Name: 研究蛋白质 - 蛋白质相互作用活细胞使用生物发光共振能量转移 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-26T13:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: 学习使用生物发光共振能量转移技术在活细胞中实时监测蛋白质-蛋白质相互作用，评估致病突变对蛋白功能的影响。该方法为功能基因组学研究提供动态数据。

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本研究由马克斯·普朗克学会资助。

1. 质粒的构建
<ol>
	<li>使用标准的分子生物学技术将每种目标蛋白的 cDNA 分别亚克隆至 pLuc 和 pYFP 载体中（图1）。详细实验方案参见 Green&#160;et al13。</li>
	<li>对所有构建的质粒进行测序，以确认目标蛋白的编码序列与 Luc/YFP 序列阅读框正确连接，且中间无提前终止密码子。</li>
	<li>根据需要进行功能检测，以验证融合蛋白是否保留生物学活性。在本研究示例中，通过荧光显微镜观察 YFP 融合蛋白的亚细胞定位。</li>
	<li>通过在 pLuc 和 pYFP 表达载体中引入相应的靶向信号，构建合适的 Luc 和 YFP 对照蛋白表达质粒。在本研究示例中，通过在 pLuc 和 pYFP 载体中插入核定位信号，构建靶向细胞核的 Luc 和 YFP 载体。</li>
	<li>构建一个阳性对照质粒，将 Luc 和 YFP 融合为单一多肽链。在本研究示例中，通过将 YFP 编码序列插入 pLuc 载体中，构建阳性对照质粒。</li>
	<li>选择一种中性填充质粒，用于调整转染混合物中 DNA 的总质量。应选用不含真核启动子、因此在哺乳动物细胞中无转录活性的质粒，例如细菌克隆载体。</li>
</ol>
2. DNA 混合物的制备
<ol>
	<li>根据在 260 nm 处的吸光度估算第 1 节中所述所有质粒的浓度（1 个吸光度单位相当于 50 µg/ml 的 DNA）。通过将碱基对数目乘以 650 Da 来确定每个质粒的分子质量。利用浓度和分子质量计算每个质粒制备物的摩尔浓度。将质粒 DNA 制备物稀释至 36 nM 的浓度。这些即为用于制备转染用 DNA 混合物的工作液。</li>
	<li>制备对照 DNA 混合物，其中含有 1,800 ng 填充质粒，最终体积为 20 µl 水。</li>
	<li>制备对照 DNA 混合物，其中含有 5 µl pLuc-control 载体。加入填充质粒使总 DNA 质量达到 1,800 ng。加水使最终体积达到 20 µl。</li>
	<li>制备对照 DNA 混合物，其中含有 5 µl pLuc-control 载体和 5 µl pYFP-control 载体。加入填充质粒使总 DNA 质量达到 1,800 ng。加水使最终体积达到 20 µl。</li>
	<li>制备对照 DNA 混合物，其中含有 5 µl 阳性对照载体。加入填充质粒使总 DNA 质量达到 1,800 ng。加水使最终体积达到 20 µl。</li>
	<li>制备以下 DNA 混合物以检测目的蛋白 X 的同源二聚化。对每种 DNA 混合物，加入 5 µl 相应的 pLuc 载体和 5 µl pYFP 载体。加入填充质粒使总 DNA 质量达到 1,800 ng。加水使最终体积达到 20 µl。 
	A) pLuc-control 和 pYFP-X 
	B) pLuc-X 和 pYFP-control 
	C) pLuc-X 和 pYFP-X</li>
	<li>制备以下 DNA 混合物以检测一对目的蛋白 X 和 Y 之间的相互作用。对每种 DNA 混合物，加入 5 µl 相应的 pLuc 载体和 5 µl pYFP 载体。加入填充质粒使总 DNA 质量达到 1,800 ng。加水使最终体积达到 20 µl。 
	A) pLuc-control 和 pYFP-X 
	B) pLuc-X 和 pYFP-control 
	C) pLuc-control 和 pYFP-Y 
	D) pLuc-Y 和 pYFP-control 
	E) pLuc-X 和 pYFP-Y 
	F) pLuc-Y 和 pYFP-X</li>
</ol>
3. 转染
<ol>
	<li>从一个75 cm2 培养瓶中收集处于亚汇合状态的HEK293细胞。将总细胞数的10%稀释至13 ml培养基中。每孔加入130 µl细胞悬液至白色透明底96孔组织培养板的各孔中。培养细胞24小时。</li>
	<li>通过将DNA混合物数量乘以3，计算需要转染的孔数。将无血清培养基平衡至室温。按每孔6.3 µl无血清培养基和0.18 µl转染试剂的比例配制主混合液。涡旋混匀，并在室温下孵育5分钟。</li>
	<li>在20 µl无血清培养基/转染试剂主混合液中加入2 µl DNA混合物，制备转染混合液。不要涡旋。室温孵育10分钟。</li>
	<li>使用每种转染混合液对三个孔进行转染，每孔加入6.5 µl转染混合液。继续培养细胞36–48小时。</li>
</ol>
4. BRET 信号的检测
<ol>
	<li>将活细胞荧光素酶底物以34 mg/ml的浓度溶解于DMSO中，通过涡旋混合。</li>
	<li>用预热至37 °C的底物稀释液将重组后的活细胞荧光素酶底物按1:1,000比例稀释。每孔预留50 µl底物稀释液。涡旋混匀。可能出现沉淀，但不会干扰检测。</li>
	<li>从96孔板中吸除培养基。向每孔加入50 µl稀释后的活细胞荧光素酶底物。继续培养细胞至少2小时（最长可达24小时）。</li>
	<li>取下96孔板的盖子，将板置于化学发光检测仪内，在室温下孵育10分钟。</li>
	<li>逐孔检测Luc和YFP的发射光信号。使用滤光片阻断波长大于470 nm的光以检测Luc的发射光；使用500–600 nm带通滤光片检测YFP的发射光。信号积分时间为10秒。&#160;</li>
</ol>
5. 数据分析
<ol>
	<li>取3次Luc发光读数的平均值&#160;仅转染了空载体质粒的孔。将该值从所有其他荧光素酶发光读数中减去，以获得背景校正后的荧光素酶发光值。</li>
	<li>取仅加入填充质粒的3个孔的YFP发射光读数的平均值。将其他所有YFP发射光读数减去该值，得到背景校正后的YFP发射光值。</li>
	<li>对每个孔，用经背景校正的YFP发射值除以经背景校正的Luc发射值，得到未校正的BRET比值。</li>
	<li>取转染了仅含pLuc-control质粒的三个孔的未校正BRET比值，计算其平均值。将所有其他未校正BRET比值减去该数值，得到校正后的BRET比值。</li>
	<li>对于其余每组校正后的BRET比值，取三个转染孔的数值平均值，得到最终的BRET比值。</li>
</ol>

