结合单分子操纵和成像蛋白-DNA相互作用的研究
2014年8月27日
在这里，我们描述了仪器和方法，用于检测单荧光标记的蛋白质分子与悬浮两层光学俘获微球之间的单个DNA分子的相互作用。
该程序的总体目标是观察单个 DNA 结合蛋白和 DNA 分子之间的动态相互作用。这是通过在定制的显微镜中结合两种单分子技术、双光镊和荧光显微镜来实现的。该装置还配备了明场照明，用于样品的可视化和纳米稳定性。
第二步，构建一个集成在微流系统中的多通道流通池，以允许多达四个层流有效地募集和组装实验所需的所有组件。接下来，组装单分子构建体以进行实验。首先，在第一个通道中用双光镊捕获两个条状铁蛋白包被的微球。
然后将两个被捕获的磁珠移动到第二个通道，以允许用生物素标记的 DNA 模板附着在两端。通过 A DNA 力延伸分析在第三个通道中检查单个 DNA 分子的存在。最后，名为 DNA 哑铃的微珠 DNA 珠构建体被移动到存在荧光标记的乳糖阻遏蛋白的蛋白质通道。
获得的结果显示单个 LAC 眼分子在单个拉伸 DNA 分子上的扩散和特异性结合以及 LAC 眼球运动动力学参数的定量。与现有的单分子方法相比，该技术的主要优点是可以控制施加到新分子上的张力，可以精确跟踪结合蛋白在纳米稳定点上的运动，以及能够在远离覆盖睡眠表面的地方进行作。这种方法可以帮助回答有关蛋白质 DNA 相互作用的关键问题，尤其是关于基因表达调控的机制，以及靶标搜索机制中蛋白质沿 DNA 扩散的动力学。
该方法的这些演示对于展示流动池样品处理和拍打 DNA 珠构建体组装的实际方面非常有用。本视频将首先演示如何使用粘在盖玻片表面上的微珠作为参考来检查两个捕集激光器的指向稳定性。有关光镊装置的设计和构造的详细信息，请参阅随附的协议文本。
使用 24 x 60 毫米的盖玻片将两微升硅胶珠铺在 24 x 32 毫米的盖玻片表面。使用两张双面胶带。将 24 x 32 mm 的盖玻片贴在显微镜载玻片上以创建流通池。
用 50 毫摩尔磷酸盐缓冲液填充流通池，并用硅脂图像密封。在明场显微镜下，一个硅胶珠以大约 2000 倍的放大倍率显示。视场应约为 7 x 5 微米，以 7、68 x 5、76 像素采集，以便珠状图像的直径约为 190 像素，使用反馈软件补偿热漂移，该软件从图像中心计算 XY 位置，从衍射环计算 Z 位置并校正漂移。
以纳米精度或更好的精度移动压电平台，将左陷阱的中心与磁珠中心重叠，并测量位置噪声及其与象限检测器光电二极管或 QDP 的标准偏差。对正确的疏水阀重复测量。位置噪声的标准偏差应在几纳米范围内，以允许精确定位 DNA 结合蛋白以制造流动池。
首先使用金刚石尖端在 76 x 76 x 1 毫米的显微镜上钻出直径为 1 毫米的孔。滑动以创建 4 个入口和 1 个出口。这将允许最多四个并行缓冲区流。
每个都包含实验微珠所需的一种不同组分、DNA 荧光标记蛋白和成像缓冲液。用乙醇清洁显微镜载玻片，将端口居中，插入 O 形圈，将粘接环放在载玻片中，围绕检修孔。在此步骤中必须戴上手套以避免指纹，否则会干扰粘合过程。
在第二个载玻片的帮助下，将 nano 端口夹在载玻片上，并将其放入预热 180 摄氏度的烘箱中一小时，以便完全连接。同时，在一张纸上画出流通池的轮廓图案。通道应约为 3 毫米宽，并与显微镜载玻片上的整个位置相匹配。
将图画放在两块 perfil 上，然后用手术刀沿着绘制的轮廓进行尖锐而连续的切割。去除任何形成的突起，丢弃下层香水层，它仅用于保证干净的支撑。接下来，将包含附加纳米端口的显微镜载玻片倒置在金属支架中。
小心地将 Paraform 腔室轮廓与孔对齐，确保参数不会用清洁的显微镜盖玻片挤出腔室盖的入口和出口，并小心地去除腔室周围的多余参数。将两个预先加热到 120 摄氏度的加热块放在流通池顶部，以对其施加均匀的压力。让封口膜融化约 25 分钟。
下一步是准备压力储液罐和缓冲容器。压力储罐由有机玻璃制成，最多可容纳 6 个缓冲容器。首先，连接缓冲容器出口处的截止阀，以便在阀杆处于垂直位置或在顺时针旋转位置关闭的情况下打开缓冲液流。
在实验过程中，将流通池安装在显微镜载物台上。然后通过聚醚、醚酮或峰值管将截止阀和无法兰旋转装置连接到流通室入口。峰管的内径约为 150 微米千米，内径约为 500 微米的约 3 厘米氟化乙烯丙烯管用作峰管和流通池纳米端口组件之间的连接。
这对于减少腔室入口处的缓冲液流量以避免流通池破损或纳米端口与玻璃分离至关重要。另一方面，单独使用大内径管则需要大量的生物样品。在大气压下将流通室出口连接到打开的 Falcon 管。
该管用于处理从流通室流出的缓冲液。要开始此过程，请向每个缓冲液容器中加入 1 mL 缓冲液 A，并施加 200 毫巴的压力以清洗连接管和流通池。压力控制系统是有能力的。
最后，调整压力储液罐内的气压。检查是否存在气泡，这可能会破坏流动的顺畅性。轻轻轻弹出口管将有助于去除任何残留的气泡，将压力降低到 20 毫巴，并验证所有通道和管子都没有气泡，并且缓冲液在所有通道中以相似的速度流动。
将样品制备至 300 μL 的最终体积。本实验利用链球包被的聚苯乙烯珠子，在两肢上生物素化的线性 DNA，其中包含用于乳糖阻遏蛋白结合的特异性靶序列和荧光标记的乳糖阻遏蛋白。按以下顺序将每个样品添加到其中一个注射器容器中：第一个通道中的磁珠，第二个通道中的 DNA，第三个通道中的成像缓冲液，第四个通道中的标记蛋白质。
在 20 毫巴时打开液流，并打开截止阀，让样品到达流道内。这在微珠通道中很容易检测到。在明场照明下对第一个通道进行成像时，打开两个光镊并在每个陷阱中捕获一个聚苯乙烯珠。
快速移动到第二个通道，以避免其他珠子掉入陷阱。请注意，在磁珠流结束时，很容易注意到到达 DNA 通道。使用一个 AO 光学偏转器或 OD 移动，一个微珠在另一个微珠附近来回捕获，以允许流式扩展的 DNA 附着在两个光学捕获的微珠之间。
当形成 DNA 哑铃时，静态磁珠开始跟随磁珠的运动，磁珠被陷阱主动来回移动。快速移动到缓冲通道并关闭缓冲流。执行力延伸曲线分析以验证是否存在单个 DNA 分子。
这是通过在测量 DNA 张力时将两个珠子分开来实现的。获得单个 DNA 哑铃后，再次打开流路并将哑铃移至蛋白质通道。切换到宽场荧光显微镜以监测标记的乳糖阻遏蛋白与 DNA 的相互作用，关闭流路并开始采集。
