Name: 密闭静态和流动胶体聚合物混合物的共聚焦成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-20T19:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: 了解如何使用共聚焦显微镜研究受限胶体悬浮液的相行为和输运特性。本方法通过成像胶体聚合物混合物，分析几何约束对结构动力学的影响，并揭示吸引力强度对非牛顿流动行为的作用机制。

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本研究工作得到了休斯顿大学新教员资助、得克萨斯超导中心种子基金以及美国化学会石油研究基金（52537-DNI）的支持。

1. 胶体-聚合物混合物的制备
注意：本实验方案使用聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）颗粒，该颗粒通过聚（12-羟基硬脂酸）进行空间位阻稳定化，并用荧光染料（如尼罗红、罗丹明B或荧光素）标记，其合成方法遵循标准配方52。
<ol>
	<li>制备溴代环己烷的3:1（w/w）混合物&#160;（CXB）和十氢化萘（DHN）作为储备溶剂。该混合溶剂的密度和折射率与颗粒接近。加入有机盐四丁基氯化铵（TBAC）46，加入溶剂中至终浓度为1.5 mM，以部分屏蔽颗粒上的电荷。</li>
	<li>为了精确测定颗粒的密度，需在 CXB:DHN 溶剂中配制颗粒体积分数约为 Φ = 0.10 的悬浮液。将悬浮液在 800 × g 条件下离心 75 分钟，并逐滴加入 CXB 或 DHN 以优化浮力匹配。在本实验中，测得 PMMA 颗粒的密度为 ρ = 1.223 g/ml。</li>
	<li>在CXB:DHN溶剂混合物中制备PMMA颗粒的高浓度储备悬浮液（此处，Φ = 0.40）。</li>
	<li>配制线性聚苯乙烯（PS）在CXB:DHN溶剂混合物中的浓溶液。此处，使用分子量为M的PS溶液w ≈ 3,000,000（回转半径） rg = 15 nm）的颗粒在特定浓度下制备 cp ≈ 50 mg/ml</li>
	<li>将适量的颗粒、聚合物和溶剂储备混合物按重量混合，配制出所需颗粒和聚合物浓度的悬浮液。 
	注意：此处在固定胶体体积分数 Φ = 0.15 和自由体积中不同聚合物浓度的条件下，制备单分散颗粒的悬浮液53 cp 0–25 毫克/毫升，制备具有两种粒径的胶体粒子双分散悬浮液，每种粒径的粒子带有不同的荧光标记，在固定总胶体体积分数 Φ = 0.15、小粒子体积分数比 r = 0.50、以及自由体积中聚合物浓度为 5 或 25 毫克/毫升的条件下进行。</li>
	<li>每种悬浮液制备完成后，逐滴加入 CXB 或 DHN，并在 800 × g 条件下离心至少 75 分钟，以确认悬浮液中的颗粒和团簇仍保持浮力匹配。</li>
	<li>所有样品在成像实验前须至少平衡24小时。</li>
</ol>
2. 静止样品实验：相行为
<ol>
	<li>为确定体相行为，使用玻璃盖玻片制作矩形腔室（图1a）。对于本研究中的胶体-聚合物混合物，腔室厚度 h = 1 mm（由显微镜载玻片的厚度决定）可实现体相行为。</li>
	<li>为了在单次显微成像实验中实现多种受限条件，使用单个盖玻片作为楔形一端的间隔物，制作薄的楔形腔室（图1b）。腔室的开口角小于&#60;0.5°，使得在单个视野中腔壁几乎完全平行。一个典型的腔室可提供 h = 6 至 &#62;100 µm 的受限厚度范围。</li>
	<li>在盖玻片基底上构建腔室，以便在倒置显微镜下成像，并使用紫外光固化环氧树脂密封，该环氧树脂不溶于 CXB-DHN 溶剂混合物。</li>
	<li>使用共聚焦显微镜对样品进行成像。本方案演示了与配备数值孔径 NA = 1.40 的 100X 油浸物镜的倒置显微镜相连的线扫描共聚焦显微镜的成像过程。</li>
