Name: 囊性纤维化跨膜电导调节蛋白表达纯化酿酒酵母 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 12 s
Description: 了解在酿酒酵母中异源表达和纯化囊性纤维化跨膜电导调节蛋白（CFTR）的方法。该技术可高效获取毫克级功能性蛋白，用于药物相互作用研究和囊性纤维化治疗开发。

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本工作由美国囊性纤维化基金会（CFF）通过其CFTR三维结构联盟资助。TR由英国囊性纤维化信托基金研究生奖学金资助，NC由英国生物技术和生物科学研究生理事会（BBSRC）研究生奖学金资助。我们感谢CFF CFTR三维结构联盟的同事们提供的帮助与建议，以及在密码子优化的鸡CFTR序列和纯化标签设计方面给予的支持。&#160;

1. 缓冲液的配制
<ol>
	<li>配制100倍浓度的蛋白酶抑制剂（PI）混合液：将96 mg AEBSF、3.5 mg 胰凝乳蛋白酶抑制剂（chymostatin）、10 mg E64、16.5 mg 亮肽素（leupeptin）、16.5 mg 胃蛋白酶抑制剂（pepstatin）、348 mg PMSF 和 4 mg 亮氨酰氨肽酶抑制剂（bestatin）溶于20 ml DMSO中。分装为每管1 ml，于-20 °C保存。配制100倍浓度的苯甲脒（benzamidine）储备液：将720 mg溶于20 ml超纯水（ddH₂O）中。2O），分装为1 ml等份，于-20 °C保存。此量足以进行一次纯化。所有缓冲液中，PI和苯甲脒储存液均按1:100稀释使用。</li>
	<li>配制“mPIB”缓冲液（0.3 M Tris pH 8，0.3 M 蔗糖，2 mM DTT）和“CFTR”缓冲液（50 mM Tris pH 8，20% (v/v) 甘油，1 mM DTT），并冷却至 4 °C。使用前，根据用于重悬细胞沉淀的 mPIB 体积，按 1:100 比例加入蛋白酶抑制剂混合物和 1:100 比例的苯甲脒例如，使用3.5 ml PI和3.5 ml 苄胺（benzamidine），总体积为350 ml mPIB。</li>
	<li>配制溶解缓冲液。溶血磷脂酰甘油-14（LPG）溶解缓冲液（50 mM Tris pH 8，10% (v/v) 甘油，50 mM NaCl，1 mM DTT，蛋白酶抑制剂（PIs）和 4% (w/v) LPG）和十二烷基麦芽糖苷（DDM）溶解缓冲液（50 mM Tris pH 8，20% (v/v) 甘油，1 M NaCl，1 mM DTT，蛋白酶抑制剂，4% (w/v) DDM）。可将缓冲液置于超声水浴中（35 W，40 kHz）超声处理以促进去垢剂分散，但避免涡旋混合，以免产生气泡。使用前冷却至 4 °C。</li>
	<li>用于LPG纯化的CFTR纯化缓冲液为50 mM Tris、10% (v/v) 甘油、50 mM NaCl、1 mM DTT、0.1% (w/v) LPG-14以及蛋白酶抑制剂。配制350 ml该缓冲液，另配制150 ml相同缓冲液并添加1 M 咪唑。将两种缓冲液的pH均调至8.0。</li>
	<li>用于DDM中纯化的缓冲液包含50 mM Tris pH 8、20% (v/v) 甘油、1 M NaCl、1 mM DTT、0.1% (w/v) DDM。配制该缓冲液350 ml，另配制含1 M 咪唑的相同缓冲液150 ml。将两种缓冲液的pH均调节至8。</li>
	<li>用于含LPG的凝胶渗透色谱（GPC）缓冲液，配制50 mM Tris pH 8、10% (v/v) 甘油、50 mM NaCl、1 mM DTT、0.05% (w/v) LPG-14。使用DDM进行GPC时，配制缓冲液为50 mM Tris pH 8、20% (v/v) 甘油、1 M NaCl、1 mM DTT、0.1% (w/v) DDM。所有缓冲液和ddH₂O2O用于GPC柱时，应先经滤膜（0.2 μm）过滤并脱气后使用。</li>
	<li>SDS-PAGE上样缓冲液（2倍工作浓度）：50 mM Tris-HCl pH 7.6，5%（v/v）甘油，5 mM EDTA，0.02%（w/v）溴酚蓝。分装为700 μl每份，于-20 °C保存。使用前，每700 μl缓冲液中加入200 μl 20%（w/v）十二烷基硫酸钠（SDS）和100 μl 新鲜配制的0.5 M DTT。与样品在室温下孵育至少10分钟后再上样。切勿加热；加热会导致GFP变性，并可能引起CFTR聚集。</li>
	<li>为制备用于重组的脂质储备液，溶解按重量比4:1的混合物 E. coli 氯仿和甲醇（2:1 体积比）中的脂质和胆固醇，在玻璃小瓶中用氮气吹干2 在氮气下孵育2小时以形成脂质膜。加入不含NaCl的GPC缓冲液，使脂质浓度达到40 mg/ml，并通过反复涡旋和超声处理（35 W，40 kHz）使溶液澄清。</li>
	<li>ATP酶活性检测中，通过将SCH28080溶于DMSO配制成1 mM的溶液，NaSCN溶于ddH₂O配制成1 M的溶液，分别制备100倍浓缩储备液。2O 和寡霉素溶于 100% (v/v) 乙醇至终浓度为 2.5 mM，分装后于 -20 °C 保存。配制 100 ml ATP 酶缓冲液，含 50 mM Tris（pH 7.4）、150 mM NH4Cl，5 mM MgSO₄4 和 0.02% (w/v) NaN3可于室温保存，并用于多项检测。使用前立即配制5 mM ATP储备液，并置于冰上保存。（注意：使用Na2ATP以防止磷酸盐在检测中产生过强的背景信号）。配制SDS终止液（12%（w/v）SDS溶于ddH₂O中）。2O</li>
	<li>使用前立即配制Chifflet检测试剂缓冲液A（3% (w/v) 抗坏血酸，0.5% (w/v) 钼酸铵，0.5 M HCl）和缓冲液B（2% (w/v) 柠檬酸钠，2% (w/v) 亚砷酸钠，2% (v/v) 乙酸）。</li>
</ol>
2. 酵母微粒体的分离
<ol>
	<li>S. cerevisiae 表达鸡CFTR的细胞按O’Ryan所述方法培养 等 (2012)14将20 L发酵产物分装成两份，于-80 °C保存，可储存长达6个月。</li>
	<li>快速解冻一份细胞，在每克细胞中加入3 ml预冷的mPIB重悬。</li>
	<li>使用直径为425-600 μm的玻璃珠，在珠磨机中破碎细胞。使用五次&#160;细胞破碎过程采用1分钟破碎与1分钟间歇交替进行。（间歇至关重要，可确保破碎过程中细胞不会过热。）</li>
	<li>通过离心1 ml珠磨机裂解液样品来监测细胞破碎情况。在台式离心机中离心（12,000 × g，4 °C，5 min）。将上清液用mPIB在比色皿中稀释至1:50，测定A380. 如果 A380 &#62; 0.1，或尽管已进行多次重复的珠击破碎循环但OD值不再上升，则进入下一步。否则，重复步骤2.3–2.4。</li>
