Name: 小非编码RNA从人血清中分离 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 44 s
Description: 学习从人血清样本中分离高质量小非编码RNA的优化方法，使用相锁管去除污染物并通过快速离心纯化RNA。该技术可最大化回收microRNA，适用于DNA芯片和定量PCR等下游应用。

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Samantha Khoury 和 Pamela Ajuyah 获得澳大利亚研究生奖学金的支持。我们还要感谢新南威尔士大学洛伊癌症研究中心、转化癌症研究网络以及北区转化癌症研究组对 Samantha Khoury 提供的额外支持。

注意：来自健康患者或癌症患者的血清样本均在获得知情同意的情况下，根据悉尼皇家阿尔弗雷德亲王医院（Royal Prince Alfred Hospital Sydney）批准的人类伦理协议（编号 X10-0016 和 HREC/10/RPAH/24）以及悉尼科技大学的伦理规范获取。血清样本由悉尼多家医院的患者在手术前采集，并储存于 -80 °C 环境中。
1. 从血清中分离小RNA&#160;
采用改良的Tri-Reagent RT LS方案从人血清中提取总RNA。
<ol>
	<li>将冻存的血清样本置于冰上解冻，然后取400 µl新鲜解冻的血清转移至已标记的微量离心管中。</li>
	<li>用100 µl无RNase的H2O稀释血清2O，并加入蛋白酶K至终浓度为1 mg/ml。</li>
	<li>37 °C 下孵育 20 分钟&#160;以允许蛋白酶K对蛋白质进行消化。</li>
	<li>为确保完全溶解，加入1.5倍体积的Tri-Reagent RT LS和100 µl的4-溴苯甲醚。</li>
	<li>轻轻倒置匀浆液，重复吹打5秒&#160;并转移至一个标记的2&#160;ml 重型相锁管</li>
	<li>将匀浆在12,000 × g离心20分钟&#160;在 4 °C 下。</li>
	<li>小心地将至少1 ml的所得水相溶液倒入新的DNA Lobind离心管中。有机相和中间层应被截留在Phase Lock管的白色凝胶层下方。</li>
	<li>加入5.0 µl甘油（5 mg/ml）和500 µl 100%异丙醇至水相溶液中，颠倒混匀，于-20 °C过夜孵育。</li>
	<li>过夜孵育后&#160;孵育后，将样品以离心机离心20分钟&#160;在4 °C下以12,000 × g离心。</li>
	<li>弃去澄清的上清液，并进行一次 &#34;闪光&#34; 离心2分钟&#160;在4 °C、16,000 × g条件下离心。</li>
	<li>用移液器小心吸除沉淀物周围的澄清溶液。</li>
	<li>用1 ml洗涤沉淀&#160;加入70%乙醇，于10,000 × g离心10分钟。倾去洗涤液，重复洗涤步骤。</li>
</ol>
2. RNA 重悬&#160;进入溶液
<ol>
	<li>将沉淀重悬于 10 µl 无 RNase 的 H2O 中，确保沉淀完全溶解。为确保 RNA 完全溶解，可将样品在 55 °C 下加热 5 分钟，并在此期间通过反复吹打混匀样品。为获得更高的总 RNA 产量，可合并来自同一患者的两份 RNA 制备样品。</li>
	<li>使用紫外-可见分光光度计定量重悬的 RNA，并利用 2100 Bioanalyzer 评估 RNA 质量。将合并后的 RNA 样品储存于 -80 °C，用于后续实验。</li>
</ol>