	<li>使用激光光源激发染料。此处采用波长 λ = 491 nm 或 561 nm 分别激发荧光素和罗丹明/尼罗红染料。</li>
	<li>在点扫描系统中，通过共聚焦软件快速扫描样品（在 x-y 平面）的焦点来生成图像。一幅尺寸为 512 像素 × 512 像素、覆盖约 50 μm × 50 μm 区域的二维图像可在 1/32 秒内采集完成。通过多帧图像平均或延长采集时间来提高图像质量。</li>
	<li>确定腔室底部（z = 0）的位置，例如通过聚焦附着在腔室底部的颗粒来实现。在此设置中，随着焦点向腔室内深入，高度（z）增加。</li>
	<li>例如，通过在腔室中平面（x-y 平面）采集二维时间序列图像，来表征受限对颗粒动力学的影响。在典型实验中，以每秒 1 帧的帧率（时间间隔 ∆t = 1 秒）采集 500 幅尺寸为 512 像素 × 512 像素的图像。</li>
	<li>作为第二个示例，通过采集三维图像序列（x, y, z）来表征颗粒的三维结构。在典型实验中，在腔室内多个 z 位置采集二维图像（512 像素 × 512 像素），相邻图像之间由压电陶瓷控制，保持恒定间距 ∆z = 0.2 µm。因此，覆盖厚度 h = 30 µm 的体积堆栈包含 151 幅图像。</li>
	<li>使用基于 IDL23,54-56、MATLAB57,58、LabView59 或 Python60 编写的颗粒追踪软件，在二维或三维空间中对颗粒进行定位与追踪。这些算法通常可将颗粒中心定位精度控制在 40–50 nm 范围内。成功的颗粒追踪要求颗粒在连续帧之间的移动距离小于颗粒间的平均间距。</li>
	<li>根据颗粒位置计算结构与动力学参数。此处展示的三个常用参数为：三维对关联函数 g(r)61、二维均方位移（MSD）58,62 以及二维自关联范霍夫函数 Gs(x,t)58。后两个参数也可在三维条件下计算。</li>
</ol>
3. 流动实验：流动特性
<ol>
	<li>使用具有方形横截面（100 μm × 100 μm）的玻璃微毛细管并将其固定在聚四氟乙烯（Teflon）管上，制作一个简单的流动池。用玻璃盖玻片支撑毛细管以提供机械刚性，如图7示意图所示。</li>
	<li>将胶体-聚合物混合物装入玻璃注射器中，并将注射器连接至注射泵或气动液体分配系统。</li>
	<li>将流动池装置安装在倒置显微镜上。保持注射器、流动池和出口处于相同高度，以尽量减少重力对流动剖面的影响。</li>
	<li>通过体积流速（用于注射泵）或施加压力（用于压力盒）控制悬浮液在流动池中的流速。微通道中悬浮液的平均速度还取决于悬浮液的配方。此处测得的方形微通道中最大速度的典型值为 200–2,000 μm/sec。</li>
	<li>在流动过程中，以较高的帧率采集二维共聚焦时间序列图像。此处，在距微通道底部（z = 0 µm）不同高度（z = 5–50 µm）处，以每秒32帧（时间间隔 Δt = 1/32 秒）的速度采集了500幅尺寸为512像素 × 512像素的图像。每幅图像覆盖微通道横向尺寸（y方向）的大约一半，如图7插图所示。若颗粒呈现椭圆形，则应提高图像采集的帧率。</li>
	<li>与静止实验类似，使用标准算法（如在IDL或MATLAB中用于定位和追踪颗粒的算法）在二维图像中定位颗粒。对于流动较慢的情况，即颗粒在相邻帧之间的位移小于平均颗粒间距时，可使用追踪算法获取颗粒轨迹。</li>
	<li>使用图像相关法计算快速流动的速度剖面。
	<ol>
		<li>沿流动方向（x方向）将图像划分为若干高度恒定的水平子图像。对于两幅连续图像 I1(x,y) 和 I2(x,y)，将后一幅图像沿x方向平移一个量Δx，然后计算 I1(x,y) 与 I2(x+Δx,y) 之间的互协方差。</li>
		<li>确定使每对图像之间互协方差最大的Δx值分布的峰值位置，从而获得每个横向位置 y 处的平均对流速度。如果该分布未出现明显峰值，则应以更高的帧率采集图像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

