征性标志物。仅有少数细胞（&#60;1%）表达星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和 S100β。此外，在此阶段的培养物中应不存在表达神经元标志物 βIII-微管蛋白的细胞。使用多种一抗组合进行不同标志物的共标记。通过逆转录及定量实时聚合酶链反应可进一步验证胶质细胞、神经元、内皮细胞和周细胞标志物的表达（本方案未描述该步骤）。</li>
			<li>一抗孵育后，用 1 ml PBS 洗涤三次，向染色液中加入相应二抗（适当稀释），室温避光孵育 1 小时。用 PBS 洗涤细胞 3 次&#160;。如需，在封片前加入 DAPI 染色 5 分钟（室温）。</li>
			<li>使用抗荧光淬灭封片剂，通过落射荧光显微镜或共聚焦显微镜观察盖玻片。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>流式细胞术：
		<ol>
			<li>为使用流式细胞术分析表面标志物表达，将细胞在未包被的 T25 或 T75 细胞培养瓶中培养至完全汇合。</li>
			<li>使用前述方法用 TrypLE 消化细胞，并重悬于含 PBS + 0.5% BSA 的染色液中。每项染色反应将 100,000–200,000 个细胞重悬于 100 μl 染色液中。为每种抗体（CD146-FITC、CD140b-PE、CD34-APC、CD13-FITC 及相应的同型对照抗体）分别设置单染反应。</li>
			<li>将荧光素偶联抗体直接加入细胞悬液的染色液中（稀释比例见特定试剂与设备表），在 4 °C 避光孵育 30 分钟。</li>
			<li>用 500 μl PBS 洗涤细胞三次，每次洗涤后在 157 × g 条件下离心 5 分钟。</li>
			<li>将细胞沉淀重悬于 0.5–1 ml 染色液中，经 70 μm 细胞滤网过滤后转移至 FACS 管中。样品需避光保存。</li>
			<li>上机前将样品涡旋混匀。</li>
			<li>为分析活细胞并排除碎片和细胞聚集体，根据 FSC-A 和 SSC-A 设门。通过 FSC-A 和 FSC-W 排除细胞双联体。为确定细胞表面标志物的正确设门条件，使用与相应荧光素偶联的同型对照抗体设定门控，然后确定抗体结合细胞的比例。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 通过荧光激活细胞分选富集周细胞来源的细胞
<ol>
	<li>在转导前，通过使用70 μm喷嘴的FACS分选对悬浮于生长培养基中的周细胞群体进行纯化。使用CD34-APC联合CD140b-PE和CD146-FITC标记物筛选周细胞。分选CD34阴性、CD140b阳性和CD146阳性细胞。</li>
	<li>将分选后的细胞收集至生长培养基中，接种于24孔组织培养板内经多聚-D-赖氨酸包被的玻璃盖玻片上，于37 °C、5% CO2和5% O2条件下培养。</li>
	<li>分选后48小时，更换为新鲜生长培养基，并按照&#160;方案&#160;4所述进行转导。</li>
</ol>
4. 逆转录病毒转导周细胞来源细胞并重编程为诱导神经元
注意：处理逆转录病毒颗粒时，请参考当地的生物安全指南。在德国，使用此处所采用的逆转录病毒需要达到生物安全二级水平。有关逆转录病毒颗粒的制备，请参见方案6。用于重编程的逆转录病毒载体构建信息请参见 Karow 等（2012）。逆转录病毒使用 VSV-G（水疱性口炎病毒糖蛋白）进行假型化5。具体制备方法请参见 Gavrilescu&#160;等6。
<ol>
	<li>逆转录病毒转导前 24 小时，将约 60,000 个细胞接种至 24 孔组织培养板中经多聚-D-赖氨酸包被的玻璃盖玻片上，每孔加入 500 μl 新鲜培养基，在 37 °C、5% CO2 和 5% O2 条件下培养。</li>
	<li>次日，弃去原培养基，更换为 500 μl 新鲜预温的培养基，并加入 1 μl 含相应浓缩病毒颗粒的上清液（对照组使用 pCAG-IRES-dsred，尤其在实验室建立该方案时），实验组使用 pCAG-ascl1-IRES-dsred 或 pCAG-sox2-IRES-gfp。</li>
	<li>再过一天后，移除含病毒颗粒的培养基，加入 1 ml 新鲜预温的 B27 分化培养基（由 49 ml 高糖 DMEM（含 GlutaMAX）和 1 ml B27 无血清添加剂组成）。将细胞继续在 37 °C、5% CO2 和 5% O2 条件下培养 4–8 周，期间不更换培养基，因为重复换液会对逐渐成熟的诱导神经元（iNs）造成损伤。</li>
</ol>
5. 通过免疫细胞化学法鉴定诱导神经元
<ol>
	<li>为确定转导细胞的细胞身份，特别是验证其获得神经元表型，应对神经元抗原（如 bIII-tubulin、MAP2 和 NeuN）进行免疫细胞化学染色（抗体及其相应稀释比例见特定试剂与设备表；操作步骤参照 2.2.1 所述方法）。</li>
	<li>为促进PdiNs的成熟，可将这些细胞与来自E14小鼠大脑皮层的神经元进行共培养。具体操作为：分离大脑皮层组织，并使用火焰抛光的玻璃巴斯德移液管通过机械法解离组织。在用编码sox2和ascl1的逆转录病毒转导后的2-3周，将10,000-50,000个小鼠神经元加入至周细胞来源细胞的培养物中，并继续培养。转导的细胞可通过报告基因（GFP和dsRed）的表达与小鼠神经元区分，可采用活细胞落射荧光观察，或通过GFP与dsRed的免疫细胞化学染色进行鉴定。</li>
	<li>为评估小鼠神经元向PdiNs形成突触的情况，对囊泡神经递质受体（如囊泡谷氨酸转运蛋白1（vGluT1））进行免疫细胞化学染色。</li>
	<li>检测转导细胞的电学特性（即 产生动作电位的能力）以及通过膜片钳电生理技术验证功能性突触的形成。有关实验步骤的详细信息，请参见 Heinrich 等 (2011).</li>
</ol>