<ol><li>Suter, B., Kittanakom, S., Stagljar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-hybrid+technologies+in+proteomics+research%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Two-hybrid technologies in proteomics research.</a> Curr Opin Biotechnol. 19, 316-323 (2008).</li>
<li>Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+complexes+using+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein complexes using mass spectrometry.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 645-654 (2007).</li>
<li>Berggard, T., Linse, S., James, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+detection+and+analysis+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions.</a> Proteomics. 7, 2833-2842 (2007).</li>
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<li>Pfleger, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended+bioluminescence+resonance+energy+transfer+%28eBRET%29+for+monitoring+prolonged+protein-protein+interactions+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Signal%22%5BJournal%5D)">Extended bioluminescence resonance energy transfer (eBRET) for monitoring prolonged protein-protein interactions in live cells.</a> Cell Signal. 18, 1664-1670 (2006).</li>
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<li>Boute, N., Pernet, K., Issad, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+activation+state+of+the+insulin+receptor+using+bioluminescence+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Monitoring the activation state of the insulin receptor using bioluminescence resonance energy transfer.</a> Mol Pharmacol. 60, 640-645 (2001).</li>
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<li>Fisher, S. E., Scharff, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FOXP2+as+a+molecular+window+into+speech+and+language%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">FOXP2 as a molecular window into speech and language.</a> Trends Genet. 25, 166-177 (2009).</li>
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<li>Horn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+FOXP1+deletions+in+three+unrelated+patients+with+mental+retardation+and+significant+speech+and+language+deficits%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mutat%22%5BJournal%5D)">Identification of FOXP1 deletions in three unrelated patients with mental retardation and significant speech and language deficits.</a> Hum Mutat. 31, 1851-1860 (2010).</li>
<li>Hamdan, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+mutations+in+FOXP1+in+cases+with+intellectual+disability%2C+autism%2C+and+language+impairment%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">De novo mutations in FOXP1 in cases with intellectual disability, autism, and language impairment.</a> Am J Hum Genet. 87, 671-678 (2010).</li>
<li>Talkowski, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequencing+chromosomal+abnormalities+reveals+neurodevelopmental+loci+that+confer+risk+across+diagnostic+boundaries%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sequencing chromosomal abnormalities reveals neurodevelopmental loci that confer risk across diagnostic boundaries.</a> Cell. 149, 525-537 (2012).</li>
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<li>Vernes, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genetic+analysis+of+mutations+implicated+in+a+human+speech+and+language+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Functional genetic analysis of mutations implicated in a human speech and language disorder.</a> Hum Mol Genet. 15, 3154-3167 (2006).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

