通过高剪切均质化与连续浓缩制备基于脂质的高浓度氧微泡乳剂

本实验的总体目标是制备大量可自组装的、基于脂质的携氧微泡（OMS），用于静脉输注供氧。该过程采用高剪切均质器和密闭耐压罐来制备并连续浓缩OMS。第二步是使用改良注射器对含有70%体积氧气的LOM乳剂进行挤出处理。

接下来，通过离心浓缩乳液，得到体积分数为90%的氧气泡沫。最后一步是进行质量控制，通过计算氧气体积分数并利用光散射技术评估粒径分布。最终，高剪切均质化可制备出两升含90%（体积分数）氧气的OMS。

与现有的制造方法（如超声处理和混合法）相比，该技术的主要优势在于，均质化能够产生自组装的微泡，产量可达数升，足以满足大动物治疗性氧输送测试所需的体积。该技术的用途之一是治疗严重低氧血症患者，因为充满氧气的微泡可在数秒内将氧气传递给脱氧血红蛋白，并且其携氧量可达血液的三倍。该方法的演示至关重要，均质器探头的浸入深度尤为关键。

维持一个完全氧化的环境，并区分浓缩的液态金属硫蛋白（LMS）与水相，可能较难理解。用于制造脂质基氧气微泡（OMS）的系统包括一个配备单级搅拌器的储存浓缩罐（HCT）、一个管路式高剪切均质机、一个在HCT与均质机之间输送液体的蠕动泵，以及一个换热器。

开始系统组装时，将一个已灭菌的广口四升玻璃收集容器置于单级混合器下方，该容器配有两个底部接口和三个侧面接口。将HCT的1号底部接口连接一段长约10英寸、内径为3/8英寸的无菌透明管路，管路末端安装三通旋塞阀，用于收集浓缩乳剂。接着，将2号底部接口连接一段长约36英寸、内径为3/8英寸的无菌管路，并将此管路穿过滚压泵。

高速均质器的入口处安装有一个三通接头，该接头包含两个端口。将2号端口的管路通过滚轴泵后连接至三通接头的侧端口。将另一个端口通过低流量氧气流量计连接至氧气瓶。

将高剪切均质机的出口端连接至维持在4摄氏度的管路式热交换器的入口端。将热交换器的出口端连接至HCT的回流端口，形成一个闭合回路系统。通过流量计将氧气罐连接至HCT的4号端口。

最后，将一个与大气相通的气体成分监测器连接到HCT顶部的端口。开始此操作时，将20克GMP 1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DSPC）和10克胆固醇置于HCT底部。向HCT中加入1升血浆模拟液A，并手动搅拌一分钟，尽可能将脂质充分分散至水相中。

将单级混合器放入水相中，确保整个混合器头部被水相完全覆盖。为防止环境空气污染顶空，使用橡胶密封圈或胶带确保HCT顶部密封且无开放的侧向端口。打开连接至4号端口的气源，并等待直至HCT顶空中氧气浓度超过95%。使用单级混合器以5,000 RPM的速度混合前体乳液5分钟，所得混合物应呈淡白色，且无可见脂质团块。

混合后，未使用的脂质水混合物可在4摄氏度下保存长达30天，以备后续使用。通过将滚轴泵开启至1.3升/分钟（LPM），用前体乳液对整个封闭循环系统进行预填充。系统预填充完成后，保持泵速为1.3 LPM，开始LO的制备。

将在线高剪切均质机开启至 7,500 RPM。随后立即以 0.5 LPM 的流速向均质机的进气端通入氧气。保持 HCT 中单级搅拌器以 3,500 RPM 运行。

在转子叶片与在线均质机内的乳化筛网界面处会形成乳滴（Oms）。在最初的几分钟内，液体应明显变得更加黏稠。运行系统15分钟后，关闭高剪切均质机及其氧气进气口。

这可以减轻相分离，并使产物在HCT中保持相对均匀。需要注意的是，在连续浓缩阶段，充气乳剂的体积应增加约两到三倍。用于收集所制备OMS的140毫升螺口注射器，此前已进行过改装：先将100毫升空气抽入注射器，然后锯掉140毫升刻度线以上的多余活塞和注射器材料。

使用无菌的改良注射器连接至收集容器底部端口一的旋塞，用齿镊将活塞推下，吸取100毫升液体，将注射器盖紧盖子后重复操作，直至所有液体被移除。将注射器放入冷藏桶式离心机中，盖端朝下放置，在225 × g 条件下离心10分钟。离心后可见三层物质，排出并弃去底部多余的浑浊水相层。

第二层为亮白色，含有浓缩的泡沫。使用三通旋塞阀将浓缩的泡沫转移至一个不透气的玻璃注射器中，以防止环境气体污染。弃去最下层，该层含有从破裂的oms中释放出的游离氧气。

可通过如下方法计算气体浓度来评估泡沫质量。高质量的泡沫其气体浓度应达到或超过90体积百分比，并通过光学光散射对作为第二项质量控制的微泡进行检测，以确定粒径是否处于预期范围内。需要注意的是，均质化时间或配方的改变可能会影响气泡尺寸，将装有浓缩oms的玻璃注射器 tightly capped。

使用鲁尔锁接头，注射器可保存在 22 摄氏度、4 摄氏度或负 20 摄氏度条件下。较低的温度可能有助于提高储存稳定性和延长保质期。采用本方案可在 90 分钟内制备最多两升浓缩 OMS。

通过光学显微镜观察10微升OMS样品，可见球形OMS以及相对大量的脂质碎片。当使用光散射法评估同一样品时，其平均粒径为2.624 ± 0.332微米。超过90%的OMS直径小于10微米，且该群体呈多分散性。

乳液黏度高度依赖于气体体积分数，因而也依赖于微泡浓度。采用40毫米平行板，在稳态流动扫描模式下，对含60%、70%和90%体积气体的2毫升LOM乳液样品进行了研究。

当剪切应力从0.1变化至1000时，含60%体积气体的含氧微泡溶液（OMS）表现出与人血相似的放射学特征。通过将不同体积、含60%体积氧气的OMS加入已知氧缺乏量的去饱和人血样本中，检测了OMS的氧含量。OMS中所添加氧体积与血液氧含量体积增量之间的关系为1.053 ± 0.03025。

这表明所测试的OMS含有近100%的氧气，几乎不含被困的气体 pockets，并能有效地将全部氧气载荷在体外转移至人血中。一旦掌握该技术，若操作得当且高效，可在90分钟内制备两升LMS。在进行此操作时，重要的是要持续目视检查OMS的积聚情况，并对LOM泡沫的浓度进行质量控制。完成此制备流程后，OMS可用于大规模静脉注射和治疗性气体的递送。