<ol><li>Caiazzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+generation+of+functional+dopaminergic+neurons+from+mouse+and+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts.</a> Nature. 476, 224-227 (2011).</li>
<li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+integration+of+dopaminergic+neurons+directly+converted+from+mouse+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Functional integration of dopaminergic neurons directly converted from mouse fibroblasts.</a> Cell stem cell. 9, 413-419 (2011).</li>
<li>Duan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+water+deficit%2C+ABA%2C+and+provenances+in+Picea+asperata%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+experimental+botany%22%5BJournal%5D)">Interactions between water deficit, ABA, and provenances in Picea asperata.</a> Journal of experimental botany. 58, 3025-3036 (2007).</li>
<li>Heinrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directing+astroglia+from+the+cerebral+cortex+into+subtype+specific+functional+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Directing astroglia from the cerebral cortex into subtype specific functional neurons.</a> PLoS Biol. 8, (2010).</li>
<li>Heinrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+subtype-specific+neurons+from+postnatal+astroglia+of+the+mouse+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex.</a> Nat Protoc. 6, 214-228 (2011).</li>
<li>Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+replication-defective+retrovirus+by+transient+transfection+of+293T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells.</a> J Vis Exp. , (2007).</li>
<li>Karow, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+pericyte-derived+cells+of+the+adult+human+brain+into+induced+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of pericyte-derived cells of the adult human brain into induced neuronal cells.</a> Cell stem cell. 11, 471-476 (2012).</li>
<li>Ortega, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+an+adherent+cell+culture+of+the+mouse+subependymal+zone+to+study+the+behavior+of+adult+neural+stem+cells+on+a+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Using an adherent cell culture of the mouse subependymal zone to study the behavior of adult neural stem cells on a single-cell level.</a> Nat Protoc. 6, 1847-1859 (2011).</li>
<li>Ladewig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecules+enable+highly+efficient+neuronal+conversion+of+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Small molecules enable highly efficient neuronal conversion of human fibroblasts.</a> Nat Methods. 9, 575-578 (2012).</li>
<li>Espuny-Camacho, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyramidal+neurons+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+integrate+efficiently+into+mouse+brain+circuits+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo.</a> Neuron. 77, 440-456 (2013).</li>
<li>Davila, J., Chanda, S., Ang, C. E., Sudhof, T. C., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+reduction+in+oxygen+tension+enhances+the+induction+of+neurons+from+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Acute reduction in oxygen tension enhances the induction of neurons from human fibroblasts.</a> J Neurosci Methods. 216, 104-109 (2013).</li>
<li>Vierbuchen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+fibroblasts+to+functional+neurons+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors.</a> Nature. 463, 1035-1041 (2010).</li>
<li>Pfisterer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+human+fibroblasts+to+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108, 10343-10348 (2011).</li>
<li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Integration-free+and+Region-Specific+Neural+Progenitors+from+Primate+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Generation of Integration-free and Region-Specific Neural Progenitors from Primate Fibroblasts.</a> Cell Rep. 3, 1580-1591 (2013).</li>
<li>Yang, N., Ng, Y. H., Pang, Z. P., Sudhof, T. C., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+neuronal+cells%3A+how+to+make+and+define+a+neuron%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Induced neuronal cells: how to make and define a neuron.</a> Cell Stem Cell. 9, 517-525 (2011).</li>
<li>Pang, Z. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+human+neuronal+cells+by+defined+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induction of human neuronal cells by defined transcription factors.</a> Nature. 476, 220-223 (2011).</li>
<li>Yoo, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-mediated+conversion+of+human+fibroblasts+to+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-mediated conversion of human fibroblasts to neurons.</a> Nature. 476, 228-231 (2011).</li>
<li>Son, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+mouse+and+human+fibroblasts+into+functional+spinal+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Conversion of mouse and human fibroblasts into functional spinal motor neurons.</a> Cell Stem Cell. 9, 205-218 (2011).</li>
<li>Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Sudhof, T. C., Wernig, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+mouse+fibroblasts+to+self-renewing%2C+tripotent+neural+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109, 2527-2532 (2012).</li>
<li>Thier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+fibroblasts+into+stably+expandable+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells.</a> Cell Stem Cell. 10, 473-479 (2012).</li>
<li>Yang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+oligodendroglial+cells+by+direct+lineage+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Generation of oligodendroglial cells by direct lineage conversion.</a> Nat Biotechnol. 31, 434-439 (2013).</li>
<li>Najm, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor-mediated+reprogramming+of+fibroblasts+to+expandable%2C+myelinogenic+oligodendrocyte+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Transcription factor-mediated reprogramming of fibroblasts to expandable, myelinogenic oligodendrocyte progenitor cells.</a> Nat Biotechnol. 31, 426-433 (2013).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本实验方案描述了 体外 从成人人大脑皮层中分离出周细胞来源的细胞后，对其进行扩增和富集，并通过逆转录病毒介导表达神经发生相关转录因子 Sox2 和 Ascl1，将其转化为诱导性神经元。该方案提供了一种实验方法 体外 研究脑内常驻细胞直接转化为神经元，以及可能转化为胶质细胞的谱系转分化系统，旨在最终将这种直接转化策略应用于临床 体内 成年大脑的环境
技术注意事项
在本研究中，我们使用了来自19至70岁、两性患者的脑组织。我们未观察到重编程效率在性别或年龄之间存在明显差异7。然而，仍建议记录这些信息，因为可能存在一些较为细微的差异，但未被我们注意到。
建议在组织样本转移至实验室后尽快开始处理。由于组织在转移给实验人员之前在手术室中停留的时间存在一些未知因素，因此难以完全控制。我们估计，在本研究7中，组织从患者脑部切除至开始培养程序的时间间隔为2至6小时，且样本在此期间始终保存在冰上。在...