	<li>离心总细胞裂解液（12,000 x g，4 °C，20 分钟）。保留上清液。弃去沉淀（含有未破碎的细胞和线粒体）；但如果对细胞破碎效率存在任何疑问（参见 2.4），则也保留沉淀。</li>
	<li>将上一步的上清液离心（200,000 × g，4 °C，1.5 小时）。弃去上清液，用 CFTR 缓冲液重悬沉淀的微粒体膜。若微粒体用于后续以 DDM 进行纯化，则在 CFTR 缓冲液中添加 1 M NaCl。</li>
	<li>重复对重悬的膜组分进行离心（100,000 × g） g，4 °C，1 小时）并弃去上清液。</li>
	<li>将沉淀的微粒体用最小体积的CFTR缓冲液重新悬浮（终体积5–15 ml，微粒体总蛋白量70–200 mg）。可采用Bradford法测定微粒体蛋白的总浓度。25此外，应测量膜的荧光发射光谱（激发波长 = 485 nm，发射波长 = 500–600 nm），并应显示出明显的GFP荧光峰（最大值位于512 nm）。CFTR可在SDS-PAGE凝胶上通过GFP荧光条件扫描进行特异性检测（图1).</li>
	<li>将重悬的微粒体浸入液氮中速冻，于 -80 °C 保存，或继续进行步骤 3。</li>
</ol>
3. 微粒体的溶解
<ol>
	<li>若为冷冻状态，使用前需立即在10 °C水浴中解冻微粒体。</li>
	<li>为溶解膜成分，将微粒体与等体积的相应溶解缓冲液（步骤1.3）混合，使终浓度为2%（w/v）的去垢剂和5 mg/ml的微粒体蛋白浓度。在4 °C条件下振荡孵育（试管旋转仪）1小时。保留200 μl用于分析。</li>
	<li>将混合物离心（100,000 × g）, 4 °C，45 分钟）。移除含有溶解膜蛋白的上清液，经 0.45 μm 注射器滤器过滤后置于冰上保存。测定上清液的荧光值（同步骤 2.8）。</li>
	<li>将不溶性组分重悬于1% (w/v) SDS溶液中，体积与可溶性组分相等。测定该组分的荧光值，并保留50 μl等分试样用于SDS-PAGE分析。</li>
</ol>
4. CFTR的镍亲和纯化
<ol>
	<li>将两个 5 ml 镍-Sepharose 柱串联连接。先用 2 个柱体积（CV）的 20%（v/v）乙醇洗涤，随后用 2 CV 的 ddH2O 洗涤，然后用含 1 M 咪唑的溶解缓冲液（步骤 1.4–1.5）洗涤 2 CV。再用不含咪唑的溶解缓冲液重复洗涤 2 CV。</li>
	<li>向溶解后的样品（步骤 2.8）中加入咪唑，使其终浓度为 5 mM，然后手动将样品上样至层析柱，或在使用自动液相色谱仪时注入样品环中。</li>
	<li>以 0.5 ml/min 的流速将溶解后的样品上样至层析柱，并以相同流速用 2 CV 不含咪唑的缓冲液洗涤，以去除未结合的物质。用 50 ml Falcon 管收集洗脱组分。</li>
	<li>第一次洗涤时，使用含 40 mM 咪唑的纯化缓冲液 3 CV，流速为 1 ml/min。收集 2 ml 的组分。</li>
	<li>第二次洗涤时，使用含 100 mM 咪唑的纯化缓冲液 3 CV。收集 2 ml 的组分。</li>
	<li>用含 400 mM 咪唑的纯化缓冲液 3 CV 从 HisTrap 柱上洗脱 CFTR。收集 2 ml 的组分。</li>
	<li>检测洗脱组分中的荧光信号（步骤 2.8）。</li>
	<li>保留峰值组分的部分样品用于 SDS-PAGE 分析。其余峰值组分样品迅速冷冻后于 -80 °C 保存，或直接进入下一步纯化流程。</li>
</ol>
5. CFTR 的凝胶渗透色谱（GPC）纯化
<ol>
	<li>用 1.2 个柱体积的 ddH2O 平衡色谱柱（Superose 6 10/300 GL），随后用 1.2 个柱体积的 GPC 缓冲液进行平衡。</li>
	<li>在步骤 5.1 期间，在 4 °C 下使用 100,000 MWCO 的离心浓缩管，对 GFP 荧光最强的 Ni 亲和纯化组分进行浓缩。若在 DDM 中进行纯化，避免将样品浓缩至蛋白浓度超过 0.3 mg/ml，否则将导致显著的样品损失。从浓缩装置中取出截留液，并在 4 °C 下以 100,000 ×g 离心 30 分钟，以沉淀大颗粒物质。</li>
	<li>将此样品上样至色谱柱，并用 1.2 个柱体积的 GPC 缓冲液进行等度洗脱。收集 0.5 ml 的组分。</li>
	<li>按照第 2.8 节方法测定 GFP 荧光，以确定含有 CFTR 的组分。保留每管少量样品（例如 50 μl），用于 SDS-PAGE 分析。</li>
	<li>用液氮速冻各组分，并在 -80 °C 下保存。</li>
</ol>
6. CFTR 的重建
<ol>
	<li>将脂质（步骤 1.8）以 100:1（w/w）的脂质-蛋白比例加入纯化的 CFTR 中，在 4 °C 下孵育 1 小时。同样设置仅含脂质的对照组，用相同体积的 GPC 缓冲液替代纯化蛋白。</li>
	<li>使用疏水性吸附珠从蛋白/脂质混合物中去除去垢剂。用 5 CV 的 ddH2O、5 CV 的 70%（v/v）乙醇、5 CV 的 ddH2O 以及 5 CV 不含去垢剂的 GPC 缓冲液依次洗涤吸附珠。每毫升纯化蛋白中加入 200 mg 洗涤后的吸附珠，于 4 °C 轻柔振荡过夜孵育。</li>
	<li>用细头移液器吸头将重构成分从吸附珠中转移至新的离心管中。</li>
</ol>
7. ATP酶活性的测定
<ol>
	<li>使用改良的Chifflet法26,27，在96孔板中测定CFTR特异性ATP酶活性。用磷酸钠储备液（0.65 mM）配制0–20 nmol磷酸标准品，终体积为50 µl。使用CFTR缓冲液与ATP酶缓冲液1:1混合液稀释磷酸盐储备液。</li>
	<li>将重组CFTR和空白脂质体分别与1:100（v/v）ATP酶抑制剂（步骤1.9）在冰上孵育10分钟。每组至少使用5 μg重组CFTR。</li>
	<li>加入ATP（步骤1.9），使其终浓度为2 mM，在25 °C孵育1小时。通过向各孔（包括标准品孔）加入40 μl 10%（w/v）SDS（步骤1.9）终止反应。</li>
	<li>每孔加入100 μl缓冲液A（步骤1.10），孵育10分钟。再向每孔加入100 μl缓冲液B（步骤1.10），在适用于96孔板的紫外/可见光分光光度计中于800 nm波长处测定吸光度。</li>
	<li>利用磷酸盐标准品将800 nm处的吸光度转换为释放的磷酸量。通过减去背景信号（仅含脂质体的孔）计算ATP水解速率。</li>
	<li>对于未重组的CFTR，使用CFTR缓冲液进行背景读数，并遵循相同实验流程。</li>
</ol>