胶体悬浮液被广泛用作研究受限相行为的模型体系，因为微米级胶体粒子的动力学过程显著慢于原子和分子，因而能够方便地进行实时成像与追踪10。在这些基础研究中，理解粒子间吸引力对受限相行为的影响，有助于探索毛细凝聚与蒸发等现象21,22,67。此外，具有吸引力的受限悬浮液在工业和技术应用中普遍存在。在这些应用研究中，理解悬浮液配方对受限流动行为的影响，可能有助于优化用于快速成型的原料和油墨1-3、药物递送4、提高石油采收率5-7以及储能应用8中的配方设计。
用于研究薄层几何结构中微米级胶体结构的其他技术包括电子显微镜17,18、X射线显微镜19和激光衍射显微镜20。共聚焦显微镜与图像分析算法的结合为受限胶体悬浮体系的研究提供了两个关键优势。首先，共聚焦显微镜能够对致密且具有荧光的悬浮液内部进行深层成像。其次，从共聚焦显微图像中获得的粒子轨迹可用于计算单个微米级胶体粒子的动力学和结构参数。这些测量...

本文展示了（a）在二维和三维条件下对受限的胶体-聚合物混合物在静止和流动状态下的共聚焦成像，以及（b）对所得图像进行粒子追踪和相关性分析，以获取有关相行为和流动特性的定量信息。
具有粒子间吸引力的胶体悬浮液在技术应用中普遍存在，可用作定向组装1-3、药物递送4、提高碳氢化合物采收率5-7以及能量存储8的材料。这些应用的一个共同特点是，粒子必须流经精细几何结构，例如喷嘴、打印头、微通道或多孔介质，和/或被塑造成薄膜或细棒。用于探测微米级胶体在受限几何条件下结构的技术，包括电子显微镜17,18、X射线显微镜19和激光衍射显微镜20，可用于测量微尺度下粒子的结构与动力学行为。然而，这些技术无法获取单个粒子的运动轨迹，而轨迹数据可用于计算结构和动力学参数，从而与数值模拟结果进行直接比较21,22。
共聚焦显微镜是荧光显微镜的一种变体，能够对荧光样品的薄层进行成像。在胶体科学10中，该技术特别适用于对浓稠悬浮液内部或三维结构进行成像。将粒子追踪算法23应用于共聚焦显微图像的二维或三维时间序列，可获得所有可见粒子的运动轨迹。因此，共聚焦显微镜与粒子追踪技术的结合已被用于研究胶体悬浮液的相行为、结构及动力学特性，包括有序晶体24-27以及无序玻璃态28-31和凝胶32-35。
其他图像分析算法可用于从共聚焦显微图像的时间序列中测量颗粒动力学。例如，可通过共聚焦差分动力学显微镜分析时间上的强度波动，来研究颗粒的扩散动力学。36当粒子位移大于粒子间距时，图像相关37 基于粒子图像&#160;测速法38-40 可用于测量颗粒的速度分布。追踪算法与相关算法的结合，使得在经历慢速和快速流动的系统中测量胶体动力学成为可能11-16,41-45.
我们使用胶体-聚合物混合物作为吸引性胶体悬浮液的模型9在这些混合物中，粒子间吸引力势能的作用范围和强度受到控制 通过 聚合物回转半径与粒子半径的比值&#160;并控制聚合物的浓度和静电排斥力 通过 单价离子的添加&#160;有机盐46由于颗粒间的相互作用可以精确调控，这些混合物的固化过程已通过共聚焦显微镜得到广泛研究 34,47-51.
本文展示了对静止和流动的胶体-聚合物混合物进行共聚焦成像及图像分析37，其中胶体体积分数固定为 Φ = 0.15，用于研究受限条件对这些混合物相行为和流动特性的影响。这些技术广泛适用于折射率匹配的颗粒体系，且在该体系中颗粒和/或溶剂可标记荧光染料。

