Name: 结合单分子操纵和成像蛋白-DNA相互作用的研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 43 s
Description: 学习利用双光镊与荧光显微镜相结合的单分子技术，在定制显微镜中观察单个DNA结合蛋白与DNA分子的动态相互作用。该方法可实现纳米级精度的蛋白质定位与力学控制。

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感谢 Gijs Wuite、Erwin J.G.&#160;Peterman 和 Peter Gross 在微流控技术方面的帮助，以及 Alessia Tempestini 在样品制备方面的协助。本研究由欧盟第七框架计划（FP7/2007-2013）资助，资助协议编号为 n° 284464；同时获得意大利教育、大学与研究部 FIRB 2011 RBAP11X42L006、Futuro in Ricerca 2013 RBFR13V4M2 项目，以及旗舰项目 NANOMAX 框架内的资助。

1. 具有纳米级稳定性的光镊装置
实验装置必须提供两个光镊，其指向稳定性需达到纳米级，且捕获激光的强度波动低于1%。在典型张力（1 pN至数十pN）、捕获刚度（0.1 pN/nm）和测量带宽（图像采集速率20 sec-1）条件下，满足上述条件可确保哑铃结构的纳米级稳定性。实验装置示意图见图&#160;1。
<ol>
	<li>光镊的设计与构建15,17：
	<ol>
		<li>将实验装置安装在带有主动隔振系统的光学平台上，以减少机械振动。将显微镜结构安装在弹性隔振器上，以吸收声学噪声及显微镜结构的机械共振。</li>
		<li>在捕获激光光路中、靠近激光源的位置插入一个光隔离器，以减少因光反馈引起的随机振幅波动。</li>
		<li>尽可能缩短捕获激光的光路长度，并将整个光路封闭在密闭箱体内，以减少由气流和湍流引起的激光指向波动。</li>
		<li>通过将单一近红外激光源（Nd:YAG 激光器，波长 1,064 nm）分成两束正交偏振的光束，构建双光镊系统。请勿使用时分复用陷阱，因其会在张力下引起哑铃状结构的振荡12。</li>
		<li>使用由直接数字频率合成器（DDS）驱动的声光偏转器（AOD），以实现至少一个光阱的精细移动及对DNA张力的精确调控。与压控振荡器（VCO）相比，DDS可提供更优的光阱稳定性。</li>
		<li>在聚光镜的后焦平面处插入两个四象限探测光电二极管（QDP），以亚纳米级精度检测被捕获微球的位置。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用带宽大于图像采集速率的光电二极管，检查进入显微镜的捕获激光强度波动是否低于1%。</li>
	<li>检查两个捕获激光的指向稳定性：
	<ol>
		<li>制备磷酸盐缓冲液中的二氧化硅微球：取20 μl二氧化硅微球（直径1.54 μm，固含量10%）加入1 ml丙酮中，超声处理30秒，短暂涡旋混匀，于19,000 × g离心2分钟。用1 ml丙酮重悬并重复洗涤一次。再用1 ml 50 mM磷酸盐缓冲液重悬，洗涤两次后，最终重悬于100 μl 50 mM磷酸盐缓冲液中。</li>
		<li>使用二氧化硅微球校准光镊：通过双面胶带（厚度约60 μm）将盖玻片粘附于显微镜载玻片上，制备流动池。注入1 mg/ml的牛血清白蛋白（BSA）溶液，静置3分钟。随后注入用磷酸盐缓冲液稀释1,000倍的二氧化硅微球溶液，并用硅脂密封流动室。在每个光阱中捕获一个微球，并采用功率谱法进行光阱校准18。</li>
		<li>制备戊酸戊酯与硝化纤维素中的二氧化硅微球：取20 μl二氧化硅微球（直径1.54 μm，固含量10%）加入1 ml丙酮中，超声处理30秒，短暂涡旋混匀，于19,000 × g离心2分钟。用1 ml丙酮重悬并重复洗涤一次。再用1 ml戊酸戊酯重悬并洗涤两次。最后将其重悬于含0.1%溶解于戊酸戊酯中的硝化纤维素的戊酸戊酯溶液中。</li>