<ol><li>Aleksandrov, A. A., Aleksandrov, L. A., Riordan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR+%28ABCC7%29+is+a+hydrolyzable-ligand-gated+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">CFTR (ABCC7) is a hydrolyzable-ligand-gated channel.</a> Pflugers Arch. 453, 693-702 (2007).</li>
<li>Dodge, J. A., Lewis, P. A., Stanton, M., Wilsher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+fibrosis+mortality+and+survival+in+the+UK%3A+1947-2003%5BTitle%5D)+AND+%22EUR+RESPIR+J%22%5BJournal%5D)">Cystic fibrosis mortality and survival in the UK: 1947-2003.</a> EUR RESPIR J. 29, 522-526 (2007).</li>
<li>O'Sullivan, B. P., Freedman, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Cystic fibrosis.</a> Lancet. 373, 1891-1904 (2009).</li>
<li>Rommens, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+cystic+fibrosis+gene%3A+chromosome+walking+and+jumping%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping.</a> Science. 245, 1059-1065 (1989).</li>
<li>Kariya, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+CFTR+in+the+elevation+of+glutathione+levels+in+the+lung+by+oral+glutathione+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">A role for CFTR in the elevation of glutathione levels in the lung by oral glutathione administration.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 292, (2007).</li>
<li>Gould, N. S., Min, E., Martin, R. J., Day, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR+is+the+primary+known+apical+glutathione+transporter+involved+in+cigarette+smoke-induced+adaptive+responses+in+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">CFTR is the primary known apical glutathione transporter involved in cigarette smoke-induced adaptive responses in the lung.</a> Free Radic Biol Med. 52, 1201-1206 (2012).</li>
<li>Childers, M., Eckel, G., Himmel, A., Caldwell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+model+of+cystic+fibrosis+pathology%3A+lack+of+transport+of+glutathione+and+its+thiocyanate+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Hypotheses%22%5BJournal%5D)">A new model of cystic fibrosis pathology: lack of transport of glutathione and its thiocyanate conjugates.</a> Med Hypotheses. 68, 101-112 (2007).</li>
<li>Cole, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+a+transporter+gene+in+a+multidrug-resistant+human+lung+cancer+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Overexpression of a transporter gene in a multidrug-resistant human lung cancer cell line.</a> Science. 258, 1650-1654 (1992).</li>
<li>Conseil, G., Deeley, R. G., Cole, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymorphisms+of+MRP1+%28ABCC1%29+and+related+ATP-dependent+drug+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacogenet+Genomics%22%5BJournal%5D)">Polymorphisms of MRP1 (ABCC1) and related ATP-dependent drug transporters.</a> Pharmacogenet Genomics. 15, 523-533 (2005).</li>
<li>Ketchum, C. J., Rajendrakumar, G. V., Maloney, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+adenosinetriphosphatase+and+transport+activities+of+purified+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of the adenosinetriphosphatase and transport activities of purified cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Biochemistry. 43, 1045-1053 (2004).</li>
<li>Ramjeesingh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+procedure+for+the+efficient+purification+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+%28CFTR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">A novel procedure for the efficient purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR).</a> Biochem J. 327 (Pt 1), 17-21 (1997).</li>
<li>Huang, P., Liu, Q., Scarborough, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysophosphatidylglycerol%3A+a+novel+effective+detergent+for+solubilizing+and+purifying+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Lysophosphatidylglycerol: a novel effective detergent for solubilizing and purifying the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Anal Biochem. 259, 89-97 (1998).</li>
<li>Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+crystallization+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+%28CFTR%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR).</a> J Biol Chem. 279, 39051-39057 (2004).</li>
<li>O'Ryan, L., Rimington, T., Cant, N., Ford, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+protein+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Vis Exp. , (2012).</li>
<li>Oldham, M. L., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snapshots+of+the+maltose+transporter+during+ATP+hydrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Snapshots of the maltose transporter during ATP hydrolysis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108, 15152-15156 (2011).</li>
<li>Pinkett, H. W., Lee, A. T., Lum, P., Locher, K. P., Rees, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inward-facing+conformation+of+a+putative+metal-chelate-type+ABC+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An inward-facing conformation of a putative metal-chelate-type ABC transporter.</a> Science. 315, 373-377 (2007).</li>
<li>Dawson, R. J. P., Locher, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+bacterial+multidrug+ABC+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of a bacterial multidrug ABC transporter.</a> Nature. 443, 180-185 (2006).</li>
<li>Gerber, S., Comellas-Bigler, M., Goetz, B. A., Locher, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+trans-inhibition+in+a+molybdate%2Ftungstate+ABC+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural basis of trans-inhibition in a molybdate/tungstate ABC transporter.</a> Science. 321, 246-250 (2008).</li>
<li>Ward, A., Reyes, C. L., Yu, J., Roth, C. B., Chang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flexibility+in+the+ABC+transporter+MsbA%3A+Alternating+access+with+a+twist%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Flexibility in the ABC transporter MsbA: Alternating access with a twist.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 19005-19010 (2007).</li>
<li>Kadaba, N. S., Kaiser, J. T., Johnson, E., Lee, A., Rees, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+high-affinity+E.+coli+methionine+ABC+transporter%3A+structure+and+allosteric+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The high-affinity E. coli methionine ABC transporter: structure and allosteric regulation.</a> Science. 321, 250-253 (2008).</li>
<li>Aller, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+P-Glycoprotein+Reveals+a+Molecular+Basis+for+Poly-Specific+Drug+Binding%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure of P-Glycoprotein Reveals a Molecular Basis for Poly-Specific Drug Binding.</a> Science. 323, 1718-1722 (2009).</li>
<li>Koehler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysophospholipid+micelles+sustain+the+stability+and+catalytic+activity+of+diacylglycerol+kinase+in+the+absence+of+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Lysophospholipid micelles sustain the stability and catalytic activity of diacylglycerol kinase in the absence of lipids.</a> Biochemistry. 49, 7089-7099 (2010).</li>
<li>Tian, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation%2C+functional+characterization%2C+and+NMR+studies+of+human+KCNE1%2C+a+voltage-gated+potassium+channel+accessory+subunit+associated+with+deafness+and+long+QT+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Preparation, functional characterization, and NMR studies of human KCNE1, a voltage-gated potassium channel accessory subunit associated with deafness and long QT syndrome.</a> Biochemistry. 46, 11459-11472 (2007).</li>
<li>Huang, P., Liu, Q., Scarborough, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysophosphatidylglycerol%3A+a+novel+effective+detergent+for+solubilizing+and+purifying+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Lysophosphatidylglycerol: a novel effective detergent for solubilizing and purifying the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Anal Biochem. 259, 89-97 (1998).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Chifflet, S., Torriglia, A., Chiesa, R., Tolosa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+determination+of+inorganic+phosphate+in+the+presence+of+labile+organic+phosphate+and+high+concentrations+of+protein%3A+Application+to+lens+ATPases%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A method for the determination of inorganic phosphate in the presence of labile organic phosphate and high concentrations of protein: Application to lens ATPases.</a> Analytical Biochemistry. 168, 1-4 (1988).</li>
<li>Rothnie, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+cholesterol+in+maintenance+of+P-glycoprotein+activity+and+its+membrane+perturbing+influence%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Biophys+J%22%5BJournal%5D)">The importance of cholesterol in maintenance of P-glycoprotein activity and its membrane perturbing influence.</a> Eur Biophys J. 30, 430-442 (2001).</li>
</ol>