融合蛋白表达载体的设计是建立BRET检测的关键步骤。在本研究所展示的实验中，目的蛋白被融合至荧光素酶或黄色荧光蛋白（YFP）的C末端。此外，也可将蛋白融合至荧光素酶/YFP的N末端，这在某些情况下可能是必要的。对于某些蛋白而言，为避免破坏其结构与功能，融合可能仅能发生在N末端或C末端之一。此外，对于N末端和C末端位于不同亚细胞区室的跨膜蛋白，荧光素酶/YFP必须与和相互作用伙伴处于同一区室的末端进行融合。例如，在研究跨膜G蛋白偶联受体与胞质β-阻遏蛋白（β-arrestin）相互作用时，荧光素酶被融合至跨膜受体的胞内羧基末端8。在其他情况下，蛋白-蛋白相互作用的空间构型可能导致两种可能的融合蛋白组合中仅有一种能实现更高效的能量转移。偶尔，若仅使用一种融合方式，可能完全无法检测到能量转移，从而导致假阴性结果。

荧光素酶/YFP 与目的蛋白之间的肽连接序列也可能影响共振能量转移的效率。该连接序列应足够长，以允许荧光素酶/YFP 和目的蛋白自由折叠而不受阻碍。较长的连接序列可增加荧光素酶/YFP 与目的蛋白连...