		<li>用另一片盖玻片（24 × 60 mm）将2 μl溶解于戊酸戊酯加0.1%硝化纤维素中的1.54 μm二氧化硅微球均匀涂布于盖玻片（24 × 24 mm）表面。使用两段双面胶带将该盖玻片固定于显微镜载玻片上，形成流动池。向流动池中注入50 mM磷酸盐缓冲液，并用硅脂密封。</li>
		<li>在明场显微镜下以2,000倍放大倍率成像单个二氧化硅微球。成像视野应为7 × 5 μm，分辨率为768 × 576像素，使微球图像直径约为190像素。使用反馈软件补偿热漂移，该软件如参考文献17所述，通过图像质心计算x-y方向位置，通过衍射环计算z方向位置，并通过压电平台以纳米级或更高精度校正漂移。</li>
		<li>将左侧光阱中心与微球中心重合（此时QDP测得的x-y信号水平应与校准时相同），从QDP读取位置噪声及其标准差。对右侧光阱重复该测量。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 纳米级精度的单分子定位
<ol>
	<li>荧光显微镜的设计与构建15,19
	<ol>
		<li>使用高量子效率且带电子倍增功能的CCD，以达到实现纳米级定位精度所需的高信噪比。</li>
		<li>选择合适的光学系统，使图像像素尺寸约为80 nm（例如，使用约200倍的成像放大倍率，相机像素尺寸为16 μm）。该尺寸足够小，可忽略因像素化导致的定位误差8，同时又足够大，以便每个像素收集到大量的光子。</li>
		<li>激发光源应采用非偏振光（通过非保偏光纤传输）或圆偏振光（通过λ/4波片），以最大化激发单个发色团，无论其取向如何。</li>
		<li>选择能够有效滤除激发光和捕获激光的发射带通滤光片。注意：在我们的实验中，使用Atto532染料标记目标蛋白，并采用中心波长为600 nm、带宽为100 nm的发射带通滤光片。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 微流控技术
为了实现对缓冲液置换和“哑铃”结构组装的精确控制， 即， 在两个光镊微球之间锚定单个DNA分子，必须构建一个定制的层流多通道流动系统。该系统由流动室、压力储液罐和压力控制系统组成。图&#160;2).
<ol>
	<li>流动池制备 
	注意：用于蛋白质-DNA 相互作用单分子实验的流动室最好具有 4 个入口和 1 个出口，以便实现最多 4 路并行缓冲液流，每一路分别包含实验所需的其中一种组分：微珠、DNA、荧光标记的蛋白质以及成像缓冲液。各组分在流动通道中的分离有助于高效组装哑铃结构。此外，成像通道有助于避免扩散蛋白产生的背景荧光，从而获得高信噪比，以实现对 DNA 结合蛋白在几纳米精度范围内的精确定位。
	<ol>
		<li>使用金刚石钻头在显微镜载玻片（76 × 76 × 1 mm）上钻出直径为 1 mm 的孔，以形成 4 个入口和 1 个出口。</li>
		<li>用乙醇清洗显微镜载玻片，并将带有插入的 O 形圈和粘合环的端口居中放置在载玻片上，环绕通孔区域。此步骤中必须佩戴手套，以避免留下指纹，否则会影响粘接过程。</li>
		<li>将 NanoPort 固定到载玻片上，并将其放入预热至 180 °C 的烘箱中加热 1 小时，以确保完全粘附。</li>
		<li>在一张纸上绘制流动池的轮廓图案。通道宽度应约为 3 mm，并与载玻片上的孔位置对齐。</li>
		<li>将图纸置于两层 Parafilm 膜之上，使用手术刀沿所绘轮廓进行锐利且连续的切割。清除任何形成的突起。丢弃下层 Parafilm，该层仅用于提供清洁支撑。</li>
		<li>将已固定 NanoPort 的载玻片倒置放置于金属支架上。</li>
		<li>仔细将 Parafilm 构成的腔室轮廓与孔对齐，确保 Parafilm 不遮挡腔室的入口和出口。</li>
		<li>覆盖一张洁净的显微镜盖玻片（62 × 56 × 0.15 mm），并小心去除腔室周围的多余 Parafilm。</li>
		<li>在流动池上方放置两个预先加热至 120 °C 的加热块，以施加恒定压力。使 Parafilm 熔化约 25 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>压力储液罐与缓冲液容器 