<ol><li>Babu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+extraction+efficiency+of+small+RNAs+with+the+Agilent+2100+Bioanalyzer+and+the+Small+RNA+Kit%5BTitle%5D)+AND+%22Agilent+Application+Note%22%5BJournal%5D)">Monitoring extraction efficiency of small RNAs with the Agilent 2100 Bioanalyzer and the Small RNA Kit.</a> Agilent Application Note. , (2010).</li>
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<li>Murphy, N. R., Hellwig, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+nucleic+acid+organic+extraction+through+use+of+a+unique+gel+barrier+material%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Improved nucleic acid organic extraction through use of a unique gel barrier material.</a> Biotechniques. 21, 934-936 (1996).</li>
<li>Taylor, C. J., Satoor, S. N., Ranjan, A. K., Pereira e Cotta, M. V., Joglekar, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+measurement+of+noncoding+RNA+in+human+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Diabetes+Research%22%5BJournal%5D)">A protocol for measurement of noncoding RNA in human serum.</a> Experimental Diabetes Research. 2012, (2012).</li>
<li>Ichikawa, M., Akiyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Combination+of+Extraction+Reagent+and+DNA+Microarray+That+Allows+for+the+Detection+of+Global+MiRNA+Profiles+from+Serum%2FPlasma%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A Combination of Extraction Reagent and DNA Microarray That Allows for the Detection of Global MiRNA Profiles from Serum/Plasma.</a> Methods Mol. Biol. 1024, 247-253 (2013).</li>
<li>Fromm, B., Harris, P. D., Bachmann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+preparations+from+individual+monogenean+Gyrodactylus+salaris-a+comparison+of+six+commercially+available+totalRNA+extraction+kits%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res.+Notes%22%5BJournal%5D)">MicroRNA preparations from individual monogenean Gyrodactylus salaris-a comparison of six commercially available totalRNA extraction kits.</a> BMC Res. Notes. 4, 217 (2011).</li>
<li>Li, Y., Kowdley, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+microRNA+isolation+from+clinical+serum+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Method for microRNA isolation from clinical serum samples.</a> Anal. Biochem. 431, 69-75 (2012).</li>
<li>McAlexander, M. A., Phillips, M. J., Witwer, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Methods+for+miRNA+Extraction+from+Plasma+and+Quantitative+Recovery+of+RNA+from+Cerebrospinal+Fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Comparison of Methods for miRNA Extraction from Plasma and Quantitative Recovery of RNA from Cerebrospinal Fluid.</a> Frontiers in Genetics. 4, 83 (2013).</li>
<li>Kim, Y. K., Yeo, J., Kim, B., Ha, M., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+structured+RNAs+with+low+GC+content+are+selectively+lost+during+extraction+from+a+small+number+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Short structured RNAs with low GC content are selectively lost during extraction from a small number of cells.</a> Mol. Cell. 46, 893-895 (2012).</li>
</ol>

无任何披露内容。

microRNA 群体约占血清总 RNA 的 0.4-0.5%。此外，人血清中还含有较高含量的蛋白质。为了提高 RNA 的纯度并减少蛋白质和苯酚类污染物，我们在传统 Chomczynski 方法的基础上增加了若干步骤进行了改良9。
采用标准的Tri-Reagent RT-LS法（Molecular Research Centre）从血清中分离总RNA，但在本实验室操作时，该方法获得的RNA量较少，且含有多种污染物。
图1 显示了一条紫外分光光度法RNA谱图，在280 nm处显示出蛋白质污染，在270 nm处有苯酚污染，在230 nm处存在其他有机污染物。在260 nm处还检测到了试剂硫氰酸胍。
为了解决血清RNA得率低和减少污染的问题，我们在标准的Tri-Reagent RT-LS流程基础上增加了一系列优化步骤。首先，我们发现将血清按1:5比例稀释可降低蛋白质污染。该步骤已被其他研究推荐10，并...