作者对本研究不存在竞争性财务利益或其他冲突性利益。

我们此前已描述了一种小鼠CFTR过表达的方法14。自该方案发表以来，我们利用相同的系统表达并纯化了多种不同的CFTR直系同源物。迄今为止测试的所有直系同源物在LPG去垢剂中均能良好纯化，而DDM纯化在不同直系同源物之间的效果则表现出较大差异（数据未显示）。这种灵活性体现了酵母表达系统的优势：可以相对快速地筛选大量构建体，从而选择出适用于特定目的的构建体。
在用 DDM 溶解之前，先用含有 1 M NaCl 的缓冲液洗涤酵母微粒体，可获得更纯净的微粒体制备物，并减少后续步骤中的杂质。此步骤在 LPG 方案中并非必需，因为最终的 CFTR 样品在不进行微粒体洗涤的情况下纯度已超过&#62;90%。此外，在 DDM 中进行纯化时，需对溶解和纯化所用的缓冲液进行若干调整，主要是添加额外的甘油和盐。这些调整共同显著增强了 DDM 溶解蛋白与层析柱的结合能力。
DDM 纯化方法仍有改进空间，特别是需要去除一种 40 kDa 的主要污染物。根据质谱分析，该污染物来源于酵母核糖体亚基 L3，该蛋白似乎对镍树脂具有内在亲和力。L3 蛋白中并无明显的多聚组氨酸序列，但当其结合于核糖体时的三维结构（PDB = 1FFK）显示，折叠后的 L3 亚基可能形成一个多聚组氨酸簇。在 LPG 纯化产物中该条带问题较小，可能归因于 LPG 去垢剂更为剧烈的性质。
尽管在DDM中的纯化效果似乎不如LPG，但像DDM这样的温和去垢剂可能更适用于功能和结构分析，并且已被用于多项膜蛋白的X射线晶体学研究15-21。此外，我们的结果表明，与在DDM中纯化相比，使用LPG会导致CFTR的ATP酶功能丧失。因此，我们建议在需要高纯度CFTR的应用中选择基于LPG的纯化方案，例如翻译后修饰的表征或抗体的制备；而在需要保持蛋白质活性和完整天然构象的应用中，则推荐采用基于DDM的纯化方案作为更优选择。
综上所述，本实验方案描述了一种可重复的CFTR蛋白纯化方法，该方法使用两性离子去污剂LPG-14或非离子型去污剂DDM进行CFTR的分离。因此，本方法所涵盖的CFTR纯化条件范围较以往报道的方法更为广泛10-13。此外，当本方法与高产量酵母培养系统（如20 L发酵罐）以及高通量细胞收获系统（如6 L低速离心转子）联用时，可获得毫克级的纯化CFTR蛋白。所获得的CFTR蛋白带有可切割的GFP标签，便于在各种生物化学与生物物理检测中对蛋白进行便捷监测。
本文所述试剂（含鸡CFTR的质粒或冷冻酵母细胞）可通过美国囊性纤维化基金会获取。