	压力储液罐应由聚甲基丙烯酸甲酯（Plexiglas）或类似材料制成，并能容纳六个缓冲液容器。具备至少两个额外缓冲液容器的可能性可提高仪器的灵活性。请注意，透明的容器和管路有助于操作流动系统并排查气泡滞留问题。已灭菌且一次性使用的鲁尔锁式注射器（2.5 ml），其活塞已预先移除，是良好的缓冲液容器，且便于与入口管路连接。请确保总液体体积远小于压力储液罐内的空气体积，这是获得平稳且稳定流动的关键条件。
	<ol>
		<li>在缓冲液容器出口处连接开关阀，以便在实验过程中开启或关闭缓冲液流。</li>
		<li>将流动池安装在显微镜载物台上。使用聚醚醚酮管（内径约 150 µm）和无法兰接头将开关阀连接至流动室入口。在管路与流动池的 NanoPort 组件之间加入约 3 cm 的氟化乙烯丙烯共聚物管（内径约 500 µm）作为连接段。此步骤至关重要，可降低进入腔室的缓冲液流速，避免流动池破裂或 NanoPort 从玻璃上脱落。另一方面，单独使用大内径管路将需要大量生物样品。</li>
		<li>将流动室出口连接至一个开放的 Falcon 管，使其处于大气压下。该管用于收集从流动室流出的废液缓冲液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>压力控制系统
	<ol>
		<li>构建一个能够精细调节压力储液罐内部气压的压力控制系统。可通过使用两个由计算机控制的电磁阀实现，其中一个连接至 +0.5 atm 的气源（压缩机），另一个连接至大气压。电磁阀每次重复开启约 7 毫秒，以增加或降低管路中的压力，直至达到目标值。注意：该方法改编自 Carlos Bustamante20，相比使用步进电机驱动的注射泵21，可实现更平稳的流动。</li>
		<li>添加一个由自定义软件控制的压力传感器，用于监测施加在压力储液罐上的实际压力。典型的操作压力约为 20 mBar（用于哑铃结构组装）和 200 mBar（用于清洗流动系统组件）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 使用生物素标记的脱氧胞苷三磷酸（biotin-dCTP）进行DNA加尾
DNA 分子的长度应超过 1 μm，以利于在流场中伸展并锚定到被捕获的微珠上。此外，较长的 DNA 可防止红外捕获光照射到 DNA 结合蛋白上。这一点尤为重要，因为激发态发色团吸收红外光会导致光漂白加剧。注意：本研究中使用的 DNA 分子长度为 3.7 μm，包含三个拷贝的主要操纵子 O1，以及各一个拷贝的两个辅助操纵子 O2 和 O3。这些序列被插入到分子的中部，因此距离被捕获的微珠和红外激光束大致等距。
<ol>
	<li>将1 pmol线性DNA 3’末端与60 pmol生物素-14-dCTP、4 μl 5x末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）缓冲液（1&#160;M焦酒石酸钾，125&#160;mM Tris，0.05%&#160;(v/v) Triton X-100，5&#160;mM CoCl2（25°C时pH&#160;7.2））、1.5 μl TdT以及ddH2O混合，总体积为20 μl。在37 °C孵育15分钟。此步骤可在每条DNA末端最多添加60个核苷酸。请注意，与隐匿末端或平末端相比，DNA 3’突出末端的加尾效率更高。</li>
	<li>使用离心柱或苯酚/氯仿抽提后接乙醇沉淀的方法纯化加尾后的DNA，以去除TdT反应缓冲液中的CoCl2 。</li>
	<li>纯化后，DNA可在4 °C保存数周，或在-20 °C长期保存，但应避免反复冻融。</li>
</ol>
5. 使用 ATTO532 标记蛋白质巯基
通过修饰半胱氨酸残基进行标记时，不得改变蛋白质的活性。为解决这一问题，我们使用了一种LacI突变体LacIQ231C，该突变体在每个单体的第231位仅含有一个半胱氨酸。该突变体保留了与野生型相同的特性，且在第231位进行化学修饰已被证明不会影响蛋白质的稳定性22。注意：我们使用ATTO532马来酰亚胺对蛋白质进行了标记。
<ol>
	<li>确保蛋白溶解于 pH 7.0 至 7.5 的缓冲液中，蛋白浓度为 2 至 10 mg/ml。注：本实验中，LacI 溶解于含 0.3 M 磷酸钾、5% 葡萄糖、pH 7.5 的缓冲液（缓冲液 A）中。</li>