与将体细胞重编程为诱导性多能干细胞（iPSCs）——后者具有多种分化潜能——不同，直接重编程旨在实现一种特定细胞类型向另一种细胞类型的直接转化。在疾病建模及潜在的细胞治疗应用背景下，这两种重编程策略各有优劣。iPSC重编程（i）可提供近乎无限的细胞来源；（ii）允许进行基因工程操作；（iii）具备几乎无限的分化潜能。然而，iPSC的主要缺点包括未分化细胞的致瘤风险（畸胎瘤形成） 体内）以及对 离体 培养及后续移植，如果这些细胞将用于细胞治疗。相反，直接谱系重编程受限于目标细胞产量较低，这与起始细胞群体中靶向细胞的数量直接相关，但其优势在于谱系重编程细胞在移植后似乎不具有致瘤风险1,2此外，直接重编程甚至可以实现 原位, 即 在需要这些细胞的器官内部，从而避免了移植的需要。
鉴于此，本实验室致力于探索将脑内常驻细胞直接谱系重编程为诱导性神经元（iNs）的可能性，作为一种针对神经退行性疾病的新型细胞治疗策略。可作为谱系重编程潜在细胞靶点的脑内常驻细胞包括多种类型的巨胶质细胞（星形胶质细胞、NG2细胞和少突胶质细胞）、小胶质细胞以及微血管相关细胞（内皮细胞和周细胞）。我们已对这些 体外 新生小鼠大脑皮层星形胶质细胞的重编程潜能3-5在寻找适用于成年人大脑直接谱系重编程的类似理想细胞来源时，我们发现了一类可成功重编程为诱导性神经元（iNs）且具有周细胞特征的细胞群体。本文描述了如何从成年人大脑活检组织中分离、扩增和富集这类细胞的实验方案 体外，最终成功重编程了其中相当大比例的细胞 体外 将扩增的细胞（扩增率在25-30%范围内）转化为诱导性神经元（iNs）。通过逆转录病毒介导的同时共表达两种转录因子sox2和ascl1，可实现重编程。这些诱导性神经元（PdiNs）表现出重复性动作电位放电的能力，并可作为其他神经元的突触靶标，表明其具备整合入神经网络的功能。本方案提供了一种简便的流程，用于分离成人人类脑部周细胞并将其转分化为诱导性神经元（iNs）。

