MALDI-质谱成像代谢物的研究苜蓿根瘤

该程序的总体目标是对植物根组织中的小分子进行可靠的多质谱成像。这是通过首先将组织样品制备成适当大小来实现的。第二步是优化 maldi 基质并将其应用于组织样本。

接下来，对样品进行 Maldi，在整个组织中收集 MSI 和 Spectra。最后一步是数据处理，其中可以识别具有生物学重要性的分析物。最终，MALDI MSI 用于检测豆科植物根瘤中存在的内源性代谢物。

这种方法可以深入了解植物根组织中存在的代谢物，但也可以应用于研究来自其他模型系统的小分子和组织，包括哺乳动物、甲壳类昆虫等。首先，从零下 80 摄氏度的冰箱中取出先前准备好的植物组织样品。然后切掉塑料低温恒温器杯并修剪掉多余的明胶，将包埋的组织安装到具有硬币大小的最佳切割温度或 OCT 介质的低温恒温器卡盘上，同时不要让 OCT 接触组织。

将低温恒温器卡盘放入设置为零下 20 摄氏度的低温恒温器盒中，直到 OCT 凝固。让卡盘和明胶在低温恒温器盒中交流平衡约 15 分钟后，使用低温恒温器将组织切片至大约一个细胞的厚度。然后，通过加热手背上载玻片的未涂层面，将每片切片安装在预冷的载玻片上。

接下来，将温玻片的 ITO 涂层面靠近冷冻组织切片，让切片粘在载玻片上，以便喷枪应用 MALDI 基质。用甲醇彻底清洁喷枪溶液容器和喷嘴，并用 DHB 基质溶液填充溶液容器。将喷枪放在距离样品约 35 厘米处，在载玻片表面涂抹 10 至 15 层基质，每次喷涂间隔 10 秒和 30 秒干燥时间。

完成后，用甲醇彻底清洁喷枪以避免堵塞 由于基质溶液，重要的是要注意，虽然喷枪更容易获得，但自动基质喷涂系统通常会产生更均匀和可重复的基质覆盖，用于 maldi 的升华应用 Matrixx 称量 300 毫克 DHB 进入升华室底部。用双面导电胶带将载玻片粘在冰冷的手指上，组织切片朝下。如果载玻片太大，请剪掉它。

对于升华室，将升华室的上半部分和下半部分与 C 夹一起夹住。然后将升华室放入室温的加热套中。连接真空吸尘器，将冰块加入冷水中至顶部储液器。

真空泵打开后，等待 15 分钟，然后打开加热罩。10 分钟后，关掉暖气，关闭真空阀门并关闭真空泵。腔室冷却至室温后，打开阀门释放真空压力并取出样品。

接下来，用校正液笔在样品的每个角落上标记一个加号图案，用作示教点。将载玻片放入 Maldi 载玻片转接板中，并使用扫描仪拍摄样品的光学图像。检查计算机上的图像并旋转图片，使其出现在屏幕上。

样品将以相同的方向放入仪器中。使用仪器公司提供的软件设置图像采集文件，光栅步长为 50 微米，激光直径等于或小于光栅步长眼睛。此时，将光学图像加载到软件中，并将板与光学图像对齐。

校准仪器后，指定要使用 MSI 分析的组织区域，包括载玻片上要用作空白的纯基质点。在此之后，在数据采集后开始采集，在供应商提供的软件中打开成像文件，并通过从质谱中选择感兴趣的特定质荷比来提取离子图像。使用该软件，创建目标特定分析物列表，以便进一步鉴定。

执行精确质量数数据库搜索，以确定目标分析物的推定鉴定结果。为了确认精确质量数数据库搜索的推定鉴定结果，将目标分析物的 ms MS 与标准品、文献和/或碎裂预测软件的 msms 谱图相匹配，此处显示了 mego Tula 根结节切片的光学图像。

这是分别使用喷枪自动喷雾器和升华的基质覆盖率和晶体尺寸的光学图像示例。喷枪应用方法可生成大晶体和小晶体。自动喷雾法产生大小均匀的小晶体，而升华产生一层均匀的基质。

DHB 等传统基质在 500 道尔顿以下的较低质量范围内产生许多离子。这些基质离子会干扰此范围内代谢物的检测。此处显示的是 DHB 基质与涂有 DHB 基质的根瘤组织的 MS 谱图。

使用 MS 图像可以将基质峰与真实代谢物区分开来。单击峰时，将提取离子图像并显示与光学图像重叠。那些产生图像的图像对组织有明显定位并且不存在于仅成像的基质区域中的峰被认为是代谢物，此处显示的是根瘤组织中发现的代谢物的几个代表性离子图像。

虽然此处显示了对应于基质相关峰的 MS 图像示例，但该图像显示了对根瘤组织的明显定位，并且在成像的仅基质区域中缺乏信号。该信号显示很少的定位，并且存在于整个组织中。该信号也出现在成像的仅矩阵区域中。

非靶向代谢组学实验的最终目标是检测和确定具有生物学重要性的分析物，并鉴定感兴趣的化合物。此处显示了用 MSI 和 LCMS 检测到的一种代谢物的实例。根据高分辨率 LCMS 和 MSM MSS 谱图收集的精确质量数，该代谢物被鉴定为血红素。

该 MSMS 数据与 Shima 和 Sato 之前发布的 MSM S 光谱进行了比较，这两个 MSM S 光谱匹配。因此，根据准确的质量数据库搜索和 Ms.MS 数据与文献 Ms.MS 数据相比，将 6 1 6 0.2 的质荷比标识自信地分配为血红素。看完这个视频后，你应该对如何使用maldi质谱成像来检测和绘制生物相关代谢物的空间分布有了很好的了解，该方法可以应用于各种组织类型和模型系统中的小分子研究。