对人类疾病的经典连锁分析和新一代测序研究正在揭示参与多种生物通路的蛋白质在临床上的重要性。通常情况下，在这些研究发现之前，人们对这些蛋白质的生物学功能几乎未进行过研究或研究甚少。探索目标蛋白质生物学功能的一个有效途径是确定其在生理环境中与哪些其他蛋白质相互作用。以这种方式表征分子网络，有助于揭示人类表型背后的生物学通路。
用于鉴定目标蛋白候选互作蛋白的最常用大规模筛选方法是酵母双杂交筛选1和基于质谱的蛋白质组学分析2。这些方法在预测潜在相互作用蛋白方面可能非常有效，但容易产生假阳性结果。因此，通过酵母双杂交或质谱筛选鉴定出的相互作用必须使用第二种技术进行验证。通常采用共免疫沉淀或pull-down实验来实现这一目的3。使用此类技术进行验证的一个缺点是需要进行细胞裂解，这会破坏维持某些蛋白相互作用所必需的细胞内环境；另一个缺点是弱结合或瞬时的蛋白相互作用可能在洗涤步骤中被破坏。此外，这些实验需要较多的手动操作时间，可同时处理的样本数量有限，且通常需要对试剂和实验方案进行耗时的优化。
为克服与免疫共沉淀实验相关的一些问题，已开发出多种基于可在活细胞中使用的荧光和生物发光蛋白的检测方法。最早出现的此类检测方法基于荧光共振能量转移（FRET），即两种具有重叠发射光谱和激发光谱的荧光蛋白之间发生的非辐射性能量转移4。能量转移效率具有强烈距离依赖性，因此观察FRET现象要求供体和受体荧光基团必须处于非常接近的空间位置。为检测两种目标蛋白之间的相互作用，可将其中一种蛋白表达为与供体荧光基团（通常为青色荧光蛋白，CFP）的融合蛋白，另一种蛋白则表达为与受体荧光基团（通常为黄色荧光蛋白，YFP）的融合蛋白。若两种目标蛋白发生相互作用，则可能使供体和受体荧光基团接近到足以发生能量转移的程度，从而导致YFP受体的发光信号相对于CFP供体出现可测量的增强。FRET已成功用于在活细胞中检测蛋白-蛋白相互作用4。然而，利用FRET检测蛋白-蛋白相互作用的主要缺点在于需要外部光照来激发供体荧光基团。外部光照会导致发射信号背景值升高、受体的非特异性激发，以及供体和受体荧光基团的光漂白。这些因素会降低该检测方法在检测蛋白-蛋白相互作用时的灵敏度。
一种对FRET检测方法的改进是生物发光共振能量转移（BRET）检测5,6，该方法克服了外部光照导致背景信号过高的问题。在BRET系统中，供体荧光基团被替换为一种荧光素酶。因此，受体荧光基团的激发能量由系统内荧光素酶底物的氧化反应产生，无需外部光照。在此检测的最常见配置中，供体为Renilla reniformis荧光素酶，受体为黄色荧光蛋白（YFP）（关于其他供体和受体蛋白的讨论参见Pfleger&#160;et al.5）。因此，在该系统中，目标蛋白与荧光素酶融合，而潜在相互作用的蛋白则与YFP融合，或反之亦然。BRET检测需要添加腔肠素作为荧光素酶的底物。由于腔肠素具有细胞膜通透性，因此可在活细胞中进行BRET检测。然而，天然腔肠素在水溶液中不稳定，其非酶促降解不仅降低了可用于检测的底物浓度，还会产生自发光，从而降低荧光素酶活性检测的灵敏度。通过开发受保护的腔肠素类似物，促进了BRET在活细胞中的应用：这类类似物在水溶液中稳定，但穿过细胞膜进入细胞质后可被胞内酯酶切割，从而在细胞内释放出具有活性的腔肠素7。
在向表达荧光素酶和YFP融合蛋白的细胞中加入底物后，通过检测荧光素酶和YFP的发射光来量化由蛋白质相互作用引起的能量转移。由于可在多孔板中的活细胞内直接监测蛋白质相互作用，BRET检测成为一种简单且可扩展的方法，可用于验证推测的相互作用，具有成本低、耗时少的优点。
除了验证蛋白质组学筛选研究中鉴定出的潜在相互作用蛋白外，BRET系统还可用于检验基于目标蛋白先前的生化和结构研究所提出的候选相互作用蛋白。一旦蛋白质-蛋白质相互作用的存在被确立（无论是通过BRET检测还是其他技术），便可进一步利用BRET检测对该相互作用进行表征。例如，可通过构建蛋白质的截短突变体来定位相互作用区域，并通过引入点突变来验证特定氨基酸残基在相互作用中的作用。此外，还可利用该方法研究翻译后修饰或小分子（如药物或配体）对蛋白质-蛋白质相互作用的调节作用8-10。
BRET 检测在研究患者 DNA 中发现的突变方面也具有巨大潜力。当某个突变的致病作用已被确立时，利用 BRET 研究该突变对蛋白质-蛋白质相互作用的影响，可能有助于进一步揭示表型的分子病因11。随着新一代测序技术的出现，个体中常会发现多个可能具有破坏性的突变，而其中哪些突变与表型相关往往尚不明确12。在此情况下，BRET 检测可用于评估突变对蛋白质功能的影响，从而判断其与疾病的相关性。