	<li>将盐酸三(2-羧乙基)膦（TCEP）溶于 H2O 中，配制成终浓度为 100 mg/ml 的溶液。TCEP 溶液需现用现配。</li>
	<li>取 100 μl 蛋白溶液与 3 μl TCEP 混合，轻轻涡旋震荡。</li>
	<li>将染料溶于 N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，配制成终浓度为 10 mg/ml 的溶液，操作时需避光。涡旋震荡至完全溶解。</li>
	<li>反应体系配制：向蛋白与 TCEP 的混合液中加入 33 μl 染料，轻轻涡旋震荡。短暂离心以收集全部溶液。</li>
	<li>将反应体系在 20 °C 条件下于摇床（8,000 rpm）中孵育 2 小时（或在 4 °C 过夜），并避光。</li>
	<li>将还原型 L-谷胱甘肽（GSH）溶于 H2O 中，配制成终浓度为 100 mg/ml 的溶液。向反应体系中加入 3 μl GSH，在 8,000 rpm 摇床中孵育 15 分钟。GSH 可通过封闭巯基的反应活性来终止反应。</li>
	<li>使用标准凝胶过滤柱、透析或离心浓缩管纯化标记后的蛋白。注：本实验中，使用截留分子量为 10&#160;kDa 的离心浓缩管纯化标记的 LacI。
	<ol>
		<li>用最多 12 ml 缓冲液 A 稀释反应混合物，转移至浓缩装置中，在 8,000 × g、4 °C 条件下离心 1 小时。标记的 LacI 被浓缩至约 500 μl，过量染料则透过滤膜进入穿滤液。弃去穿滤液，重复步骤 5.8.1 至少三次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将标记后的蛋白分装成小份，于 -80 °C 保存。避免反复冻融。</li>
</ol>
6. 光镊与单分子荧光成像联合实验
<ol>
	<li>向缓冲液容器中加入1 ml缓冲液A，并施加200 mBar压力以冲洗连接管路和流通池。为最大限度促进结合蛋白在DNA上的扩散，此处及后续步骤中，缓冲液A可替换为低离子强度缓冲液。注意：本实验中使用的是0.5×TBE缓冲液。</li>
	<li>检查是否存在气泡，气泡可能影响流动的平稳性。轻轻敲击出口管路有助于去除残留的气泡。</li>
	<li>将压力降至20 mBar，并确认所有通道和管路中无气泡，且缓冲液在各通道中的流速相近。</li>
	<li>将样品配制至终体积为 300 µl：包被链霉亲和素的聚苯乙烯微珠（直径 1.87 µm）；两端生物素标记的线性 DNA，浓度为 20 pM（按第 4 节所述制备）；LacI 四聚体（经 ATTO532 标记，按第 5 节所述），浓度为 300 pM。</li>
	<li>将每个样品按以下顺序加入注射器容器中：第一通道加入珠子，第二通道加入DNA，第三通道仅加入成像缓冲液（缓冲液A + 氧清除系统），第四通道加入标记的蛋白质。</li>
	<li>以200 mBar的压力通液3分钟，使样品进入流道。随后将压力降至20 mBar。</li>
	<li>在明场照明下对第一通道进行成像时，开启两个光镊，并在每个光阱中捕获一个聚苯乙烯微球。</li>
	<li>迅速转移到第二个通道，以避免其他微珠落入捕获区域。注意，微珠流结束时即可明显观察到微珠已到达DNA通道。</li>
	<li>使用一个声光偏转器（AOD），将一个光镊捕获的微球在另一个微球附近来回移动，以促使流动拉伸的DNA连接于两个光捕获微球之间。当形成DNA哑铃结构时，静止的微球将开始跟随由光镊主动来回移动的微球的运动。</li>
	<li>迅速移至缓冲通道并关闭缓冲液流。进行力-伸展曲线分析4,23-25 以验证单个DNA分子的存在。如果存在多个分子（即， 在力-延伸曲线的焓增上升阶段发生在短于DNA轮廓长度的位置时，弃用该哑铃形样品，并从步骤6.7重新开始。</li>
	<li>获得单个DNA哑铃结构后，重新开启流体，将哑铃结构移至蛋白通道。切换至宽场荧光显微镜以监测标记的LacI与DNA的相互作用。关闭流体并开始采集图像。</li>
</ol>