<table><tbody><tr><td>抗 CD140b-PE</td><td>BD Biosciences</td><td>558821</td><td>使用比例 1:100</td></tr><tr><td>抗 CD146-FITC</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA2141FT</td><td>使用比例 1:100</td></tr><tr><td>抗 CD13-FITC</td><td>AbD Serotec</td><td>MVA1270A488T</td><td>使用比例 1:100</td></tr><tr><td>抗 CD34-APC</td><td>BD Biosciences</td><td>560940</td><td>使用比例 1:100</td></tr><tr><td>抗 PDGFR&amp;beta;</td><td>Cell Signaling</td><td>3169S</td><td>使用比例 1:200</td></tr><tr><td>抗 CD146</td><td>Abcam</td><td>Ab75769</td><td>使用比例 1:400</td></tr><tr><td>抗 NG2</td><td>Millipore</td><td>AB5320</td><td>使用比例 1:400</td></tr><tr><td>抗 SMA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2547</td><td>使用比例 1:400</td></tr><tr><td>抗 &amp;beta;III-微管蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8660</td><td>使用比例 1:400</td></tr><tr><td>抗 MAP2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4403</td><td>使用比例 1:200</td></tr><tr><td>抗 GFAP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3893</td><td>使用比例 1:600</td></tr><tr><td>抗 GFP</td><td>Aves Labs</td><td>GFP 10-20</td><td>使用比例 1:1,000</td></tr><tr><td>抗 RFP</td><td>Chromotek</td><td>5F8</td><td>使用比例 1:500</td></tr><tr><td>抗 S100&amp;beta;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2532</td><td>使用比例 1:300</td></tr><tr><td>抗 NeuN</td><td>Millipore</td><td>MAB377</td><td>使用比例 1:200</td></tr><tr><td>抗 GABA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2052</td><td>使用比例 1:500</td></tr><tr><td>抗 钙视网膜蛋白</td><td>Millipore</td><td>AB5054</td><td>使用比例 1:500</td></tr><tr><td>抗 vGluT1</td><td>SYnaptic SYstems</td><td>135511</td><td>使用比例 1:1,000</td></tr><tr><td>大鼠 IgG1 同型对照 FITC</td><td>AbD Serotec</td><td>11-4301-81</td><td>使用比例 1:100</td></tr><tr><td>大鼠 IgG1 同型对照 PE</td><td>AbD Serotec</td><td>12-4301-81</td><td>使用比例 1:100</td></tr><tr><td>大鼠 IgG1 同型对照 APC</td><td>AbD Serotec</td><td>17-4301-81</td><td>使用比例 1:100</td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Invitrogen</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>DMEM，高糖，含 GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>61965</td><td></td></tr><tr><td>B27 无血清添加剂</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Invitrogen</td><td>10106-169</td><td>56 &amp;deg;C 水浴 30 分钟进行热灭活</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>HBSS（Hanks 平衡盐溶液）</td><td>Invitrogen</td><td>24020-091</td><td></td></tr><tr><td>不含 CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 和 MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 的杜氏磷酸盐缓冲液（D-PBS，1×）</td><td>Invitrogen</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>聚-D-赖氨酸氢溴酸盐（PDL）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0899</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛（PFA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1648</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>DAPI（4&amp;prime;,6-二脒基-2-苯基吲哚）双乳酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>042M4005</td><td></td></tr><tr><td>Aqua-Poly/Mount 封片剂</td><td>Polysciences</td><td>18606-20</td><td></td></tr><tr><td>聚丙烯圆底离心管&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>带细胞筛盖的聚苯乙烯圆底离心管&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>24 孔板</td><td>Orange Scientific</td><td>5530305</td><td></td></tr><tr><td>75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 培养瓶</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 培养瓶</td><td>Greiner Bio-One</td><td>690175</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 一次性移液管</td><td>Sarstedt</td><td>86.1254.001</td><td></td></tr><tr><td>玻璃巴斯德移液管（150 mm）</td><td>Fisherbrand</td><td>FB50251</td><td></td></tr><tr><td>直径 12 mm 玻璃盖玻片</td><td>Menzel</td><td>CB00120RA1</td><td></td></tr><tr><td>一次性手术刀片&amp;nbsp;</td><td>B. Braun</td><td>5518083</td><td></td></tr><tr><td>组织培养皿&amp;nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>633180</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 锥形离心管</td><td>BD Biosciences</td><td>352095</td><td></td></tr><tr><td>层流罩</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心机及配带 15 ml 和 50 ml 离心管适配器的摆动转子</td><td>Hettich Lab Technology</td><td>1406</td><td></td></tr><tr><td>流式细胞分选仪：FACSAria l 配套 FACSDiva 软件&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>恒温恒湿细胞培养箱</td><td>Eppendorf Galaxy 170R</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &amp;deg;C 水浴锅</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSFlow 鞘液&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>342003</td><td></td></tr><tr><td>落射荧光显微镜 BX61</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜 LSM710</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