近年来，人们越来越重视发现可用于早期检测人类疾病的新颖生物标志物。许多研究集中于利用小RNA（如微小RNA2（miRNA或miR））作为潜在的标志物。这类小RNA存在于血清等体液中，研究表明其对降解具有较强抵抗力，并且在多种不同的环境条件下均保持稳定3。鉴于这些特性，血清或循环miRNA是理想的生物标志物4,5。目前，从小分子生物液体中分离小RNA主要有两种方法。第一种方法采用基于离心柱的技术来结合并洗脱小RNA6，而第二种方法则使用经典的苯酚与硫氰酸胍试剂方案7。我们开发了一种简单、高效且无需离心柱的小RNA提取方案，可用于从人血清中分离小RNA。所获得的RNA可直接用于后续实验，包括DNA寡核苷酸芯片分析和RNA测序。
本实验方案的制定源于我们在使用基于苯酚的方法从血清中分离RNA时遇到了若干问题。传统的Chomczynski方法在大多数实验室中被广泛采用，且多数商业供应商均可提供相应的试剂。然而，尽管这些方法应用广泛，但目前尚未建立严格的规范指南，以确保从体液（尤其是血液或血清）中稳定地提取出高质量的RNA。
从血清中分离RNA时常见的问题包括RNA得率低以及分离过程中所用试剂（尤其是苯酚）的污染。我们的方法可消除这些苯酚污染物，从而为下游分析（如定量PCR（qPCR）和RNA测序）提供高质量的RNA。我们进一步在miRNA芯片上对该RNA进行了检测。

<table><tbody><tr><td>Tri-Reagent RT LS</td><td>Molecular Research Center，美国</td><td>TR 118</td><td></td></tr><tr><td>无RNase水&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>GIBCO Invitrogen</td><td>10977-023</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶K</td><td>Finnzymes，芬兰</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>重相锁管</td><td>5PRIME</td><td>2302830</td><td>2 ml容量</td></tr><tr><td>DNA Lobind管</td><td>Eppendorf</td><td>0030 108.078</td><td>1.5 ml容量</td></tr><tr><td>糖原</td><td>Invitrogen，美国</td><td>10814-010</td><td>5 mg/ml</td></tr><tr><td>RNA级异丙醇</td><td>Sigma Aldrich，美国</td><td>I9516</td><td>100%</td></tr><tr><td>冷冻离心机</td><td>John Morris</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop紫外-可见分光光度计</td><td>Thermo Fisher Scientific，美国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNA级乙醇</td><td>Sigma Aldrich，美国</td><td>E7023</td><td>70%</td></tr><tr><td>Agilent 2100 生物分析仪</td><td>Agilent，美国</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

人血清中分离小非编码rna

Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum

RNA 及其表达的分析是许多实验室的常规工作。近年来，微小 RNA（如 microRNA）的发现备受关注，这类小 RNA 存在于哺乳动物细胞中。这些小 RNA 是强有力的基因调控因子，控制着生长、发育和细胞死亡等重要通路，因此其在体液中的表达水平引起了广泛研究兴趣。这主要是因为它们在癌症等人类疾病中出现表达失调，并具有作为血清生物标志物的潜在应用价值。然而，血清中 miRNA 表达的分析可能存在困难。通常情况下，血清样本量有限，且其中总 RNA 含量较低，而小 RNA 仅占总 RNA 的 0.4–0.5%1。因此，从血清中分离出足量且高质量的 RNA 是当前研究人员面临的主要挑战之一。在本技术论文中，我们展示了一种仅需 400 µl 人血清即可获得足量 RNA 的方法，适用于 DNA 芯片或 qPCR 分析。该方法的优势在于操作简便且能获得高质量 RNA。该方法无需专门用于小 RNA 纯化的小柱，仅使用普通实验室常见的通用试剂和设备。我们的方法采用相位锁定凝胶（Phase Lock Gel）以消除苯酚污染，同时保证 RNA 的高质量。此外，我们还引入了一个额外步骤，以在分离过程中进一步去除所有污染物。该方案在从血清中分离总 RNA 时效果显著，RNA 产量可达最高 100 ng/µl，同时也可适用于其他生物组织样本。