囊性纤维化（CF）是欧洲和北美最常见的遗传性疾病，发病率约为每2,500例活产婴儿中有1例。当囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）蛋白发生突变，导致其在上皮细胞质膜上的功能丧失时，便会引发CF1。该缺陷最严重的后果是不可逆的肺损伤，使患者预期寿命缩短至&#60;40岁2,3。
CFTR 是一种 ATP 结合盒（ABC）转运蛋白，但在进化过程中已转变为一种离子通道1,4。尽管其在细胞质膜中的功能已发生显著改变，CFTR 仍与其他 ABC 转运蛋白保持较高的序列同源性。有趣的是，CFTR 的特化区域（即其调控区以及 N-末端和 C-末端）与其他后生动物的 ABC 转运蛋白之间并无明显的序列相似性，因此目前尚无线索可解释这些序列在 CFTR 中的起源。&#160; 根据其一级结构，CFTR 被归类为 ABC 转运蛋白家族中的 C 亚家族成员，但目前尚无有力证据表明其与该亚家族之间存在残留的功能关联。已有部分文献报道 CFTR 具有谷胱甘肽转运活性5-7，这与其它 C 亚家族成员的功能相符8,9；然而，也有研究指出还原型谷胱甘肽可能抑制 CFTR 的 ATP 酶活性，而非表现出 ABC 转运蛋白典型的底物诱导激活效应10。离子电导的测量具有足够高的灵敏度，可用于研究单个 CFTR 分子的通道活性1，CFTR 通道的特性已被作为时间、温度、ATP 浓度、膜电位和磷酸化状态的函数进行监测，同时也可在多种小分子抑制剂、增效剂和调节剂存在的情况下进行观察。这些研究极大地增进了我们对 ABC 转运蛋白功能机制的理解。然而，CFTR 的大量表达及其后续纯化一直极具挑战性，目前仅有少数实验室取得成功10-13。
开发更有效药物的需求十分紧迫，但这一过程因缺乏用于小分子筛选的纯化CFTR蛋白而受到阻碍。解决CFTR蛋白的表达与纯化问题，将能够实现高通量药物筛选，以纠正囊性纤维化（CF）中的主要缺陷，同时也将为高分辨率结构研究开辟途径，从而指导合理药物设计。此外，该蛋白一些相对基础的生化特性，例如其功能性寡聚状态、相互作用蛋白以及ATP酶活性，至今仍缺乏充分表征。我们此前已报道过在S. cerevisiae14中大规模表达带有GFP和His标签的小鼠CFTR的实验方案，现进一步描述CFTR的纯化方法。我们已利用这些方法纯化了五种CFTR的直系同源物，并以鸡CFTR的纯化为例展示相关数据。在膜蛋白纯化过程中，选择用于溶解和纯化的去垢剂是关键步骤。在筛选了多种去垢剂中CFTR的溶解性后，我们选定了两种性质不同的去垢剂用于纯化。十二烷基-β-D-麦芽糖苷（DDM）是一种非离子型去垢剂，已被广泛用于膜蛋白的结构与功能研究15-21。离子型去垢剂1-十四酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)（LPG-14）对CFTR具有高效的溶解除能力，并已在此前用于功能性膜蛋白的纯化10,22,23，包括从S. cerevisiae24中纯化CFTR。

<table><tbody><tr><td>0.2 &amp;mu;m 注射器滤器&amp;nbsp;</td><td>Sartorius</td><td>FC121</td><td></td></tr><tr><td>100 kDa 截留分子量离心浓缩管（PES 膜）</td><td>Vivaspin</td><td>VS0641</td><td></td></tr><tr><td>2 ml 微量离心管</td><td>Sarstedt</td><td>72.695</td><td></td></tr><tr><td>40Ti 转子</td><td>Beckman Coulter</td><td>&lt;a href=&quot;https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=337901">337901&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 无菌 Falcon 管</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>三磷酸腺苷二钠盐（Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;ATP）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A26209</td><td></td></tr><tr><td>液相色谱系统</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4062-64</td><td></td></tr><tr><td>氨基乙基苯磺酰氟（AEBSF）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8456</td><td></td></tr><tr><td>玻璃珠振荡细胞破碎仪</td><td>BioSpec</td><td>1107900</td><td></td></tr><tr><td>台式离心机&amp;nbsp;</td><td>HERMLE</td><td>Z300</td><td></td></tr><tr><td>台式离心机&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>台式微量离心机&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>13-100-511</td><td></td></tr><tr><td>盐酸苄脒</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>434760</td><td></td></tr><tr><td>疏水性 SM-2 吸附珠</td><td>BioRad</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>溴酚蓝</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114391</td><td></td></tr><tr><td>离心管</td><td>Beckman Coulter</td><td>357000</td><td></td></tr><tr><td>凝胶成像系统</td><td>BioRad</td><td>170-808</td><td></td></tr><tr><td>胆固醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>抑肽酶&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7268</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（DTT）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; 总脂质提取物</td><td>Avanti lipids</td><td>100500</td><td></td></tr><tr><td>环氧琥珀酰-亮氨酰胺基丁烷（E-64）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3132</td><td></td></tr><tr><td>酸洗玻璃珠</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Fisher</td><td>65017</td><td></td></tr><tr><td>HisTrap HP 柱（5 ml）</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5247-05</td><td></td></tr><tr><td>快速考马斯亮蓝染色液</td><td>Novexin</td><td>ISB1L</td><td></td></tr><tr><td>离心机 JA-17 转子</td><td>Beckman Coulter</td><td>369691</td><td></td></tr><tr><td>亮抑蛋白酶肽</td><td>Merck</td><td>108975</td><td></td></tr><tr><td>溶血磷脂酰甘油-14（LPG）</td><td>Avanti lipids</td><td>858120</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>凝胶电泳槽 SDS-PAGE 系统</td><td>BioRad</td><td>165-8006</td><td></td></tr><tr><td>n-十二烷基-&amp;beta;-D-麦芽糖吡喃苷（DDM）</td><td>Affymetrix</td><td>D310S</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6191</td><td></td></tr><tr><td>NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>寡霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75351</td><td></td></tr><tr><td>超速离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>392050</td><td></td></tr><tr><td>预染蛋白质标准品</td><td>Fermentas</td><td>SM1811</td><td></td></tr><tr><td>脱盐柱（Sephadex G-25）</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>胃蛋白酶抑制剂 A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4265</td><td></td></tr><tr><td>苯甲基磺酰氟（PMSF）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>SCH28080</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4443</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠（SDS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L37771</td><td></td></tr><tr><td>硫氰酸钠（NaSCN）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>251410</td><td></td></tr><tr><td>凝胶过滤 10/300 GL 柱</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5172-01</td><td></td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Formedium</td><td>TRIS01</td><td></td></tr><tr><td>超速离心管</td><td>Beckman Coulter</td><td>355618</td><td></td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td>Star Labs</td><td>N2400-0001</td><td></td></tr><tr><td>超声波水浴仪</td><td>Ultrawave</td><td>F0002202</td><td></td></tr><tr><td>多功能酶标仪</td><td>BioTek</td><td>BTH1MF</td><td></td></tr></tbody></table>

囊性纤维化跨膜电导调节蛋白在saccharomyces cerevisiae中表达后的纯化

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）蛋白的功能缺陷会导致囊性纤维化（CF），这是一种常染色体隐性遗传病，目前使患者的平均预期寿命低于&#60;40岁。开发新型药物分子以恢复CFTR的活性是治疗囊性纤维化的重要目标，而分离出具有功能活性的CFTR蛋白是实现这一目标的重要步骤。
我们描述了两种从真核异源表达系统酿酒酵母（S. cerevisiae）中纯化CFTR蛋白的方法。与原核表达系统类似，酿酒酵母（S. cerevisiae）可在实验室中快速生长且成本低廉，同时还能对大型膜蛋白进行转运及翻译后修饰。在任何膜蛋白的纯化过程中，选择用于溶解和纯化的去垢剂是关键步骤。在筛选了CFTR在多种去垢剂中的溶解性后，我们选择了两种性质不同的去垢剂用于纯化，从而使最终获得的CFTR样品可根据后续计划进行的实验进行优化调整。
本方法中，我们比较了在十二烷基-β-D-麦芽糖苷（DDM）和1-十四酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)（LPG-14）中纯化CFTR蛋白的效果。通过本方法在DDM中纯化的蛋白在功能检测中表现出ATP酶活性。而在LPG-14中纯化的蛋白则具有高纯度和高得率，可用于翻译后修饰的研究，并适用于小角X射线散射和电子显微镜等结构生物学方法，但其ATP酶活性显著降低。