将成年人大脑中周细胞来源的细胞进行谱系重编程转化为诱导性神经元

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

直接将非神经元细胞转分化为诱导性神经元（iNs）可能为揭示神经发生的分子机制提供线索，并为 体外 对病变大脑进行建模或修复。鉴定出可直接转化为诱导性神经元（iNs）的大脑常驻非神经元细胞类型，可能有助于推动此类方法的实施 原位, 即 在受损脑组织内。本文描述了一种旨在鉴定来源于成人人脑并满足此前提的细胞的实验方案。该方案包括：（1）培养从成人人脑活检获得的脑皮层组织中分离的人源细胞；（2） 体外 扩增（约需2-4周）并通过免疫细胞化学和流式细胞术对培养物进行表征；（3）利用抗PDGF受体-β和抗CD146抗体通过荧光激活细胞分选（FACS）进行富集；（4）通过逆转录病毒介导转导神经发生相关的转录因子sox2和ascl1；（5）最后，在逆转录病毒转导后14天至8周内，通过免疫细胞化学对获得的周细胞来源诱导神经元（PdiNs）进行表征。在此阶段，可采用膜片钳记录技术检测iNs的电生理特性。该方案提供了一种高度可重复的操作流程，用于 体外 脑内周细胞直接转化为功能性人源神经元