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</ol>

作者无披露信息。

在过去十年中，单分子操纵与成像技术在空间和时间分辨率方面取得了显著进展。操纵与成像技术的结合构成了强大仪器的基础，如今可实现对单个生物大分子（如DNA、RNA或细胞骨架丝）机械条件的控制，同时精确定位与同一生物大分子相互作用的单个蛋白质。控制被捕获生物大分子机械条件具有特殊意义。事实上，在活细胞中，核酸会持续受到与其相互作用的酶和蛋白质所引起的机械应力；类似地，由相互作用的蛋白质和分子马达构成的复杂网络会调节细胞骨架丝上的张力。另一方面，检测并精确定位与核酸相互作用的蛋白质的能力，使得能够测量分子相互作用随DNA或RNA序列位置变化的情况。
结合单分子操控与成像技术需要对实验装置和生物构建体进行精心设计。光镊必须提供稳定的支撑，确保悬浮聚合物在纳米级水平上的稳定性。通过仔细隔离实验装置与各种机械噪声源，并尽量减少激光指向和振幅的波动，可实现这种稳定性。利用由直接数字频率合成器（DDS）驱动的声光偏转器（AOD），可实现光镊的精确（亚纳米级）移动。本文中，我们展示了一步步优化并检测光镊在纳米级水平上稳定性的实验方案。
采用配备 ...

单分子（SM）技术在过去三十年中取得了长足发展，旨在克服传统体相溶液测量方法的一些局限性 1-3单个生物分子的操作为测量生物大分子的机械特性提供了机会4 并控制蛋白质-蛋白质的机械参数5 蛋白质-DNA 相互作用6,7单分子荧光检测则是研究蛋白质活性的一种极为通用的工具 体外 和 体内，从而实现以纳米级精度对单个分子进行定位与追踪。事实上，通过将仪器的点扩散函数拟合到单分子图像，其定位精度主要取决于信噪比（SNR），最高可达约一纳米。8,9这些方法在研究运动蛋白的动力学以及DNA结合蛋白靶标搜寻背后的扩散过程方面具有重要应用价值。能够确定扩散系数与DNA序列的关系、蛋白质在靶标上的停留时间，并精确测量一维扩散过程中所探索的DNA长度，这些能力为研究蛋白质-DNA相互作用动力学以及特异性靶标搜寻机制提供了强有力的工具。
最近，这两种技术的结合催生了新一代的实验装置10-14 实现对生物底物（例如肌动蛋白丝或DNA分子）的同时操控，以及对其相互作用伴侣酶（例如肌球蛋白或DNA结合蛋白）的检测与定位。这些技术的主要优势在于能够对被捕获的聚合物施加力学控制，从而研究相互作用动力学与力或扭矩之间的关系。此外，该方法允许在远离表面的环境中测量生化反应，克服了传统单分子方法的主要局限之一。 即， 对被研究分子在表面（如玻璃载片或微球）上的固定化需求。
两种单分子技术的结合需要克服若干技术难题，主要源于对机械稳定性和足够信噪比的要求（尤其是在需要实现纳米级精确定位时）。15特别是当将单分子荧光检测与光镊技术联用时，捕获用红外激光所导致的噪声和光漂白的降低16 以及用于生物复合物组装和实验测量的生化缓冲液的控制11 至关重要。本文介绍了在双光镊/单分子荧光定位装置中成功进行测量的方法。该方法以乳糖阻遏蛋白（LacI）为例进行说明，其中 LacI 经荧光标记（Atto532），并在其结合含有特异性 LacI 结合序列的 DNA 分子（该 DNA 分子被捕获于两个光镊之间）时被检测即， 我们展示了该方法在检测LacI与DNA结合及其在靶标搜索过程中沿DNA轮廓扩散方面的有效性。该方法可适用于任何DNA序列与DNA结合蛋白的组合，以及其他系统（如微管或肌动蛋白丝及其相互作用的马达蛋白）。

