一种利用荧光法快速简便测定藻类细胞中中性脂质的方案

以下实验的总体目标是利用尼罗红荧光染料测定藻类细胞中的中性脂质含量。首先将细胞悬浮于乙醇溶液中，以通透细胞壁和细胞膜；第二步加入尼罗红荧光染料，该染料进入细胞后会积累在细胞的非极性区域，包括中性脂质体中。

接下来，将样品暴露于530纳米的激发光源下，使尼罗红在中性脂质体中吸收后于604纳米处产生荧光。通过在微孔板中进行各项测试，并使用分光光度计快速获取荧光读数，可大规模获得结果。读数显示，藻细胞中的中性脂质含量与荧光强度之间呈线性关系。

通过使用已知油脂成分的细胞制备校准曲线，可将荧光测量值转换为含油量。与现有的Bly dire重量法等方法相比，该技术的主要优势在于能够利用大多数实验室常见的材料快速测定中性脂质含量。该方法可在藻类培养过程中实时提供生物过程性能的反馈信息。

此外，96孔板读数仪所具备的高通量特性非常适合用于筛选研究和因子实验。尽管该技术已针对小球藻（Chlorella）和盐藻（D. salina）进行了优化，但也可轻松修改后用于其他藻类物种的分析。好的，首先从生长中的藻类培养物中取出一定体积的样品，确保提供至少200毫克的干生物量。

400 至 600 毫克为宜。在 4°C 条件下以 10,000 ×g 离心 10 分钟，弃去上清液，并用与培养基 pH 相同的磷酸盐缓冲液以等体积洗涤沉淀。

重复此过程，共进行三次洗涤步骤。将沉淀重悬于去离子水中，并转移至已预先称重的称量皿中。在50°C下让样品干燥48小时。

干燥的藻类培养物可在室温下保存以供将来使用。用称量皿称取约50毫克干藻类生物量。如有必要，将生物量转移至已用己烷预洗过的研钵中，并用移液管吸取少量己烷冲洗称量皿，以确保将全部生物量完全转移至研钵中。

接下来，使用研钵将藻类生物量研磨五分钟。开始时轻轻研磨，然后逐渐增加力度。将生物量研磨成细腻均匀的糊状物。

在五分钟的时间内，向研钵中加入几毫升正己烷，用研杵将形成的浆液混合，直至均质化。确保附着在研钵壁上的所有细胞碎片均被刮下并悬浮于液体中。接着，将正己烷与细胞物质的混合物转移至一支适配的离心管中。

重复三到五次，直至所有生物量均转移至离心管中。将样品在4°C条件下以10,000 ×g离心20分钟。离心后，小心吸取上清液至预先称重的金属称量皿中，可存放于通风橱内。

向沉淀中加入3毫升正己烷，充分涡旋，进行第二次正己烷萃取。以相同条件离心并转移上清液，持续一分钟。待正己烷完全蒸发后，通过重量法测定所提取油的质量。

进行荧光定量时，将所有藻类样品配制为与测量中所用标准品相同生物量浓度，并以相同方式处理。具体操作为：将预干燥的样品悬浮于适量磷酸盐缓冲液中。如有必要，可使用匀浆器以促进干燥藻细胞的重悬。

在96孔板的单个孔中，将80微升预配制的30%乙醇溶液、10微升预配制的尼罗红溶液和10微升藻类悬浮液混合，用于每个样品。为准确评估荧光测量的变异性，每份样品进行五次重复实验。接下来，使用先前配制的标准品进行两点校准曲线测定。

为了消除仪器和样品制备中每日之间的差异，在使用多孔板读板仪进行荧光检测时，需设置参数如下：以1,200 RPM转速振荡，振幅3毫米，持续30秒，随后在40摄氏度下孵育10分钟。再次以1,200 RPM转速振荡，振幅3毫米，持续30秒，然后在激发波长530纳米、发射波长604纳米条件下记录荧光信号。最后启动运行程序。

使用内标结果将荧光测量值转换为含油量，以进行荧光显微镜检测。采用经尼罗红染色制备的样品，根据标准实验室操作规程制备待测样品的显微镜载玻片。首先将显微镜设为透射光模式，将制备好的载玻片装入显微镜，于所需放大倍数下定位细胞。

聚焦后，将显微镜从透射光模式切换至落射荧光照明模式。此时光源应直接来自物镜，可通过目视观察载玻片与物镜之间的空间来确认。将绿色激发滤光片插入光源处，将红色发射滤光片插入观察光路中。

染色后的细胞荧光现在应可通过目镜直接观察到。将显微镜的观察模式从目镜切换到连接的相机，并使用成像软件捕获发出荧光的细胞图像。具体设置将根据仪器、设备和细胞类型的不同而有所差异。

使用尼罗红染料染色的代表性藻类细胞图像显示，在过量氮条件下培养的细胞内脂质积累极少，与此形成对比的是在氮限制条件下培养的OIDs样品。在透射光照射下，通过仔细观察可看到细胞内的脂质体，其呈现为闪亮的圆形结构，并占据细胞体积的大部分。此处所示细胞的干重含油量仅为5%，在适当的光照条件下观察时，不含显著水平的脂质体。

这些样本中的差异被放大。含油量低的细胞呈现为具有暗色中心的荧光环状结构，而含油量高的细胞则因脂质体的积累而发出明亮的橙红色荧光。尼罗红会根据中性脂质、位于细胞壁上的磷脂以及非极性细胞蛋白的存在情况，在不同波长下产生荧光，因此含油量低的细胞表现为具有暗色中心的荧光环。

这种非特异性也是在优化实验条件下使用分光光度计检测中性脂质时产生背景荧光水平的原因；在此条件下，校准曲线的R平方值通常可轻松达到0.980以上。如果细胞在缺乏乙醇等载体溶剂的溶液中染色，则细胞含油量与荧光强度之间的关系会呈现非线性。本文所示数据在0%乙醇溶液中按照实验方案操作获得，其R平方值为0.395。

一旦掌握，若操作得当，该技术可在 15 至 20 分钟内完成。在执行该实验过程中，关键是要确保所有样品均以相同的生物量浓度进行制备。观看本视频后，您将能够充分理解如何利用传统的正己烷提取方法以及更简便的 NAL 红色荧光染色法来测定藻类细胞中的中性脂质含量。