<table><tbody><tr><td> Nanodrop 8000 </td><td> Nanodrop </td><td></td><td> 任何能够在 260 nm 处读取吸光度的分光光度计均可使用。确定质粒的分子质量对于计算转染混合物中所用 DNA 量至关重要。 </td></tr><tr><td> 96 孔微孔板，平底，白色 </td><td> Greiner Bio One </td><td> 655098 </td><td> 白色板可减少孔之间的串扰，并最大限度提高发光检测的灵敏度。透明底孔便于监测细胞密度。板必须适用于细胞培养。若使用顶部读数的发光仪，则应在检测前取下板盖。 </td></tr><tr><td> Infinite F200Pro 酶标仪及其控制软件 </td><td> TECAN </td><td></td><td> 使用“Blue 1”和“Green 1”滤光片进行发光检测，使用 GFP 的滤光片组和二向色镜进行荧光检测。任何具备双色发光和荧光检测能力的顶部读数酶标仪均适用。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td> pLuc、pYFP、阳性对照质粒 </td><td> N/A </td><td> N/A </td><td> 质粒可应要求向作者索取。 </td></tr><tr><td> pGEM-3Zf(+) </td><td> Promega </td><td> P2271 </td><td> 用于转染混合物中 DNA 质量平衡的填充质粒。任何不含真核启动子的质粒均可适用。 </td></tr><tr><td> HEK293 细胞 </td><td> ECACC </td><td> 85120602 </td><td> 其他转染效率合理的细胞系也可能适用。 </td></tr><tr><td> DMEM，高糖，含酚红 </td><td> Gibco </td><td> 41966 </td><td> 这是用于培养 HEK293 细胞的培养基。使用前在 37 &amp;deg;C 水浴中预热。若使用其他细胞系，请将此处描述的生长培养基替换为相应细胞系专用的培养基。 </td></tr><tr><td> DMEM，高糖，无酚红（底物稀释液） </td><td> Gibco </td><td> 21063 </td><td> 此为用于稀释荧光素酶底物（EnduRen）的底物稀释液，因其不含会降低检测灵敏度的酚红。含有 HEPES，可在细胞离开 CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱期间维持正确的 pH 值。使用前在 37 &amp;deg;C 水浴中预热。 </td></tr><tr><td> OptiMEM </td><td> Gibco </td><td> 31985 </td><td> OptiMEM 用于稀释 GeneJuice 转染试剂。其他无血清培养基也可适用。使用前恢复至室温。 </td></tr><tr><td> 胎牛血清 </td><td> Gibco </td><td> 10270 </td><td> 用于以 10% v/v 的浓度补充细胞培养基。 </td></tr><tr><td> GeneJuice 转染试剂 </td><td> Novagen </td><td> 70967 </td><td> 若使用的细胞系非 HEK293，可能需要调整转染混合物中 GeneJuice 转染试剂与 DNA 的比例。也可使用其他转染试剂。若使用替代转染试剂，可能需要根据生产商说明书优化转染混合物中 DNA 的用量。 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma </td><td> D2650 </td><td> 使用适用于组织培养的无菌 DMSO。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td> EnduRen 活细胞底物 </td><td> Promega </td><td> E6481 </td><td> 用 DMSO 将 EnduRen 重悬至 34 mg/ml。EnduRen 在培养基中稀释时可能出现沉淀，但不会干扰检测。将重悬后的 EnduRen 储存于 -20 &amp;deg;C，避免反复冻融。确保重悬后的 EnduRen 在稀释至培养基前已完全解冻。 </td></tr></tbody></table>

利用生物发光共振能量转移在活细胞中研究蛋白质-蛋白质相互作用

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

基于生物发光共振能量转移（BRET）的检测方法为在活细胞中监测蛋白质-蛋白质相互作用提供了一种灵敏且可靠的技术。BRET 是指能量从“供体”荧光素酶酶非辐射性地转移至“受体”荧光蛋白。在该检测最常见的配置中，供体为Renilla reniformis荧光素酶，受体为黄色荧光蛋白（YFP）。由于能量转移效率强烈依赖于距离，观察 BRET 现象要求供体与受体必须处于非常接近的空间位置。为在培养的哺乳动物细胞中检测两种目标蛋白质之间的相互作用，可将其中一种蛋白质表达为与荧光素酶的融合蛋白，另一种则表达为与 YFP 的融合蛋白。若两种目标蛋白质之间存在相互作用，则可能使供体与受体接近到足以发生能量转移的距离。与其他研究蛋白质-蛋白质相互作用的技术相比，BRET 检测具有高灵敏度，操作简便，所需人工干预时间短、试剂用量少，并能够检测那些微弱、短暂或依赖于活细胞内生化环境的相互作用。因此，该方法是验证酵母双杂交或质谱蛋白质组学研究所提示的潜在相互作用的理想手段，同时也适用于绘制相互作用区域、评估翻译后修饰对蛋白质-蛋白质相互作用的影响，以及分析在患者 DNA 中发现的突变所产生的效应。