<table><tbody><tr><td>弹性体隔振器</td><td>Newport</td><td>Newdamp</td><td>根据显微镜重量和共振频率选择合适的 Newdamp 弹性体</td></tr><tr><td>光学隔离器</td><td>Optics for Research</td><td>IO-3-YAG-VHP</td><td></td></tr><tr><td>Nd:YAG 激光器，1,064 nm 波长</td><td>Spectra-Physics</td><td>Millennia IR</td><td></td></tr><tr><td>声光偏转器 (AODs)</td><td>A&amp;A optoelectronic</td><td>DTS-XY 250</td><td></td></tr><tr><td>直接数字频率合成器</td><td>Analog Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>四象限探测光电二极管</td><td>OSI optoelectronics</td><td>SPOT-15-YAG</td><td></td></tr><tr><td>DIO 和 FPGA 板</td><td>National Instruments</td><td>NI-PCI-7830R</td><td></td></tr><tr><td>卤素灯</td><td>Schott</td><td>KL 1500 LCD</td><td></td></tr><tr><td>聚光镜</td><td>Olympus</td><td>U-AAC 1.4NA Aplanat Apochromat</td><td></td></tr><tr><td>物镜</td><td>Nikon</td><td>CFI Plan Apochromat 60x 1.2NA 水浸</td><td></td></tr><tr><td>532 nm 激光器</td><td>Coherent</td><td>Sapphire</td><td></td></tr><tr><td>CCD 200X 和 2000X</td><td>Hamamatsu&amp;nbsp;</td><td>XC-ST70 CE</td><td></td></tr><tr><td>电子倍增 CCD</td><td>Hamamatsu&amp;nbsp;</td><td>C9100-13</td><td></td></tr><tr><td>纳米精度压电载物台</td><td>Physik Instrumente</td><td>P-527.2CL&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>发射滤光片</td><td>Chroma Technologies</td><td>600/100m</td><td></td></tr><tr><td>二氧化硅微珠 (1.54 mm)</td><td>Bangs Laboratories</td><td>SS04N/5303</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白 (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4287</td><td></td></tr><tr><td>戊酸戊酯&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46022</td><td>易燃液体和蒸气 (No 1272/2008)</td></tr><tr><td>硝化纤维素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N8267-5EA</td><td>易燃固体&amp;nbsp; (No 1272/2008)</td></tr><tr><td>加热块</td><td>MPM Instruments Srl</td><td>M502-HBD</td><td>带两个可拆卸模块；预热至 120 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>NanoPort 组件</td><td>Upchurch Scientific Inc.</td><td>N-333</td><td></td></tr><tr><td>聚醚醚酮管&amp;nbsp;</td><td>Upchurch Scientific Inc.</td><td>1535</td><td></td></tr><tr><td>自制金属支架，用于组装由有机玻璃制成的流动室压力储液器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2.5 ml 鲁尔锁头注射器</td><td>Terumo</td><td>SS 02LZ1</td><td></td></tr><tr><td>关闭阀&amp;nbsp;</td><td>Upchurch Scientific, Inc.</td><td>P-732</td><td></td></tr><tr><td>无法兰接头&amp;nbsp;</td><td>Upchurch Scientific, Inc.</td><td>LT-111</td><td></td></tr><tr><td>氟化乙烯丙烯管&amp;nbsp;</td><td>Upchurch Scientific, Inc.</td><td>1549</td><td></td></tr><tr><td>两个计算机控制的电磁阀</td><td>Clippard, Cincinnati, USA</td><td>ET-2-H-M5</td><td></td></tr><tr><td>压力传感器</td><td>Druck LTD</td><td>PTX 1400</td><td></td></tr><tr><td>生物素-14-dCTP&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>19518-018</td><td></td></tr><tr><td>末端脱氧核苷酸转移酶 (TdT)</td><td>Thermoscientific</td><td>EP0161</td><td></td></tr><tr><td>ATTO532 马来酰亚胺</td><td>Sigma Aldrich</td><td>68499</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N&lt;/em&gt;-二甲基甲酰胺 (DMF)&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>227056</td><td>可燃液体，经皮肤吸收有害。刺激物，致畸物。H226；H303；H312；H316；H319；H331；H360；P201；P261；P280；P305；P351；P338；P311</td></tr><tr><td>三(2-羧乙基)膦盐酸盐 (TCEP)&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4706</td><td></td></tr><tr><td>还原型 L-谷胱甘肽 (GSH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G4251</td><td>急性毒性，经口（类别 5），H303</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15，PLQK Ultracel-PL 膜，10&amp;nbsp;kDa 截留分子量离心浓缩管</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素包被的聚苯乙烯微珠 1.87 &amp;micro;m</td><td>Spherotech, Inc.</td><td>SVP-15-5</td><td></td></tr></tbody></table>

结合单分子操控与成像技术研究蛋白质-dna相互作用

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

本文描述了光镊技术与单分子荧光检测相结合用于研究蛋白质-DNA相互作用的方法。该方法能够在溶液中研究分子间的相互作用（从而避免其他单分子技术中因靠近表面而引起的问题），同时可控制DNA的延伸程度，并追踪相互作用动力学随力学参数和DNA序列的变化。文中阐述了实现单分子有效光捕获和纳米级定位的技术方法。我们展示了在实验条件下，研究标记Atto532的乳糖阻遏蛋白（lacI）与含有特定靶序列（操纵子）的DNA分子之间相互作用的过程。该方法能够观察到蛋白质在操纵子位点上的特异性结合，以及在靶标搜寻过程中沿DNA的一维扩散行为。该技术不仅广泛适用于蛋白质-DNA相互作用的研究，也可应用于分子马达的研究，特别是在需要控制施加于配对轨道聚合物（如肌动蛋白或微管）张力的实验体系中。