上述方案是一种高效分离富含CFTR微粒体的方法，在细胞破碎及粗制微粒体制备过程中，CFTR的回收率几乎达到完全（图1）。其他细胞破碎方法也可有效采用。我们曾使用法国压力细胞（French pressure cell），以及其他高压/空化装置（也可结合红宝石靶撞击）进行操作，均获得同等效率。出于操作便捷性和设备初始成本较低的考虑，我们认为珠击法（bead-beating method）为最佳选择。
使用LPG溶解并纯化CFTR获得了 80 μg 蛋白/L 培养液在 &gt;90% 纯度（图2）。高产量归因于LPG对CFTR的有效增溶（比较 图2b，第2道和第4道）。此外，CFTR与柱材料的高效且紧密结合导致未结合组分中CFTR的损失极小，并且在洗涤组分中未检测到CFTR图2，第3、5和6泳道）。洗脱蛋白的纯度为 &gt;90%，通过考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE凝胶结合CFTR条带及杂质条带的密度测定法估算。凝胶过滤色谱（GPC）将LPG纯化的CFTR与低分子量杂质分离图4，下图）
使用DDM纯化CFTR的方案可获得约60%的纯度和每升约50 μg的产量（图3）。对凝胶过滤层析（GPC）在约10 ml处洗脱的组分进行负染电镜（EM）分析（图4）显示，DDM纯化的CFTR包含直径为20–30 nm的聚集体以及直径约10 nm的较小颗粒（数据未显示）。这些小聚集体可能具有可逆的结合与解离特性，因为使用截留分子量为1 MDa的超滤膜无法去除电镜下可见的聚集体。LPG纯化的样品无法吸附至辉光放电处理的载网，因此采用未染色组分进行冷冻电镜（cryo-EM）分析。结果显示，样品颗粒大小相对较小（直径6–8 nm），且具有高度均一性（数据未显示）。
最后，检测了纯化蛋白的ATP酶活性（图5）。作为ABC蛋白家族的一员，CFTR具有两个核苷酸结合结构域（NBDs），能够结合和/或水解ATP。实验数据显示，以LPG增溶状态纯化的蛋白无法水解ATP，而在DDM存在时仅表现出较弱的ATP酶活性（图5，空心柱）。在添加脂质并去除去垢剂后，经DDM纯化的样品其ATP酶活性提高了4倍（13 nmol ATP/min/mg蛋白）。对使用LPG分离的CFTR，在添加脂质并去除LPG后，其活性也得到恢复，但最终活性低于经DDM纯化并重组的样品（1.5 nmol ATP/min/mg蛋白）。
<img alt="显示不同离心速度下蛋白质分离的电泳凝胶；箭头指示条带。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51447/51447fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51447/51447fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. 在微粒体分离和洗涤过程中不同离心步骤的细胞裂解液（CL）、上清液（S）和沉淀（P）中鸡CFTR蛋白水平的监测。 通过GFP标签的凝胶内荧光显影SDS-PAGE凝胶。细胞破碎后在14,000 × g离心的上清液几乎含有全部CFTR（包括降解产物）。在200,000 × g超速离心后，全长CFTR全部沉淀，部分片段仍留在上清液中。盐洗涤微粒体在100,000 × g超速离心后，几乎所有CFTR均进入沉淀，同时进一步去除了部分片段。
<img alt="显示蛋白质条带的SDS-PAGE凝胶电泳结果；左侧为分子量标记物。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51447/51447fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51447/51447fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2. 通过固定化金属离子亲和层析法在LPG中纯化鸡CFTR蛋白。 各组分通过SDS-PAGE分析，随后进行考马斯亮蓝染色（上图）和GFP标签的荧光检测（下图）。泳道：(1) 微粒体。(2) LPG溶解的微粒体。(3) 未结合物质。(4) 不溶性物质。(5) 和 (6) 分别为40 mM和100 mM咪唑洗涤组分。(7) 用400 mM咪唑洗脱的组分。
<img alt="显示蛋白质分离结果的SDS-PAGE电泳凝胶，包含洗脱和洗涤泳道。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51447/51447fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51447/51447fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 通过固定化金属离子亲和层析法在DDM中纯化鸡CFTR。 各组分经SDS-PAGE分析后进行考马斯亮蓝染色。左侧图显示洗脱前的各组分；右侧图显示连续的洗脱组分，箭头所指为CFTR。后续组分中富含一种40 kDa的污染物，质谱鉴定该污染物为核糖体蛋白L3。
<img alt="尺寸排阻色谱和凝胶电泳结果；蛋白质紫外吸收峰。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51447/51447fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51447/51447fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. 通过凝胶过滤色谱纯化鸡CFTR蛋白。 经镍亲和色谱纯化的CFTR蛋白被浓缩后上样至GPC柱。上图显示了在含有LPG-14（实线）或DDM（虚线）的缓冲液中纯化的CFTR的洗脱曲线叠加图。SDS-PAGE分析（下图）显示，CFTR的洗脱体积介于8至11 ml之间。
<img alt="ATP酶活性柱状图；比较DDM、DDM+脂质、LPG、LPG+脂质；酶活性分析。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51447/51447fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51447/51447fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图5"> 
图5. 纯化的鸡CFTR组分的ATP酶活性。 在ATP酶抑制剂混合物存在下，采用改良的Chifflet法26检测在DDM或LPG中纯化的蛋白（空心柱），以消除F型、P型和V型ATP酶的背景活性。在去除去垢剂并添加脂质后也测定了ATP水解速率（实心柱）。图中显示了均值和标准差（n=3）。有脂质与无脂质条件下ATP酶活性的均值差异，以及DDM与LPG中的活性差异均具有统计学意义（p&lt;0.05）。

囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）的异源表达与纯化是囊性纤维化药物研发中的重大挑战和限制因素。本方案描述了两种可用于功能与结构研究的、适用于毫克级产量的CFTR分离方法。&#160;

