利用生物发光共振能量转移在活细胞中研究蛋白质-蛋白质相互作用

以下实验的总体目标是观察两种蛋白质与活体培养细胞之间的相互作用。该目标通过将两种目标蛋白的cDNA亚克隆至含有荧光素酶或黄色荧光蛋白（简称YFP）标签序列的质粒中，构建可在哺乳动物细胞中表达蛋白的载体来实现。第二步，将这些质粒转染至培养细胞中，从而表达出YFP和荧光素酶融合蛋白。

随后向细胞中加入荧光素酶底物，以启动荧光素酶的发光反应。通过荧光素酶向YFP的能量转移，获得结果，显示两种融合蛋白之间的相互作用。该技术相较于共沉淀等现有方法的主要优势在于，可在活细胞中观察蛋白质-蛋白质相互作用。

该方法可通过确定患者中发现的突变是否影响蛋白质-蛋白质相互作用，从而帮助回答功能基因组学领域的关键问题。本实验步骤的第一步将由本实验室的博士生 RAB tric 演示。首先，按照文本方案中所述方法构建质粒，并根据在 260 纳米处的吸光度估计其浓度。

通过将每个质粒的碱基对数目乘以650道尔顿来确定其分子质量。利用浓度和分子质量计算每种质粒制备物的摩尔浓度。将质粒DNA制备物稀释至36纳摩尔的浓度。

这些将是用于配制DNA混合物的工作液。用于转染。该实验步骤中最困难的部分是DNA混合物的配制。为确保成功，我们会创建电子表格以预先计算每种组分的准确用量，并格外小心操作。

在配制DNA混合物时，首先准备对照DNA混合液，其中包含1800纳克的填充质粒，最终体积为20微升的水。然后，通过配制5微升的P基因座对照构建体，制备第二组受控DNA混合液。

加入填充质粒，使总DNA质量达到1800纳克。加水至终体积为20微升。制备第三种对照DNA混合物，包含5微升P look对照质粒和5微升PYFP对照质粒。

按之前的方法加入填充质粒和水。最后，设置第四组对照DNA混合液，其中包含5 µL的阳性对照质粒。同样，以相同方式加入填充质粒和水。

接下来，制备用于检测目的蛋白x同源二聚化的3D NA混合物。对于每种DNA混合物，将五微升相应的P look质粒与五微升PYFP质粒混合，并加入填充质粒和水。然后制备用于检测一对目的蛋白X与Y相互作用的DNA混合物。对于每种DNA混合物，将五微升相应的P look质粒与五微升PYFP质粒混合，并加入填充质粒和水。收获一个75平方厘米培养瓶中处于亚融合状态的HEK 293细胞，取总细胞量的10%稀释至13毫升培养基中。

随后，将130 µL细胞悬液加入至白色透明底96孔组织培养板的每孔中，于37°C培养细胞24小时。接下来，通过将DNA混合物数量乘以3，计算需要转染的孔数。按每孔加入6.3 µL室温无血清培养基和0.18 µL转染试剂的比例配制总混合液，涡旋混匀后，室温孵育5分钟。

然后将20 µL无血清培养基转染试剂预混液分装至所需数量的离心管中。每管加入2 µL相应的DNA混合液，室温孵育10分钟。最后，用每种转染混合液分别转染三个孔。

在细胞培养前，每孔加入6.5 µL转染混合物，继续培养36至48小时。为检测BRET信号，首先将活细胞荧光素酶底物以34 mg/mL的浓度溶于DMSO中，并涡旋混匀。

将重组的活细胞荧光素酶底物用底物稀释液按1:1000比例稀释，底物稀释液预先温育至37摄氏度。每孔加入50微升底物稀释液，涡旋混匀。可能出现沉淀，但不会干扰检测。

从96孔板中吸除培养基，细胞培养至少两小时后，向每孔加入50 µL稀释的活细胞荧光素酶底物。取下96孔板盖，将板置于化学发光检测仪内，室温孵育10分钟。根据文本方案中的详细说明，逐孔检测荧光素酶（LUCIFERASE）和黄色荧光蛋白（YFP）的发射光信号，积分时间为10秒。

转录抑制因子 Fox P 家族成员在大脑发育过程中发挥重要作用。其突变与言语障碍及自闭症谱系障碍相关。已知 FOX P2 能够形成同源二聚体，用于验证检测 Fox 的 Brett 实验。

P2 同源二聚体细胞被转染了表达荧光素酶（作为供体）或黄色荧光蛋白（YFP，作为受体）的质粒，这些蛋白分别与 FoxP2 或核定位信号融合。核靶向的荧光素酶和 YFP 蛋白作为阴性对照，而转染表达荧光素酶-YFP 融合蛋白质粒的细胞则作为检测 Bret 信号的阳性对照。

BRET 信号的增加表明，BRET 检测方法能够有效检测 Fox P2 同源二聚体。此处展示了转染了与核定位信号融合的 YFP，或与 FOX P2 融合的 YFP 的细胞的荧光显微镜图像。通过在 FOX P2 中引入已知可破坏二聚化的突变，验证了相互作用的特异性。当 Luciferase Fox P2 ΔE400 与 YFP Fox P2 融合蛋白共表达时。

与共表达Fox B two和YFP Fox B two时相比，观察到呼吸信号降低。这种信号降低并非由突变蛋白的亚细胞定位改变所致。为评估Bret检测法在检测典型相互作用中的有效性，测试了Fox P two与Fox P one的相互作用，在检测的两种可能构型中均观察到了Brett信号。此外，通过检测Fox P two与CT BP one（一种转录共抑制因子，且为已知的Fox P two相互作用蛋白）的相互作用，验证了Brett检测法用于检测Fox P two与非FOX P蛋白之间相互作用的适用性。

当Fox P2作为供体融合蛋白、CT P1作为受体时，BRET检测可检测到Fox P2与CT P1之间的相互作用，但在反向配置中则无法检测到该相互作用。尽管仅有少量CT P1定位于细胞核内，仍可观察到FOX P2与CT P1之间的相互作用，这凸显了该检测方法的高灵敏度。最后，采用BRET检测来研究Fox P2中致病性突变对蛋白质-蛋白质相互作用的影响。

已有报道指出，Fox P2 上的两个点突变可导致一种罕见的常染色体显性遗传病，影响言语和语言功能。本研究利用BRET检测法评估了突变蛋白与野生型Fox P2形成二聚体的能力。结果显示，R328X突变（而非R553H突变）会破坏二聚体的形成，该结论基于以野生型Fox P2作为供体、突变型Fox P2作为受体的实验结果。

如图所示，互换配置后观察到了相同的结果。观看本视频后，您应能充分理解如何应用酵母双杂交实验来监测蛋白质-蛋白质相互作用。该技术为细胞生物学领域的研究人员探索活细胞中的蛋白质相互作用奠定了基础。

在完成此操作步骤后，可进一步采用其他技术来检测目标蛋白的活性，以评估所观察到的蛋白质-蛋白质相互作用的功能性后果。