该方法能够检测与拉伸 DNA 分子相互作用的单个乳糖阻遏物或 lac 眼分子。在这个代表性的 CH agram 中，一个 lac 眼分子沿着非特异性 DNA 序列扩散，而另一个 lac 眼分子特异性结合到位于 DNA 分子中心的一个纵子上。该图显示了两个 lac 眼分子沿连接两个陷阱中心的方向的位置。
作为时间的函数，分子的位置由径向对称中心算法确定，此处显示的是沿拉伸 DNA 分子扩散的单个 lac 眼分子的均方位移或 MSD 随时间的关系图。蛋白质的扩散系数可以很容易地从数据的线性回归中获得。作和成像技术的结合是一种强大的方法，允许对单个生物聚合物（如 D-N-A-R-N-A 或细胞骨架丝）进行机械控制，并同时定位与聚合物本身相互作用的单个蛋白质分子。
在尝试此程序时，重要的是要记住，结合单分子作和成像技术需要仔细设计实验设置，以确保悬浮聚合物的纳米级稳定性。另一方面，需要适当设计生物探针，以保证捕获 G 激光器和荧光探针之间的特殊分离。有关详细信息，请参阅随附的协议文本。
看完这个视频后，你应该对如何在两个光学快速之间组装 DNA 分子有一个很好的了解，而不是这个构建体的组装。最好使用我们为其提供详细说明的多通道流通池获得。我们还介绍了如何优化缓冲液流并去除气泡，否则可能会影响您的实验。
在组合文本方案中，您可以找到用 bioTE 标记 DNA 的方案，这对于使用链霉亲和素包被的节拍进行组装是必需的，以及标记蛋白质的方案。最后，我们说明了量化单个乳糖抑制蛋白在拉伸 DNA 分子上的结合和扩散的分步作。
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概述
本文描述了一种观察单个DNA结合蛋白与DNA分子之间动态相互作用的方法。该技术结合了双光学镊子和荧光显微镜以实现这一目标。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物物理学
- 单分子技术
- 荧光显微镜
背景
- 理解蛋白质-DNA相互作用对分子生物学至关重要。
- 单分子技术允许对这些相互作用进行详细观察。
- 光学镊子可以高精度地操控单个分子。
- 荧光显微镜提供对标记分子的可视化。
研究目的
- 观察单个荧光标记蛋白与DNA分子之间的相互作用。
- 开发一个集成多种技术的自定义显微镜。
- 增强对单分子水平分子相互作用的理解。
使用的方法
- 结合双光学镊子和荧光显微镜。
- 使用明场照明进行样品可视化。
- 构建多通道流动池以实现高效的组件组装。
- 使用滴定蛋白包裹的微球组装单分子结构。
主要结果
- 成功观察到单分子水平的蛋白质-DNA相互作用。
- 展示了自定义显微镜设置的有效性。
- 对蛋白质结合DNA的动力学提供了见解。
- 建立了一种可靠的方法用于未来的单分子研究。
结论
- 所开发的方法允许对蛋白质-DNA相互作用进行详细研究。
- 这种方法可以应用于各种生物学研究问题。
- 未来的研究可以在此技术基础上探索其他分子相互作用。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables precise mechanical control and real-time imaging of protein-DNA interactions, providing quantitative insights into binding kinetics and diffusion dynamics. By eliminating surface artifacts and allowing sequence-specific interrogation under tension, it supports target validation and mechanistic de-risking in nucleic acid therapeutic discovery. The approach enhances predictive confidence in early-stage programs by revealing how mechanical parameters influence protein search and binding mechanisms.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing specific binding and one-dimensional diffusion of DNA-binding proteins.
- Operational Value: Provides direct observation of lacI-operator interactions, supporting functional validation of transcriptional regulators.
- Predictive Value: Quantifies kinetic parameters of protein motion, informing target engagement models and binding affinity predictions.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Establishes a reproducible platform for monitoring protein-DNA interactions under controlled mechanical conditions.
- Quantitative Output: Generates measurable outputs such as diffusion coefficients and binding dwell times via mean square displacement analysis.
- Platform Reuse: Adaptable to other DNA-binding proteins or molecular motors where tension modulation is relevant.
Translational & Preclinical Research
- Mechanistic De-risking: Clarifies how mechanical tension influences protein diffusion and target search, informing models of gene expression regulation.