囊性纤维化跨膜电导调节蛋白在Saccharomyces cerevisiae中表达后的纯化

囊性纤维化跨膜电导调节因子（CFTR）蛋白的缺陷会导致囊性纤维化（CF），这是一种常染色体隐性遗传病，其特征是……

本实验的总体目标是分离出大量具有功能活性的囊性纤维化跨膜传导调节因子（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，简称 CFTR 蛋白）。首先，通过在 Charmy visi 中异源过表达鸡源 CFTR 蛋白来实现这一目标；第二步是裂解酵母细胞并分离积累的微粒体组分。接下来对CFTR进行增溶和纯化。最后一步是测定纯化后的蛋白质催化ATP水解的速率，以评估其是否仍具有功能活性。最终，通过在S. visi中过表达，可大量制备出高纯度、具有功能活性的CFTR，产量可达毫克级别。与现有方法（如在哺乳动物细胞系中表达）相比，该技术的主要优势在于酵母在实验室中易于培养、生长迅速且成本低廉。该方法可用于解答囊性纤维化领域中的关键问题，因为纯化的蛋白质可用于研究正在开发的药物与CFTR蛋白之间的相互作用，甚至可用于寻找新药物。该方法可为CFTR的纯化提供深入见解，也可应用于其他难以表达和纯化的膜蛋白。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为CFTR在酵母中会被蛋白水解酶迅速降解，且在溶液中容易发生聚集。在本方案中，将从先前冷冻保存的S SEI细胞中纯化鸡CFTR。培养和收获表达CFTR的S SEI细胞的操作步骤已在之前发表的JoVE文章中展示。按照随附的手稿所述方法从酵母细胞中分离微粒体，然后将其重悬于5至15毫升的CFTR缓冲液中，体积尽量小。可采用Bradford法测定微粒体蛋白的总含量，蛋白总量应在70至200毫克之间，且膜的荧光发射光谱应显示出明显的GFP荧光峰。在CFTR-DDMA的溶解与纯化过程中将使用两种性质不同的去垢剂：非离子型去垢剂LPG-14和离子型去垢剂。按照手稿中的方案预先配制适当的缓冲液以溶解膜。用等体积的相应溶解缓冲液稀释微粒体，使最终去垢剂浓度为2%，微粒体蛋白浓度为5毫克/毫升。将此混合物在4摄氏度下振荡孵育1小时。孵育一小时后，将混合物在 100,000 × g、4 °C 条件下离心 45 分钟。弃去沉淀，收集并保存含有可溶性膜蛋白的上清液。将不溶性组分重悬于1% SDS溶液中，体积与可溶性组分相等。测定该组分的荧光，并保留50微升等分试样（Eloqua）用于SDS-PAGE分析。开始进行CFTR的镍亲和纯化时，将五个串联的5毫升镍-Sepharose柱连接，先用两倍柱体积（CV）的20%乙醇洗涤，随后用两倍柱体积的去离子蒸馏水洗涤。接着用含1 mol/L MiaSole的溶解缓冲液洗涤两倍柱体积，再用不含MiaSole的溶解缓冲液洗涤两倍柱体积。向溶解后的材料中加入MiaSole，使其终浓度为5毫摩尔，并在用不含ole的缓冲液洗涤两次后，将材料加载至自动液相色谱装置的样品环中。用含有40毫摩尔ole的纯化缓冲液以每分钟1毫升的流速洗涤柱子3个柱体积，以去除未结合的物质。将此组分收集至50毫升离心管中。第二次洗涤时，使用含100毫摩尔油酸（ole）的纯化缓冲液，体积为三倍柱体积（CV）。在96孔板中收集每管2毫升的洗脱组分。用含400毫摩尔油酸（ole）的纯化缓冲液三倍柱体积（CV）从Hiss Trap柱上洗脱CFTR蛋白，在96孔板中收集每管2毫升的洗脱组分，监测洗脱组分中的荧光信号，并保留峰值组分的等分试样。对于SDS-PAGE分析，将使用剩余的峰馏分样品进行下一步纯化。首先用1.2柱体积的蒸馏去离子水平衡层析柱，随后在柱子平衡过程中使用1.2柱体积的凝胶过滤层析（GPC）缓冲液。在4°C条件下，使用截留分子量为100,000道尔顿的离心浓缩管，对具有最强GFP荧光的镍亲和纯化馏分进行浓缩。若在DDM中进行纯化，避免将样品浓缩至蛋白质浓度超过0.3毫克/毫升，否则将导致显著的样品损失。将RENATE从浓缩装置转移至离心管中，在4摄氏度下以100,000 × g离心30分钟，以沉淀大颗粒物质。将此样品上样至平衡好的层析柱，并用1.2个柱体积的GPC缓冲液进行等度洗脱。收集0.5毫升的组分。检测GFP荧光以鉴定含有CFTR的组分。保留每管少量样品，用于SDS-PAGE分析以确认CFTR的重构。向纯化的CFTR中加入脂质，脂质与蛋白质的比例为100:1。同样地，设置仅含脂质的对照组。用相同体积的GPC缓冲液替代纯化后的蛋白质。将两个样品在4°C下孵育一小时。接下来，使用疏水性吸附珠从蛋白质-脂质混合物中去除去垢剂。每毫升纯化蛋白使用200毫克预清洗的吸附珠，在4摄氏度下轻轻振荡孵育过夜。次日，用细头移液器吸头将重悬样品从吸附珠中收集至新离心管中。采用改良的Chile法在96孔板中测定重构成CFTR的特异性APAs活性，标准品使用0至20纳摩尔的磷酸钠，溶于CFTR缓冲液与APAs缓冲液1:1混合液中。将重构成的CFTR与空白脂质体分别与1至100的APAs抑制剂在冰上孵育10分钟。使用至少五微克复溶的CFTR。将样品转移至96孔板中，并加入TP至终浓度为2毫摩尔，在25摄氏度孵育一小时。一小时后，通过向每孔加入40微升10% SDS终止反应。接下来，向每个孔中加入 100 µL 缓冲液 A，孵育 10 分钟。然后向每个孔中加入 100 µL 缓冲液 B，并使用兼容 96 孔板的紫外-可见分光光度计在 800 纳米波长下测定吸光度。将吸光度数据转置到新表格中。利用磷酸盐标准品将800纳米处的吸光度转换为释放的磷酸量，并按照所示步骤计算TP水解速率。本视频展示的方案是一种高效分离富含CFTR微粒体的方法，在细胞破碎及粗微粒体制备过程中几乎完全回收CFTR。该SDS-PAGE凝胶图像显示了在微粒体分离和洗涤过程中不同离心步骤下通过GFP标签的Ingel荧光监测的鸡CFTR水平。CL 表示细胞裂解液，S 表示上清液，P 表示沉淀物。细胞破碎后在 14,000 × g 条件下离心所得的上清液。G 部分几乎包含所有的 CFTR 蛋白，包括其降解产物；在 200,000 × g 条件下进行超速离心后，G 沉淀中含有全部全长 CFTR 蛋白，而部分片段仍留在上清液中；对经盐洗涤的微粒体沉淀物在 100,000 × g 条件下进行超速离心。通过固定化金属离子亲和层析法纯化LPG 14中的鸡CFTR，每升培养液可获得80微克纯度超过90%的蛋白。上图显示通过SDS-PAGE分析并经考马斯亮蓝染色的各组分。下图显示通过GFP标签的荧光检测到的相同组分。高产率归因于LPG 14对CFTR的有效增溶作用，这一点通过第二泳道（上样了经LPG增溶的微粒体）与第四泳道（上样了不溶性物质）的比较得以证实。此外，CFTR与层析柱的高效且紧密的结合，使得未结合组分中CFTR的损失极小（如第三泳道所示），并且在洗涤组分（第五和第六泳道）中未检测到CFTR。洗脱蛋白的纯度经考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE凝胶及对CFTR条带与杂质条带的光密度分析估计超过90%。鸡CFTR蛋白的纯化。通过固定化金属离子亲和层析法在DDM中纯化，每升培养物获得约50微克蛋白，纯度约为60%。该图显示了通过SDS-PAGE分离后经考马斯亮蓝染色分析的各组分，左侧为洗脱前的各组分，右侧为连续的几个洗脱组分。稍后由箭头指示CFTR。各组分中含有丰富的40千道尔顿污染物，质谱鉴定该污染物为核糖体蛋白L3。通过固定化金属离子亲和层析纯化的鸡CFTR，无论其在LPG-14或DDM中进行，均进一步通过凝胶过滤层析进行了纯化。含有LPG 14的缓冲液中纯化的CFTR的elucian谱图以实线表示。而含有DDM的缓冲液中纯化的CFTR的Ian谱图则以虚线表示，SDS凝胶电泳结果显示，箭头所示的LPG纯化的CFTR洗脱峰位于8至11毫升之间。此外，凝胶过滤层析将LPG纯化的CFTR与低分子量杂质分离。最后，测定了纯化蛋白的APAs活性。结果表明，纯化的蛋白质在LPG增溶状态下无法水解ATP，在添加脂质并去除去污剂DDM后仅表现出较弱的APAs活性。经DDM纯化的样品其APAs活性高出四倍，达到每分钟每毫克蛋白质13 nmol ATP。添加脂质并去除LPG同样恢复了使用LPG分离的CFTR的活性，但最终活性低于经DDM纯化并重建的材料，为每分钟每毫克蛋白质1.5 nmol ATP。一旦掌握该方法，即可实现稳定重复。如果操作得当，该技术可在两天内完成。在进行此操作时，必须始终牢记在操作完成后将样品置于冰上。其他方法，如热稳定性分析、电子显微镜和小角X射线散射，可用于进一步探究蛋白质结构与稳定性的相关问题。观看本视频后，您应能充分了解如何表达并纯化大量 CFTR 蛋白。