<table><tbody><tr><td>溴代环己烷</td><td>Sigma Aldrich</td><td>135194</td><td>CAS 编号&amp;nbsp; 108-85-0，分子量 = 163.06，用作储备溶剂</td></tr><tr><td>十氢化萘</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D251</td><td>CAS 编号 91-17-8，分子量 = 138.25，用作储备溶剂</td></tr><tr><td>尼罗红</td><td>Sigma Aldrich</td><td>72485</td><td>荧光染料</td></tr><tr><td>5(6)-异硫氰酸荧光素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F3651</td><td>荧光染料</td></tr><tr><td>罗丹明 B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>83689</td><td>荧光染料</td></tr><tr><td>动态光散射&amp;nbsp;</td><td>Brookhaven Instruments</td><td>BI-APD</td><td>用于粒径测量的 DLS 设备</td></tr><tr><td>聚苯乙烯&amp;nbsp;</td><td>Varian/Agilent</td><td>PL20138-23</td><td>用于诱导耗竭吸引作用的聚苯乙烯（聚合物）</td></tr><tr><td>四丁基氯化铵 (TBAC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>86870</td><td>单价盐</td></tr><tr><td>紫外固化胶</td><td>Norland Adhesive</td><td>NOA 68T</td><td>产品编号 68T01（紫外光固化胶）</td></tr><tr><td>VT Eye</td><td>Visitech</td><td>VT Eye</td><td>共聚焦扫描仪</td></tr><tr><td>VT Infinity</td><td>Visitech</td><td>VT Infinity</td><td>共聚焦扫描仪</td></tr><tr><td>显微镜&amp;nbsp;</td><td>Leica</td><td>DMI3000B</td><td>倒置显微镜</td></tr><tr><td>离心机</td><td>Thermo Scientific</td><td>Sorvall ST 16</td><td>1–5,000 rpm</td></tr><tr><td>聚四氟乙烯管</td><td>smallparts</td><td>SLTT 26-72</td><td>Zeus PTFE Sublite 壁管，26 AWG，内径 0.016&quot;，壁厚 0.003&quot;</td></tr><tr><td>环氧树脂</td><td>Devcon</td><td>DA051</td><td>5 分钟固化环氧树脂</td></tr><tr><td>注射器</td><td>Micromate/Cadence</td><td>5004</td><td>带金属鲁尔锁头的玻璃注射器</td></tr><tr><td>注射器针头&amp;nbsp;</td><td>Nordson</td><td>7018462</td><td>32 号精密针头&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>注射泵&amp;nbsp;</td><td>New Era Pump system Inc.</td><td>NE1002X</td><td>可编程微流控泵（syringepump.com）</td></tr><tr><td>电子天平</td><td>Mettler Toledo</td><td>AB204-S</td><td>0.0001–220 g</td></tr><tr><td>PMMA 颗粒</td><td>自行合成</td><td></td><td>聚甲基丙烯酸甲酯胶体颗粒</td></tr></tbody></table>

受限静态与流动胶体-聚合物混合物的共聚焦成像

Confocal Imaging of Confined Quiescent and Flowing Colloid-polymer Mixtures

具有吸引性粒子间相互作用的受限胶体悬浮液的行为，对于定向组装材料1-3、药物递送4、提高碳氢化合物采收率5-7以及用于能量存储的可流动电极8的理性设计至关重要。含有荧光胶体和非吸附性聚合物的悬浮液是一类理想模型体系，因为聚合物的回转半径与粒子半径的比值&#160;以及聚合物浓度可分别调控粒子间吸引力的作用范围和强度。通过调节聚合物性质和胶体的体积分数，可以获得胶体流体、簇流体、凝胶、晶体和玻璃态等多种相态9。&#160;共聚焦显微镜是荧光显微镜的一种变体，能够以高空间和时间分辨率对光学透明且具有荧光的样品进行三维成像。在该技术中，一个微小的针孔或狭缝会阻挡来自样品中显微镜光学系统焦体积以外区域的发射荧光。因此，仅对样品焦平面内的薄层进行成像。该技术特别适用于在单粒子尺度上研究浓稠胶体悬浮液的结构与动力学：这些粒子足够大，可利用可见光分辨，并且扩散速度足够慢，能够在商用共聚焦系统的典型扫描速度下被有效捕捉10。扫描速度和分析算法的进步也使得对流动中悬浮液进行定量共聚焦成像成为可能11-16,37。&#160;本文中，我们展示了利用共聚焦显微镜实验研究受限条件下胶体-聚合物混合物的相行为和流动特性的方法。首先，我们制备了密度和折射率匹配的胶体-聚合物混合物。接着，我们介绍了一种标准实验流程，用于在薄楔形池中对静止的浓稠胶体-聚合物混合物在不同受限条件下的成像。最后，我们演示了在微通道流动过程中对胶体-聚合物混合物进行成像的实验方案。

为了演示共聚焦成像和粒子追踪技术，我们研究了受限环境对胶体-聚合物混合物相行为的影响63-65。在这些实验中，胶体粒子的直径为 2a = 0.865 μm。胶体体积分数固定在 Φ = 0.15，聚合物浓度 cp 从 0 变化到 23.6 mg/ml。典型的共聚焦图像如图263左列所示。根据使用追踪算法获得的粒子位置，我们计算了代表性的结构和动力学参数，包括对关联函数（图2，中列）和均方位移（图2，右列）。这些图像以及结构和动力学参数使我们能够区分胶体凝胶（图2，上行）、团簇流体（图2，中行）和普通流体（图2，下行）。
这些指标使我们能够定量评估受限条件引起的颗粒结构和动力学变化。例如，对于聚合物浓度为 cp = 16.6 mg/ml 的样品，...