- Translational Continuity: Bridges biophysical mechanism with functional outcomes in transcriptional control pathways.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by revealing how sequence-specific binding competes with non-specific diffusion under physiological mimicry.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, enabling hypothesis testing and target validation prior to lead identification by providing mechanistic insights into protein-DNA dynamics.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by revealing how proteins navigate DNA landscapes via diffusion and specific binding.
- Screening: Delivers assay-ready systems with nanometer stability and quantitative readouts for binding and diffusion events.
- Analytics: Enables extraction of diffusion coefficients and binding kinetics from spatial-temporal tracking data.
- Translational Research: Connects single-molecule mechanism to transcriptional regulation models only when supported by observed operator-specific binding.
- Enterprise Reuse: Represents a modular capability for studying any protein-nucleic acid interaction where force and fluorescence readouts are informative.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in protein-DNA interactions by correlating binding events with mechanical state and DNA sequence.
- Operational Value: Ensures reproducibility through dual-bead stabilization and drift correction, enabling precise nanometer localization.
- Strategic Value: Improves target selection confidence by distinguishing specific binding from non-specific diffusion under controlled tension.
- Portfolio Impact: Informs prioritization of nucleic acid-targeting modalities by revealing kinetic barriers to target search.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical trapping, fluorescence microscopy, and microfluidic flow cell design.
- Dependent on nanometer-stable instrumentation including piezo stages and feedback systems for drift compensation.
- Necessitates standardization across teams for sample preparation, including biotinylated DNA and fluorescently labeled proteins.
- Involves adaptation considerations when extending to other polymers such as actin or microtubules where track mechanics differ.
- Limited by the need for surface-free environments, which while advantageous, increases complexity in sample handling and buffer exchange.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:39
Optical Tweezers Setup with Nanometer Stability
4:40
Microfluidics
8:36
Combined Optical Trapping and Single-molecule Fluorescence Imaging Experiments
11:50
Results: Detection of Single Protein Molecules Interacting with a Single DNA Molecule
12:56
Conclusion