在成功的实验中，一个（或多个）标记的蛋白质会在DNA分子上发生结合/解离和/或一维扩散（图3A）。通过定位蛋白质在DNA分子上的位置，可以量化其动力学参数，并将其与DNA序列关联。当采用引起一维扩散的缓冲条件时，可追踪蛋白质的运动轨迹，进而确定例如一维扩散系数D1D等参数。
通过将点扩散函数（PSF）拟合为二维高斯函数，或在处理大量数据集时采用一种更快速的近期发表算法（径向对称中心法，RSC）26,27，可确定每帧图像中单个光斑的精确定位。后一种方法通过确定图像中径向对称性最大的点，实现通常与高斯拟合相当的定位精度。在这两种情况下，均可通过可免费获取的 MATLAB 程序实现追踪27。
图3A 显示了一个典型实验的延时图像，其中单个LacI分子在非特异性DNA序列上扩散，而另一个LacI分子则特异性结合在位于DNA分子中心的一个操纵子上。图3B 显示了两个Lac...

本文介绍了检测单个荧光标记的蛋白质分子与悬浮在两个光镊微球之间的单个DNA分子相互作用的仪器设备和方法。

结合单分子操控与成像技术研究蛋白质-DNA相互作用

本文描述了光镊技术与单分子荧光检测相结合用于研究蛋白质-DNA相互作用的方法。该方法……

本实验的总体目标是观察单个DNA结合蛋白与DNA分子之间的动态相互作用。通过在自行搭建的显微镜系统中结合两种单分子技术——双光镊和荧光显微镜技术，实现这一目标。该系统还配备了明场照明，用于样品的可视化以及纳米级的样品稳定。第二步，构建集成于微流系统中的多通道流动池，以实现最多四股层流，高效捕获并组装实验所需的所有组分。接下来，组装单分子结构以开展实验。首先，在第一个通道中利用双光镊捕获两个涂覆有肌联蛋白的微球。随后将两个被捕获的微珠移至第二个通道，以允许两端均标记有生物素的DNA模板发生连接。通过DNA力-伸展分析在第三个通道中检测是否存在单个DNA分子。最后，将名为DNA哑铃结构的微珠-DNA-微珠复合物移至蛋白通道，该通道中含有荧光标记的乳糖阻遏蛋白。实验结果展示了单个LAC眼分子在单条拉伸DNA分子上的扩散和特异性结合，以及对LAC眼分子运动动力学参数的定量分析。该技术相较于现有的单分子方法具有多项主要优势：能够控制施加于DNA分子的张力，能够精确定位结合蛋白在稳定纳米尺度区域内的运动轨迹，以及能够在远离盖玻片表面的环境中进行操作。该方法有助于解答有关蛋白质-DNA相互作用的关键科学问题，特别是基因表达调控的力学机制，以及蛋白质在DNA上扩散以实现靶标搜寻的动力学过程。该方法的演示对于展示流动池样品处理以及构建 beat DNA 微珠结构的实际操作方面非常有用。本视频将首先演示如何利用固定在盖玻片表面的微珠作为参考，检测两个捕获激光的指向稳定性。有关光镊装置设计与构建的详细信息，请参见配套的实验方案文本。使用 24 × 60 毫米的盖玻片将两微升二氧化硅微珠均匀涂布在 24 × 32 毫米盖玻片表面。利用两段双面胶带，将 24 × 32 毫米的盖玻片固定在显微镜载玻片上，以制成流动池。用 50 毫摩尔的磷酸缓冲液填充流动池，并用硅脂密封。在明场显微镜下观察单个二氧化硅微球，放大倍数约为 2000 倍。视野范围应约为 7 乘以 5 微米，图像分辨率为 768 乘以 576 像素，使微球图像的直径约为 190 像素。通过反馈软件补偿热漂移，该软件根据图像的质心计算 XY 位置，根据衍射环计算 Z 位置，并校正漂移。通过压电平台以纳米级或更高的精度移动，使左侧光镊的中心与微珠中心重合，并利用四象限光电二极管（QDP）测量位置噪声及其标准差。对右侧光镊重复该测量。位置噪声的标准差应在几纳米范围内，以实现对DNA结合蛋白的精确定位，进而制备流动池。首先使用金刚石钻头在一块 76 × 76 × 1 毫米的显微镜载玻片上钻出直径为一毫米的孔，以形成四个入口和一个出口。这将允许多达四个并行的缓冲液流。 每个包含实验所需的珠子、荧光标记的DNA蛋白以及成像缓冲液等不同组分。用乙醇清洁显微镜载玻片，并将带有O形圈的端口居中放置，同时将粘合环置于载玻片上，围绕在通孔周围。此