该方案成功建立人成年大脑皮层组织培养后的首个结果，是鉴定培养物的细胞组成。通过细胞类型特异性蛋白的免疫细胞化学染色，可揭示来自不同患者组织样本的培养物之间存在显著的异质性（图1A）。通过流式细胞术定量，始终存在相当比例的细胞表达 PDGFRβ（平均约 75%，范围从 30% 至高达 99%）；周细胞的其他标志物如 CD146、NG2 和 CD13 通常表达水平较低（图1B）。同样，通过免疫细胞化学检测发现，培养的细胞中有一小部分亚群表达SMA。图1A). 在第0代（P0）时，通常有 &lt;CD34阳性内皮细胞约占10%，且随着传代次数增加，其数量下降至无法检测。同样，星形胶质细胞在早期传代中也仅存在可忽略的污染。此外，通常不存在表达神经干细胞、神经元或少突胶质细胞标志物的细胞。免疫细胞化学和流式细胞术结果均得到定量RT-PCR数据的充分验证。7总之，培养物中最大比例的细胞表达典型的周细胞蛋白和mRNA。在此阶段，可通过流式细胞荧光分选（FACS）进一步富集周细胞来源的细胞。当培养物纯度处于较低水平（由PDGFRβ...

靶向脑内常驻细胞进行直接谱系重编程为脑修复提供了新的前景。本文介绍了一种从成人人类大脑皮层制备富含脑内常驻周细胞的培养物，并通过逆转录病毒介导的转录因子 Sox2 和 Ascl1 表达将这些细胞转化为诱导性神经元的实验方案。