图1 显示了从血清中分离的RNA的典型紫外/可见光吸收光谱。从该图谱中我们观察到，在280 nm处存在蛋白质污染，在270 nm和230 nm处分别存在酚和有机污染物。此外，在260 nm处还检测到残留的硫氰酸胍。为了减少污染物，我们对标准的Tri-Reagent RT-LS操作流程进行了一系列优化步骤。我们添加了5 mg/ml的糖原，以提高总RNA得率并减少污染（黑色线条，图1A）。
进一步观察发现，异丙醇去除后，RNA沉淀周围仍残留约100–300 µl洗涤缓冲液。因此在实验步骤中增加了一次离心，小心移除残留的洗涤液。这一操作使吸光度峰从270 nm shifted至280 nm（红色曲线，图1B）。我们推断，该“瞬时”离心步骤降低了270 nm处的苯酚污染，因此280 nm处的吸收峰更可能是由蛋白质污染所致。
为进一步提高RNA产量并减少蛋白质残留，我们增加了一个Phase Lock Gel步骤。该步骤可实现水相的完全转...

本方案描述了一种从人血清中提取小RNA的方法。我们已采用该方法从癌症患者血清中分离microRNA，用于DNA芯片和单重定量PCR分析。本方案使用苯酚和硫氰酸胍试剂，并进行了改良，以获得高质量的RNA。

人血清中分离小非编码RNA

RNA及其表达的分析是许多实验室的常见工作。其中，microRNA等小RNA的出现尤为重要，它们是一类……

本实验的总体目标是从血清样本中分离出高质量的RNA。通过使用我们优化的常用MRC try试剂RTLS方案，首先将血清与无核酸酶水按1:5的比例稀释，以降低蛋白质污染。第二步是在第一次离心步骤中引入两毫升相锁管。这可以将大部分污染物（如酚和蛋白质）截留在有机相中。接下来，第三步也是最后的优化步骤是在12,000 ×g条件下进行瞬时离心，以在乙醇洗涤前去除RNA沉淀中的任何残留污染物。最后一步是，如果需要更高的总RNA得率，可将来自同一患者的两份修饰后的RNA样品合并。最终，通过使用这种改良方法，即在无核酸酶水中溶解血清，采用相位锁定管来截留主要污染物，并引入瞬时离心步骤，我们证明了可以从血清RNA提取过程中最大限度地回收小的非包被RNA。与现有的标准三醇RNA分离方案等方法相比，该技术的主要优势在于，通过简单的改进，我们可以最大限度地提高从血清中提取的RNA产量。通常，刚接触该方法的研究人员会遇到困难，因为血清中的小RNA含量较低。优化后的方法及这些步骤的可视化展示将有助于提高这些RNA的回收率，并指导初学者成功完成分离操作。首先将预先制备的冷冻血清样本置于冰上解冻，然后取400 µL新鲜解冻的血清转移至已标记的微量离心管中。接着，加入100 µL无RNase的水稀释血清，并加入50 µL浓度为1 mg/mL的蛋白酶K。随后，将稀释后的血清在37 °C孵育20分钟，以充分进行蛋白质消化，确保在加入1.5 mL TRI Reagent RTLS和100 µL 4-丙醇胺后完全溶解。轻轻倒置匀浆液，重复吹打5秒。随后将混合液转移至已标记的2毫升重相锁定管中。在4摄氏度条件下，以12,000 × g离心20分钟。随后，将所得水相溶液小心地倾倒1毫升至新的DNA低吸附离心管中。有机相和界面相应被截留在相分离管的白色凝胶层下方。然后向水相溶液中加入5微升糖原和500微升100%异丙醇。轻轻颠倒混匀溶液，并在负20摄氏度下孵育过夜。过夜孵育后，在4摄氏度离心机中以12,000 ×g离心20分钟。随后弃去澄清的上清液，并在4摄氏度离心机中以16,000 ×g短暂离心2分钟。使用移液器小心移除沉淀物周围的澄清溶液。然后用1毫升70%乙醇洗涤沉淀物，并在10,000 ×g条件下离心样品10分钟。为观察沉淀物，将离心管置于深色背景前倾斜，弃去洗涤液。重复洗涤。进行下一步。将沉淀重悬于10 µL无RNA酶的水中。通过在55摄氏度下加热样品5分钟，确保沉淀完全溶解。在此期间，通过反复移液混匀样品，以获得更高的总RNA得率。每个患者制备两份RNA样本。使用紫外分光光度法对重悬的RNA进行定量。使用分光光度计并通过2100型生物分析仪评估RNA质量。然后将混合的RNA样本储存在-80摄氏度，用于后续实验。来自人血清的RNA分光光度谱显示，由于在传统的Chum Chomsky方法基础上增加了多个步骤，RNA得率得到显著提高。从人血清中分离RNA的典型紫外吸收谱图与经过优化步骤（包括添加糖原、额外离心以及联合使用这些方法）后的谱图形成对比，这些优化手段可减少污染物并提高总RNA得率。使用相位锁定凝胶可进一步提高RNA样品的纯度，该凝胶能够捕获苯酚和蛋白质。此外，增加血清体积对RNA得率具有显著影响。通过生物分析仪图谱进一步分析样品质量。在约21个核苷酸处出现单一峰，代表微小RNA组分。随后按照既定流程进行阵列分析和定量PCR。该图谱包含三个头颈部癌样本和一个正常样本S，显示了微小RNA的表达情况，采用层次聚类法进行分析，并以热图形式呈现，其中可清晰观察到微小RNA的上调与下调表达模式。针对特定的microRNA生成了以下QPCR扩增曲线。随后利用该数据绘制正常血清的原始CT值。一旦掌握，只要严格按照操作步骤进行，该技术可在任意数量的患者样本中实施，并在当今条件下获得高质量的RNA。此外，还可采用定量PCR或高通量测序等其他方法，以回答生物标志物发现与验证等进一步的科学问题。