combining-single-molecule-manipulation-imaging-for-study-protein-dna

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

结合单分子操纵和成像蛋白-DNA相互作用的研究

本文描述了一种采用轻敲模式原子力显微镜（AFM）对质粒DNA、细胞质蛋白以及DNA-蛋白复合物进行成像的可视化方法。该方法包括在生化处理后，用于制备AFM成像样品的多种可选方案。在接近生理状态的缓冲条件下，可观测到含有特定蛋白结合区域的DNA结构。...

利用原子力显微镜观察重组DNA与蛋白质复合物

本视频介绍了一种利用单分子成像技术，在特定基因位点上可视化融合蛋白凝聚体在DNA分子上组装的方法。这些凝聚体的形成源于LCD-LCD和LCD-DBD相互作用，从而能够招募RNA聚合酶II并增强基因转录。...

单分子成像可视化融合蛋白在DNA幕上凝聚体的组装

光激活定位显微镜（PALM）结合单分子示踪技术，可直接观察并定量活体大肠杆菌（Escherichia...

利用光激活单分子示踪技术在活体细菌细胞中可视化蛋白质-DNA相互作用

本文介绍了一种利用全内反射荧光显微镜（TIRFM），结合位点特异性修饰的λ...

在单分子水平上观察量子点标记蛋白与位点特异性修饰的λ DNA之间的相互作用

利用量子点标记的DNA和全内反射荧光显微镜，我们可以在使用未标记蛋白质的情况下研究限制性内切酶的反应机制。这种单分子技术能够大规模多重观测单个蛋白质-DNA相互作用，并可将数据汇总以生成具有充分统计量的停留时间分布。...

限制性内切酶介导的DNA切割单分子停留时间分析

本文介绍了利用单分子成像技术——DNA幕帘法，研究EWS-FLI1凝聚物在DNA上组装的生物物理机制。...

单分子成像观察EWS-FLI1凝聚体在DNA上的组装

DNA幕是一种高通量单分子成像技术，可提供实时可视化多种蛋白质-DNA相互作用的平台。本实验方案利用DNA幕技术研究Abo1的生物学功能及其分子机制，Abo1是一种来自裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）的含溴结构域AAA+...

利用DNA幕技术解析组蛋白组装的分子机制

通过微流控腔室研究可视化单分子生物化学过程时，使用玻璃筒体的气密性注射器、将管路稳定连接至流动池，以及在注射器与管路之间安装切换阀以消除气泡，可极大地方便实验操作。本方案描述了双光镊技术，可用于观察DNA的动态过程及分子间相互作用。...

使用双光镊与微流控技术进行单分子研究

许多内在无序蛋白已被证实参与形成高度动态的生物分子凝聚体，这种行为对多种细胞过程具有重要意义。本文介绍了一种基于单分子成像的方法，用于定量分析蛋白质在活细胞生物分子凝聚体中相互作用的动力学过程。...

生物分子凝聚体中蛋白质相互作用动力学的单分子测量

我们报道了一种混合的群体与单分子检测方法，可直接成像并定量荧光标记的、完全重建的Cdc45/Mcm2-7/GINS（CMG）解旋酶在由光镊固定的线性DNA分子上的运动。...

杂合组装与单分子检测技术用于成像完全重建的CMG的运动

本方案概述了使用配备光学光子重分配功能的转盘共聚焦显微镜进行深层全细胞单分子定位显微镜（SMLM）成像的实验步骤，从而无需定制光学元件或复杂照明即可实现DNA-PAINT成像。...

全细胞超分辨率成像 通过 使用光学光子重分配的旋转盘共聚焦显微镜进行DNA-PAINT成像

学习利用双光镊与荧光显微镜相结合的单分子技术，在定制显微镜中观察单个DNA结合蛋白与DNA分子的动态相互作用。该方法可实现纳米级精度的蛋白质定位与力学控制。

结合单分子操控与成像技术研究蛋白质-DNA相互作用

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