利用生物发光共振能量转移在活细胞中研究蛋白质-蛋白质相互作用

以下实验的总体目标是观察两种蛋白质与活体培养细胞之间的相互作用。该目标通过将两种目标蛋白的cDNA亚克隆至含有荧光素酶或黄色荧光蛋白（简称YFP）标签序列的质粒中，构建可在哺乳动物细胞中表达蛋白的载体来实现。第二步，将这些质粒转染至培养细胞中，从而表达YFP和荧光素酶融合蛋白。

随后向细胞中加入荧光素酶底物，以启动荧光素酶的发光反应。通过检测从荧光素酶（LUCIFERASE）到黄色荧光蛋白（YFP）的能量转移，获得结果，从而显示两种融合蛋白之间的相互作用。该技术相较于共沉淀等现有方法的主要优势在于，能够在活细胞中实时观察蛋白质-蛋白质相互作用。

该方法可通过确定患者中发现的突变是否影响蛋白质-蛋白质相互作用，从而帮助回答功能基因组学领域中的关键科学问题。本实验操作的第一步将由本实验室的博士研究生 RAB tric 演示。首先，按照文本方案中所述方法构建质粒，并根据其在 260 纳米处的吸光度估算浓度。

通过将每个质粒的碱基对数目乘以 650 道尔顿来确定其分子质量。利用浓度和分子质量计算每种质粒制备物的摩尔浓度。将质粒 DNA 制备物稀释至 36 纳摩尔的浓度。

这些将是用于制备转染用DNA混合物的工作液。该实验步骤中最困难的部分是DNA混合物的配制。为确保成功，我们会创建电子表格来预先计算每种组分的准确用量，并格外小心操作。

在配制 DN 反应混合物时，先准备第一份对照 DNA 混合物，其中包含 1800 纳克的填充质粒，加水至终体积为 20 微升。然后通过配制 5 微升的 P 启动子对照构建体，设置第二份受控 DNA 混合物。

加入填充质粒，使总DNA质量达到1800纳克。加入水，使最终体积达到20微升。制备第三种对照DNA混合液，包含5微升P look对照质粒和5微升PYFP对照质粒。

加入填充质粒和水，操作同前。最后，设置第四组对照 DNA 混合液，其中包含 5 µL 的阳性对照质粒。同样，以相同方式加入填充质粒和水。

接下来，制备用于检测目的蛋白x同源二聚化的3D NA混合物。对于每种DNA混合物，将5 µL相应的P look质粒与5 µL PYFP质粒混合，并加入填充质粒和水。然后制备用于检测一对目的蛋白X与Y相互作用的DNA混合物。对于每种DNA混合物，将5 µL相应的P look质粒与5 µL PYFP质粒混合，并加入填充质粒和水。收获一个75 cm²培养瓶中处于亚融合状态的HEK 293细胞，取总细胞量的10%稀释至13 mL培养基中。

然后将130 µL细胞悬液加入至白色透明底的96孔组织培养板的每个孔中，在培养细胞24小时之前完成加样。接下来，通过将DNA混合物的数量乘以3，计算需要转染的孔数。每孔加入6.3 µL室温无血清培养基和0.18 µL转染试剂，混匀后涡旋振荡，配制主混合液，室温孵育5分钟。

然后将20 µL无血清培养基转染试剂主混合液分装至所需数量的离心管中。每管加入2 µL相应的DNA混合液，室温孵育10分钟。最后，用每种转染混合液分别转染三个孔。

在培养细胞之前，每孔加入6.5微升转染混合物，继续培养36至48小时。为检测BRET信号，首先将活细胞荧光素酶底物以34毫克/毫升的浓度溶于DMSO中，并通过涡旋振荡溶解。

将重组的活细胞荧光素酶底物在底物稀释液中按1:1000比例稀释，底物稀释液预先温育至37摄氏度。每孔加入50微升底物稀释液，涡旋混匀。可能出现沉淀，但不会干扰检测结果。

从96孔板中吸除培养基后，向每个孔中加入50 µL稀释后的活细胞荧光素酶底物。细胞至少培养2小时后，取下96孔板盖，在化学发光仪内室温孵育10分钟。根据文本方案中的详细说明，依次测量每个孔中荧光素酶（LUCIFERASE）和黄色荧光蛋白（YFP）的发射光信号，每孔信号积分时间为10秒。

转录抑制因子 Fox P 家族成员在大脑发育过程中发挥重要作用。其基因突变与语言障碍及自闭症谱系障碍相关。已知 FOX P2 可形成同源二聚体，用于验证检测 Fox 的 Brett 实验方法。

将P二聚体细胞转染表达萤光素酶（作为供体）或YFP（作为受体）的质粒，这些蛋白分别与FoxP二或核定位信号融合表达。核靶向的萤光素酶和YFP蛋白作为阴性对照，用于检测Brett信号；同时转染表达萤光素酶-YFP融合蛋白的质粒作为阳性对照。

BRET 信号的增加表明，BRET 检测方法能够有效检测 Fox P 2 同源二聚体。此处展示了转染了 YFP 与核定位信号融合蛋白，或 Y游戏副本与 FOX P 2 融合蛋白的细胞的荧光显微镜图像。通过在 FOX P 2 中引入已知可破坏二聚化的突变，验证了相互作用的特异性。当 Luciferase Fox P 2 ΔE400 与 YFP Fox P 2 融合蛋白共表达时。

与共表达Fox B两个和YFP Fox B两个时相比，观察到呼吸信号降低。这种信号降低并非由突变蛋白的亚细胞定位改变所致。为评估Bret检测法在检测典型相互作用中的有效性，测试了Fox P两个与Fox P一个的相互作用，在检测的两种可能构型中均观察到了Brett信号。此外，通过检测Fox P两个与CT BP一个（一种转录共抑制因子及已知的Fox P两个相互作用伴侣）的相互作用，验证了Brett检测法用于检测Fox P两个与非FOX P蛋白相互作用的适用性。

当Fox P2作为供体融合蛋白、CT P1作为受体时，Bret检测法可检测到Fox P2与CT P1的相互作用，但在反向配置中则无法检测到。尽管仅有少量CT P1定位于细胞核内，FOX P2与CT P1之间的相互作用仍然被观察到，这凸显了该检测方法的高灵敏度。最后，采用Bret检测法考察了Fox P2中致病性突变对其蛋白-蛋白相互作用的影响。

已有报道指出，Fox P2 中的两个点突变可导致一种罕见的常染色体显性遗传病，影响言语和语言功能。本研究采用BRET实验评估突变蛋白与野生型Fox P2形成二聚体的能力。结果显示，R328X突变（而非R553H突变）会破坏二聚体的形成，该结论基于以野生型Fox P2作为供体、突变型Fox P2作为受体的实验结果。

如受体所示，反向构型也观察到了相同的结果。观看本视频后，您应能够很好地理解如何应用面包实验来监测蛋白质-蛋白质相互作用。该技术为细胞生物学领域的研究人员探索活细胞中的蛋白质-蛋白质相互作用铺平了道路。

通过此操作步骤后，可进一步采用其他技术来检测目标蛋白的活性，以评估所观察到的蛋白质-蛋白质相互作用的功能性后果。