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科研

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生物学

小非编码RNA从人血清中分离

本文展示了外泌体的分离、纯化与检测方法，以及对其分子成分进行分析的技术。这些方法适用于从细胞培养上清和生物体液中分离外泌体，不仅可用于分子成分分析，也可用于功能研究。...

含RNA外泌体的分离与表征

本文描述了一种通过特异性寡核苷酸定向富集的方法，用于分离在真核细胞中形成的特定同源核糖核蛋白复合物（RNP）。我们通过分离与逆转录病毒5'非翻译区结合的同源RNP（其组分包含DHX9/RNA解旋酶A）来展示该方法的适用性。...

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一种基于寡核苷酸的串联RNA分离方法以回收真核生物mRNA-蛋白质复合物

本方案展示了如何从细胞培养基中纯化细胞外microRNA，用于小RNA文库构建及下一代测序。文中描述了多种质量控制检查点，帮助读者了解在处理低丰度样本（如exRNA）时的预期结果。...

分离、测序与分析人源间充质干细胞的细胞外微小RNA

本文介绍了一种分步策略，用于分离小RNA、富集microRNA，并为高通量测序制备样品。随后，我们描述了如何使用开源工具对测序读长进行处理，并将其比对至microRNA序列。...

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环状RNA（circRNA）是一类非编码RNA，可能在转录调控以及介导蛋白质间相互作用中发挥功能。在评估了构建circRNA测序文库的多个不同参数后，本文整合并提出了一种利用RNase...

利用RNA测序鉴定环状RNA

本方案从动物和人类受试者的粪便样本中分离高质量的总RNA。采用商业化的miRNA提取试剂盒，并进行了重要改进，以获得优化产量和质量的高纯度RNA。所提取的RNA适用于大多数下游RNA分析，如测序、微阵列和逆转录PCR（RT-PCR）。...

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蜱虫中微小RNA的分离

关键词：微小RNA，蜱虫，RNA提取，分子生物学，非编码RNA 离体 唾液腺培养与细胞外囊泡

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