BRET检测的原理如图2所示。本研究所采用的实验装置如图3所示。在转染了荧光素酶-YFP融合蛋白的细胞中检测到强烈的BRET信号，证实在此实验体系中可观察到能量转移现象（图4）。
我们的研究聚焦于FOXP转录抑制因子家族在大脑发育中的作用。FOXP2基因的杂合突变会导致一种罕见的言语和语言障碍，其最显著特征是发展性言语失用症——即难以完成言语所需的复杂口面部肌肉运动序列14-16。FOXP1基因突变已在患有自闭症谱系障碍和智力障碍并伴有严重言语及语言问题的患者中被报道17-20。目前正通过研究FOXP蛋白与其他蛋白质的相互作用，以深入了解这些蛋白在大脑发育中所涉及的分子机制。
已知FOXP2可与其他FOXP家族成员形成同源或异源二聚体21，因此利用FOXP2同源二聚化来验证BRET检测的可靠性（图4</stro...

蛋白质之间的相互作用是所有细胞过程的基础。利用生物发光共振能量转移技术，可以在活细胞中实时监测一对蛋白质之间的相互作用。此外，还可以评估潜在致病性突变的影响。

基于生物发光共振能量转移（BRET）的检测方法为在活细胞中监测蛋白质-蛋白质相互作用提供了灵敏且可靠的手段。

以下实验的总体目标是观察两种蛋白质与活体培养细胞之间的相互作用。该目标通过将两种目标蛋白的cDNA亚克隆至含有荧光素酶或黄色荧光蛋白（简称YFP）标签序列的质粒中，构建可在哺乳动物细胞中表达蛋白的载体来实现。第二步，将这些质粒转染至培养细胞中，从而表达YFP和荧光素酶融合蛋白。随后向细胞中加入荧光素酶底物，以启动荧光素酶的发光反应。通过检测从荧光素酶（LUCIFERASE）到黄色荧光蛋白（YFP）的能量转移，获得结果，从而显示两种融合蛋白之间的相互作用。该技术相较于共沉淀等现有方法的主要优势在于，能够在活细胞中实时观察蛋白质-蛋白质相互作用。该方法可通过确定患者中发现的突变是否影响蛋白质-蛋白质相互作用，从而帮助回答功能基因组学领域中的关键科学问题。本实验操作的第一步将由本实验室的博士研究生 RAB tric 演示。首先，按照文本方案中所述方法构建质粒，并根据其在 260 纳米处的吸光度估算浓度。通过将每个质粒的碱基对数目乘以 650 道尔顿来确定其分子质量。利用浓度和分子质量计算每种质粒制备物的摩尔浓度。将质粒 DNA 制备物稀释至 36 纳摩尔的浓度。这些将是用于制备转染用DNA混合物的工作液。该实验步骤中最困难的部分是DNA混合物的配制。为确保成功，我们会创建电子表格来预先计算每种组分的准确用量，并格外小心操作。在配制 DN 反应混合物时，先准备第一份对照 DNA 混合物，其中包含 1800 纳克的填充质粒，加水至终体积为 20 微升。然后通过配制 5 微升的 P 启动子对照构建体，设置第二份受控 DNA 混合物。加入填充质粒，使总DNA质量达到1800纳克。加入水，使最终体积达到20微升。制备第三种对照DNA混合液，包含5微升P look对照质粒和5微升PYFP对照质粒。加入填充质粒和水，操作同前。最后，设置第四组对照 DNA 混合液，其中包含 5 µL 的阳性对照质粒。同样，以相同方式加入填充质粒和水。接下来，制备用于检测目的蛋白x同源二聚化的3D NA混合物。对于每种DNA混合物，将5 µL相应的P look质粒与5 µL PYFP质粒混合，并加入填充质粒和水。然后制备用于检测一对目的蛋白X与Y相互作用的DNA混合物。对于每种DNA混合物，将5 µL相应的P look质粒与5 µL PYFP质粒混合，并加入填充质粒和水。收获一个75 cm²培养瓶中处于亚融合状态的HEK 293细胞，取总细胞量的10%稀释至13 mL培养基中。然后将130 µL细胞悬液加入至白色透明底的96孔组织培养板的每个孔中，在培养细胞24小时之前完成加样。接下来，通过将DNA混合物的数量乘以3，计算需要转染的孔数。