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囊性纤维化跨膜电导调节蛋白表达纯化<em&gt;酿酒酵母</em

囊性纤维化跨膜电导调节蛋白在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中的表达与纯化

囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）是一种上皮氯离子通道，已被报道可与多种蛋白质相互作用并调控重要的细胞过程；其中，CFTR通过其PDZ基序介导的相互作用已有充分研究。本实验方案描述了我们建立的用于组装PDZ依赖性CFTR大分子信号复合物的方法 体外.

体外 PDZ依赖性CFTR大分子信号复合物的分析

本文介绍了一种快速且有效的功能重建方法，可用于重建纯化的野生型和突变型CFTR蛋白，该方法能够保持这种氯离子通道的活性，而CFTR在囊性纤维化中存在功能缺陷。通过CFTR介导的重建蛋白脂质体中的碘离子外流，可研究通道活性以及小分子化合物的作用。...

纯化野生型和突变型CFTR蛋白的功能性重构及通道活性测定

蛋白质相互作用是细胞功能的核心。通常使用量热法和光谱技术来表征这些相互作用。本文中，我们描述了荧光各向异性作为一种研究Shwachman-Diamond综合征相关突变蛋白（SBDS）与延伸因子样1...

荧光各向异性作为研究蛋白质-蛋白质相互作用的工具

糖基化蛋白的生化与结构分析需要相对大量的均一性样品。本文介绍一种高效的化学方法，通过靶向反应性半胱氨酸巯基，实现从细菌中纯化的重组蛋白的位点特异性糖基化。...

靶向半胱氨酸巯基 体外 重组蛋白的位点特异性糖基化

本文介绍一种建立人鼻腔上皮细胞三维球状体培养的方法。通过刺激球状体，诱导其产生囊性纤维化跨膜电导调节因子（CFTR）依赖性的离子和液体分泌，并以球状体管腔大小的变化作为CFTR功能的指标进行定量分析。...

用于个体化囊性纤维化跨膜电导调节因子研究的人鼻上皮细胞球体的生成

本方案描述了利用冷冻电子显微镜测定离子通道结构的技术，包括用于在哺乳动物细胞中高效表达基因且操作简便、毒性最低的杆状病毒系统，蛋白质提取、纯化及质量检测，样品载网的制备与筛选，以及数据收集与处理。...

人源脂质敏感型阳离子通道TRPC3的表达与纯化及其通过单颗粒冷冻电镜进行结构解析

本文介绍了一种利用酵母表达、增溶并纯化多种与SLC4转运蛋白家族具有同源性的真核生物硼酸盐转运蛋白的实验方案。我们还描述了一种化学交联实验，用于检测纯化的同源多聚体蛋白的多聚化组装情况。这些方案可适用于其他难处理的膜蛋白。...

真核生物硼酸盐转运蛋白的表达、增溶与纯化

本文介绍了一种基于FRET的流式细胞术方案，用于定量分析酿酒酵母（S.

通过流式细胞术在体内检测和表征蛋白质自组装

共翻译插入预形成的纳米盘中，可实现无变性剂接触条件下，在明确的脂质环境中研究无细胞合成的膜蛋白。本方案描述了关键系统组分的制备方法，以及提高表达效率和样品质量的关键参数。...

膜蛋白共翻译插入预制纳米盘

本文介绍了一种小规模的质膜分离方案，用于表征在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中过表达的白色念珠菌（Candida...

用于分析的小规模质膜制备 白色念珠菌 Cdr1-mGFPHis

了解在酿酒酵母中异源表达和纯化囊性纤维化跨膜电导调节蛋白（CFTR）的方法。该技术可高效获取毫克级功能性蛋白，用于药物相互作用研究和囊性纤维化治疗开发。

囊性纤维化跨膜电导调节蛋白在Saccharomyces cerevisiae中表达后的纯化

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