人血清中分离小非编码RNA

本实验的总体目标是从血清样本中分离出高质量的RNA。通过使用我们优化的常用MRC try试剂RTLS方案，首先将血清与无核酸酶水按1:5的比例稀释，以降低蛋白质污染。

第二步是在第一次离心步骤中引入两毫升相锁管。这可以将大部分污染物（如酚和蛋白质）截留在有机相中。接下来，第三步也是最后的优化步骤是在12,000 ×g条件下进行瞬时离心，以在乙醇洗涤前去除RNA沉淀中的任何残留污染物。

最后一步是，如果需要更高的总RNA得率，可将来自同一患者的两份修饰后的RNA样品合并。最终，通过使用这种改良方法，即在无核酸酶水中溶解血清，采用相位锁定管来截留主要污染物，并引入瞬时离心步骤，我们证明了可以从血清RNA提取过程中最大限度地回收小的非包被RNA。

与现有的标准三醇RNA分离方案等方法相比，该技术的主要优势在于，通过简单的改进，我们可以最大限度地提高从血清中提取的RNA产量。通常，刚接触该方法的研究人员会遇到困难，因为血清中的小RNA含量较低。优化后的方法及这些步骤的可视化展示将有助于提高这些RNA的回收率，并指导初学者成功完成分离操作。

首先将预先制备的冷冻血清样本置于冰上解冻，然后取400 µL新鲜解冻的血清转移至已标记的微量离心管中。接着，加入100 µL无RNase的水稀释血清，并加入50 µL浓度为1 mg/mL的蛋白酶K。随后，将稀释后的血清在37 °C孵育20分钟，以充分进行蛋白质消化，确保在加入1.5 mL TRI Reagent RTLS和100 µL 4-丙醇胺后完全溶解。

轻轻倒置匀浆液，重复吹打5秒。随后将混合液转移至已标记的2毫升重相锁定管中。在4摄氏度条件下，以12,000 × g离心20分钟。

随后，将所得水相溶液小心地倾倒1毫升至新的DNA低吸附离心管中。有机相和界面相应被截留在相分离管的白色凝胶层下方。然后向水相溶液中加入5微升糖原和500微升100%异丙醇。

轻轻颠倒混匀溶液，并在负20摄氏度下孵育过夜。过夜孵育后，在4摄氏度离心机中以12,000 ×g离心20分钟。随后弃去澄清的上清液，并在4摄氏度离心机中以16,000 ×g短暂离心2分钟。

使用移液器小心移除沉淀物周围的澄清溶液。然后用1毫升70%乙醇洗涤沉淀物，并在10,000 ×g条件下离心样品10分钟。为观察沉淀物，将离心管置于深色背景前倾斜，弃去洗涤液。

重复洗涤。进行下一步。将沉淀重悬于10 µL无RNA酶的水中。

通过在55摄氏度下加热样品5分钟，确保沉淀完全溶解。在此期间，通过反复移液混匀样品，以获得更高的总RNA得率。每个患者制备两份RNA样本。使用紫外分光光度法对重悬的RNA进行定量。

使用分光光度计并通过2100型生物分析仪评估RNA质量。然后将混合的RNA样本储存在-80摄氏度，用于后续实验。来自人血清的RNA分光光度谱显示，由于在传统的Chum Chomsky方法基础上增加了多个步骤，RNA得率得到显著提高。

从人血清中分离RNA的典型紫外吸收谱图与经过优化步骤（包括添加糖原、额外离心以及联合使用这些方法）后的谱图形成对比，这些优化手段可减少污染物并提高总RNA得率。使用相位锁定凝胶可进一步提高RNA样品的纯度，该凝胶能够捕获苯酚和蛋白质。此外，增加血清体积对RNA得率具有显著影响。

通过生物分析仪图谱进一步分析样品质量。在约21个核苷酸处出现单一峰，代表微小RNA组分。随后按照既定流程进行阵列分析和定量PCR。该图谱包含三个头颈部癌样本和一个正常样本S，显示了微小RNA的表达情况，采用层次聚类法进行分析，并以热图形式呈现，其中可清晰观察到微小RNA的上调与下调表达模式。

针对特定的microRNA生成了以下QPCR扩增曲线。随后利用该数据绘制正常血清的原始CT值。一旦掌握，只要严格按照操作步骤进行，该技术可在任意数量的患者样本中实施，并在当今条件下获得高质量的RNA。此外，还可采用定量PCR或高通量测序等其他方法，以回答生物标志物发现与验证等进一步的科学问题。