非神经元细胞直接谱系重编程为诱导性神经元（iNs）可能为揭示神经发生的分子机制提供重要线索……

以下实验的总体目标是将源自人脑寄生虫的细胞转化为诱导性神经元。该目标通过分离并培养来自手术脑组织样本的寄生虫来源细胞来实现。随后，在体外扩增后，对细胞进行寄生虫标志物的免疫标记，从而实现对这些细胞的表征以及进一步富集。然后，将寄生虫来源的细胞用编码神经元命运决定因子的逆转录病毒载体进行转导，以直接将其转化为诱导性神经元。通过针对神经元标志物βIII微管蛋白的免疫染色，获得了实验结果，证实了由谱系重编程的寄生虫来源细胞可生成诱导性神经元。与现有的方法（如成纤维细胞重编程或胚胎干细胞向神经元分化）相比，该方法的主要优势在于我们所靶向的是内源于脑部的细胞，这可能最终为无需细胞移植的脑内直接谱系转化铺平道路。以下方案根据慕尼黑大学医学院伦理委员会的批准以及所有患者在进行新鲜人脑活检前签署的书面知情同意书制定。将组织置于冰上的HBSS中，并转移至65毫米培养皿中，使用两把无菌一次性手术刀将其切碎成小块，从而将组织解离为单细胞。将组织转移至15毫升锥形管中，加入3至6毫升三联消化液，在37摄氏度水浴中孵育15至30分钟。消化反应结束后，加入等体积预热的培养基以促进细胞解离，并使用5毫升一次性移液管配合玻璃巴斯德移液管轻轻吹打重悬细胞悬液。在157 ×g下离心5分钟以沉淀细胞。用培养基重悬细胞沉淀，并将培养物转移至T75培养瓶中。将细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳和5%氧气条件下孵育。每三到四天更换一半培养基，直至细胞达到汇合状态。当细胞达到汇合状态时，吸除培养基，并用室温PBS洗涤，然后加入三毫升三联液。在37摄氏度孵育5到10分钟后，轻轻敲击培养瓶以帮助细胞脱落。离心悬浮液后，加入三倍体积的生长培养基重悬细胞，按1:3的比例将细胞传代至新的T75培养瓶中，以获得最佳产量。细胞已传代至多五次，未见重编程能力下降的迹象，且随着每次传代，内皮细胞数量将变得微乎其微。为进行免疫细胞化学实验，将约 60,000 个细胞接种至含 500 微升新鲜培养基的 24 孔组织培养板中，板内预先放置经聚-D-赖氨酸包被的玻璃盖玻片，并进行培养。将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳和5%氧气条件下培养24小时。对于培养的人脑细胞的免疫化学分析，移除培养基，并用1毫升PBS洗涤三次。加入500微升含4%多聚甲醛的PBS，孵育15分钟。在室温下。将玻璃盖玻片转移至合适的加湿染色盒中，加入 80 微升含 Triton X-100 的 P-B-S-B-S-A 封闭液，在室温下封闭 1 小时，然后加入用相同溶液稀释的一抗，在室温下孵育 1 小时或在 4 摄氏度下过夜。使用 PBS 洗涤细胞 3 次，随后加入二抗，在室温下孵育 1 小时。洗涤三次后，加入抗荧光淬灭剂并封片。使用落射荧光显微镜或共聚焦显微镜分析样品。在逆转录病毒感染前约24小时处理逆转录病毒颗粒时，应遵守当地的生物安全指南，并在上层接种约60,000个细胞。在24孔组织培养板中，将经多聚赖氨酸包被的玻璃盖玻片置于500微升新鲜生长培养基内，于37摄氏度孵育。次日。用500微升新鲜预热的生长培养基替换原有培养基，并加入1微升含有逆转录病毒颗粒的相应浓缩上清液。轻轻摇动培养板，确保病毒颗粒在孔内均匀分布。24小时后，移除含病毒颗粒的培养基，并加入1毫升新鲜预热培养基。根据文本方案所述，使用B27分化培养基，在不更换培养基的情况下将细胞继续培养4至8周，因为更换培养基可能损害正在成熟的诱导神经元，从而影响神经元表型的获得。对神经元抗原如βIII微管蛋白（beta three tubulin）、MAP2和NeuN进行免疫细胞化学染色。如本视频前面所示，对来自成人人类大脑皮层的成功建立的培养物进行免疫细胞化学分析，通过流式细胞术定量结果显示，不同患者来源的样本所建立的培养物之间存在显著的异质性。有相当一部分细胞表达PDGFRβ，而其他寄生细胞标志物如CD146、NG2和CD13的表达水平较低。同样，SMA在第0代培养细胞的一个小亚群中表达，通常CD34阳性内皮细胞比例低于10%，且随着后续传代培养，其数量下降至无法检测。同样，星形胶质细胞在早期代次中仅构成可忽略的污染。免疫植物化学和流式细胞术数据已通过定量R-T-P-C-R-A得到充分验证。在此阶段可通过离心进一步富集寄生虫来源的细胞。当培养物纯度处于较低水平时，这一点尤为重要，这一点可通过P-D-G-F-R beta表达水平反映出来。因此，我们单独或联合使用了针对P-D-G-F-R β（CD140B）的抗体，并排除任何CD34阳性污染物以进行分选。具体而言，用对照病毒转导这些细胞培养物并不会改变其表达谱，表明它们仍保持在内皮祖细胞谱系中。同样，仅通过逆转录病毒介导表达SOX2，并不会引起细胞形态的任何改变，也不会诱导β3微管蛋白的表达。相比之下，仅用编码 A SCL 一个逆转录病毒转导的细胞中，约有 10% 表达 βIII 微管蛋白，但并未获得明显的神经元形态；而共转导了 Sox2 和 A SCL 一个的细胞中，近 50% 表达 βIII 微管蛋白，其中三分之一还展现出神经元突起，表明其命运已转化为外周神经系统（PNS）样细胞。按照本实验方案操作可获得上述结果。为了进一步研究诱导神经元的成熟过程及其功能特性，可采用其他技术，如膜片钳电生理学。

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

谱系重编程的成人大脑的周细胞源性细胞诱导成神经细胞

原代人胎儿脑来源的多能性前体细胞增殖 体外...