每孔加入6.3 µL室温无血清培养基和0.18 µL转染试剂，混匀后涡旋振荡，配制主混合液，室温孵育5分钟。然后将20 µL无血清培养基转染试剂主混合液分装至所需数量的离心管中。每管加入2 µL相应的DNA混合液，室温孵育10分钟。最后，用每种转染混合液分别转染三个孔。在培养细胞之前，每孔加入6.5微升转染混合物，继续培养36至48小时。为检测BRET信号，首先将活细胞荧光素酶底物以34毫克/毫升的浓度溶于DMSO中，并通过涡旋振荡溶解。将重组的活细胞荧光素酶底物在底物稀释液中按1:1000比例稀释，底物稀释液预先温育至37摄氏度。每孔加入50微升底物稀释液，涡旋混匀。可能出现沉淀，但不会干扰检测结果。从96孔板中吸除培养基后，向每个孔中加入50 µL稀释后的活细胞荧光素酶底物。细胞至少培养2小时后，取下96孔板盖，在化学发光仪内室温孵育10分钟。根据文本方案中的详细说明，依次测量每个孔中荧光素酶（LUCIFERASE）和黄色荧光蛋白（YFP）的发射光信号，每孔信号积分时间为10秒。转录抑制因子 Fox P 家族成员在大脑发育过程中发挥重要作用。其基因突变与语言障碍及自闭症谱系障碍相关。已知 FOX P2 可形成同源二聚体，用于验证检测 Fox 的 Brett 实验方法。将P二聚体细胞转染表达萤光素酶（作为供体）或YFP（作为受体）的质粒，这些蛋白分别与FoxP二或核定位信号融合表达。核靶向的萤光素酶和YFP蛋白作为阴性对照，用于检测Brett信号；同时转染表达萤光素酶-YFP融合蛋白的质粒作为阳性对照。BRET 信号的增加表明，BRET 检测方法能够有效检测 Fox P 2 同源二聚体。此处展示了转染了 YFP 与核定位信号融合蛋白，或 Y游戏副本与 FOX P 2 融合蛋白的细胞的荧光显微镜图像。通过在 FOX P 2 中引入已知可破坏二聚化的突变，验证了相互作用的特异性。当 Luciferase Fox P 2 ΔE400 与 YFP Fox P 2 融合蛋白共表达时。与共表达Fox B两个和YFP Fox B两个时相比，观察到呼吸信号降低。这种信号降低并非由突变蛋白的亚细胞定位改变所致。为评估Bret检测法在检测典型相互作用中的有效性，测试了Fox P两个与Fox P一个的相互作用，在检测的两种可能构型中均观察到了Brett信号。此外，通过检测Fox P两个与CT BP一个（一种转录共抑制因子及已知的Fox P两个相互作用伴侣）的相互作用，验证了Brett检测法用于检测Fox P两个与非FOX P蛋白相互作用的适用性。当Fox P2作为供体融合蛋白、CT P1作为受体时，Bret检测法可检测到Fox P2与CT P1的相互作用，但在反向配置中则无法检测到。尽管仅有少量CT P1定位于细胞核内，FOX P2与CT P1之间的相互作用仍然被观察到，这凸显了该检测方法的高灵敏度。最后，采用Bret检测法考察了Fox P2中致病性突变对其蛋白-蛋白相互作用的影响。已有报道指出，Fox P2 中的两个点突变可导致一种罕见的常染色体显性遗传病，影响言语和语言功能。本研究采用BRET实验评估突变蛋白与野生型Fox P2形成二聚体的能力。结果显示，R328X突变（而非R553H突变）会破坏二聚体的形成，该结论基于以野生型Fox P2作为供体、突变型Fox P2作为受体的实验结果。如受体所示，反向构型也观察到了相同的结果。观看本视频后，您应能够很好地理解如何应用面包实验来监测蛋白质-蛋白质相互作用。该技术为细胞生物学领域的研究人员探索活细胞中的蛋白质-蛋白质相互作用铺平了道路。通过此操作步骤后，可进一步采用其他技术来检测目标蛋白的活性，以评估所观察到的蛋白质-蛋白质相互作用的功能性后果。

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