共聚焦显微镜用于成像静止和流动的胶体-聚合物混合物，这些混合物被用作吸引力悬浮体系的模型系统。图像分析算法用于计算胶体粒子的结构和动态参数，以量化几何限域所引起的变化。

具有吸引性粒子间相互作用的受限胶体悬浮液的行为对于定向材料的合理设计至关重要……

以下实验的总体目标是利用共聚焦显微镜定量分析具有吸引力的胶体悬浮液在受限条件下的相行为变化及其输运特性。通过配制胶体-聚合物混合物以模拟具有吸引力的胶体悬浮体系，将这些混合物置于薄楔形池中进行成像和受限观察，从而揭示受限环境如何改变这些混合物的结构动力学行为和相变特性。接下来，当混合物流经微通道时对其进行成像，以确定胶体间相互作用力强度对混合物受限传输特性的影响。自动图像分析和粒子追踪算法可揭示静态限制如何导致固化及图像相关性。算法还可显示，随着相互作用力增强，流动行为逐渐偏离牛顿流体特性。该技术相较于其他方法（如电子显微镜和动态光散射）的主要优势在于，它能够直接追踪单个粒子的运动轨迹，从而计算出动力学和结构参数，并可直接与模拟结果进行比较。这一标准方法有助于回答软凝聚态物理领域中的关键科学问题，例如：在粒子间相互作用存在的情况下，悬浮体系如何实现自组装；或当施加外力或应力时，固-液悬浮体系如何发生屈服。在本实验方案中，已制备了用染料标记的PMMA粒子，有关标准制备方法的详细信息，请参见文本方案中提供的相关参考文献。按重量比将broy heane与deco hydro nataline lean以3:1的比例混合，随后加入四丁基铵和有机盐至终浓度为1.5毫摩尔。该溶剂与颗粒的折射率相匹配，并部分屏蔽其电荷，以精确测定颗粒密度，并将颗粒以0.1体积分数悬浮于已制备的溶剂中。将悬浮液在800 ×g条件下离心75分钟。检查颗粒在离心后是否未发生沉降。随后，为防止颗粒沉降，可逐滴加入基础溶剂，使溶剂密度与颗粒密度相匹配。接着，将PMMA颗粒在已配制的溶剂混合物中制备成40%的悬浮液。同时，在溶剂混合物中制备高浓度的线性聚环烯。例如，根据聚苯乙烯的分子量和回转半径，配制浓度为50毫克/毫升的溶液。使用高浓度的PMMA颗粒悬浮液和聚苯乙烯溶液，可制得含有聚合物的、具有目标浓度的颗粒悬浮液。此处悬浮液含有15%体积分数的PMMA颗粒，通过将两种不同尺寸和不同标记的PMMA颗粒以相等体积分散，聚合物浓度范围为0至25毫克/毫升。各组分也可与聚合物溶液混合。每种悬浮液混合后，先进行离心，然后逐滴加入溶剂，使溶剂密度与颗粒密度尽可能接近。最后，在成像前将密封的样品置于振荡器中至少 24 小时，以使所有样品达到平衡状态。首先，用玻璃盖玻片组装矩形腔室。此处显微镜载玻片的厚度为 1 毫米，因此腔室的厚度可允许带环聚合物混合物表现出整体行为。如果需要多高度的腔室，可使用单个盖玻片在楔形支架上间隔形成薄的楔形腔室。腔室的开口角度小于0.5度，腔室厚度从6微米逐渐增加至1毫米。该设计可实现限制厚度的连续调节，腔室可制备为适用于倒置显微镜，并使用对所用显微镜溶剂混合物具有抗性的紫外光固化环氧树脂进行密封。以下是一个与倒置显微镜相连的线扫描共聚焦扫描头，配备100倍油浸物镜，数值孔径为1.4

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