人胎儿脑来源的前体细胞衍生少突胶质细胞培养体系

本视频展示了将基因修饰的造血祖细胞直接重编程为神经干细胞的过程。造血祖细胞表达的转录因子触发了一系列分子事件，促进其转化。随后使用特定的培养基来筛选并扩增诱导产生的神经干细胞。...

造血祖细胞直接重编程为神经干细胞

本视频展示了使用专用培养基将诱导性神经前体细胞（iNPCs）分化为神经元和星形胶质细胞的过程。...

诱导神经前体细胞向星形胶质细胞的分化

该视频展示了如何从成人人类皮肤成纤维细胞（aHDFs）生成神经元。通过使用携带神经元转录因子基因和短发夹RNA（shRNAs）的慢病毒载体对aHDFs进行重编程。shRNAs可抑制神经元转录抑制因子的表达，而神经元转录因子则激活相关基因，促使aHDFs分化为神经元。这些重编程后的aHDFs在早期和晚期神经元转化培养基中进行培养，以生成成熟的神经元。...

通过重编程人皮肤成纤维细胞生成神经元

诱导多能干细胞的生成为自体移植的获取提供了广阔的前景。然而，经历多能性状态以及繁琐的再分化过程仍然阻碍着其临床转化。本文描述了成人人类成纤维细胞的获取及其直接转化为诱导性神经前体细胞，并进一步分化为神经谱系细胞的方法。...

成年成人成纤维细胞的分离及其直接转化为可扩增的神经前体细胞

活体成像是一种用于实时研究细胞行为的强大工具。本文中，我们描述了一种对原代大脑皮层细胞进行延时视频显微镜观察的实验方案，该方法可详细检测从原代神经干细胞向分化神经元和胶质细胞谱系发育过程中各阶段的动态变化。...

利用二维培养系统对原代大脑皮层细胞进行活体成像

本文介绍了一种通过延时视频显微镜监测神经细胞群体，并结合基于软件的后期处理的稳健方案。该方法是一种强大的工具，可用于在活体成像实验中识别特定细胞群体内的生物学事件。...

活体成像联合单细胞示踪监测多种神经细胞群体的细胞生物学与谱系进展

直接神经元重编程生成的神经元可保持起始体细胞的年龄特征。本文介绍了一种基于单载体的方法，用于从成年人类供体获取的皮肤成纤维细胞中诱导生成神经元。...

由成人皮肤成纤维细胞简单高效地生成诱导神经元的高产率培养方法

本方案介绍了通过仙台病毒感染将外周血单个核细胞重编程为诱导性神经干细胞，将iNSCs分化为多巴胺能神经元，将多巴胺能前体细胞移植到单侧损毁的帕金森病小鼠模型，并评估iNSC来源的多巴胺能前体细胞用于帕金森病治疗的安全性和有效性。...

从外周单个核细胞生成诱导性神经干细胞及其向多巴胺能神经元前体细胞的分化用于移植研究

我们描述了一种将人皮肤来源的成纤维细胞重编程为诱导性神经前体细胞（iNPCs），并进一步将其分化为诱导性星形胶质细胞（iAs）的实验方案。该方法可快速、可重复地大量生成iNPCs和iAs。...

利用成纤维细胞直接转化为神经祖细胞并分化为星形胶质细胞的体外神经疾病建模

利用可诱导的转基因谱系示踪小鼠品系，通过荧光蛋白对干细胞及其子代进行永久性标记，可实现对干细胞的活化、增殖、迁移和/或分化进行空间和时间上的分析 体内谱系示踪可揭示有关谱系定向、对干预措施的响应以及多能性方面的 novel...

成年小鼠大脑中可诱导荧光标记干细胞的谱系示踪

了解如何利用逆转录病毒载体将人脑周细胞重编程为诱导神经元。该方法通过表达Sox2和Ascl1转录因子实现谱系转换，为脑损伤修复提供了无需移植的内源性细胞治疗新策略。

将成年人大脑中周细胞来源的细胞进行谱系重编程转化为诱导性神经元

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