在Cytokineticž圈的活细菌超分辨率成像使用快速三维结构照明显微镜（F3D-SIM卡）
September 29th, 2014
关于活细胞内动态蛋白质的时空信息对于理解生物学至关重要。一种称为快速 3D 结构照明显微镜 （f3D-SIM） 的超分辨率显微镜揭示了有关细菌中细胞动力学 Z 环的独特信息：其珠状外观和 FtsZ 在环内的快速动力学。
该程序的总体目标是观察细菌细胞分裂过程中蛋白质 FTSZ 的动态变化。这是通过将表达 FTS 所说的 GFP 融合的芽孢杆菌微妙细胞应用于小 aros 垫的表面来实现的。然后将垫子倒置并转移到带有玻璃盖玻片底部的培养皿中。
第二步是使用 3D 结构照明显微镜或 3D SIM 成像系统在细胞分裂过程中获取细菌的延时图像。接下来，评估原始数据的质量，并丢弃由于光漂白而强度降低超过 30% 的图像。最后一步是通过测量 F-T-S-Z-G-F-P 蛋白随时间的荧光强度分布，定量分析细胞分裂过程中蛋白质定位的变化。
最终，快速 3D SIM 用于显示细菌细胞分裂过程中 dione 蛋白的动态性。与共聚焦显微镜等现有技术相比，该技术的主要优势在于，我们可以获得有关生命细胞中细胞分裂发生的变化的三维信息。虽然这种方法提供了对细菌胞质分裂的见解，但它也可以应用于我们想要观察动态蛋白质变化的其他系统，例如 M 哺乳动物细胞。
当我们看到固定细菌细胞的传统 3D sim 图像显示 FDZ 蛋白没有均匀分布在 zed 环周围时，我们首先有了这个想法。我们想进一步检查这种分布是否与 Zed 环收缩期间发生的变化有关。通常，不熟悉这项技术的人会因为油的折射率与样品不匹配而感到困难，这将导致图像质量不佳。
为了准备用于成像的芽孢杆菌最细微的细胞，将细胞生长至指数中期，如文本方案中所述。接下来，首先去除薄聚酯片，将粘合框架连接到标准显微镜载玻片上。然后将框架的暴露粘合面涂在显微镜载玻片的表面，以有效地在载玻片顶部形成一个方形孔，将厚聚酯片留在框架上，以防止在后续步骤中粘住盖玻片。
接下来，在微波炉中融化 aro 溶液，直到沸腾，将 67 微升融化的 aros 移液管放入粘合框架中。立即将盖玻片放在 aros 顶部以形成平坦的表面，并在室温下放置 5 到 10 分钟。收获样品时，取下盖玻片 1 到 2 分钟。
收获 1 毫升等分试样，然后以 8， 000 RPM 离心几秒钟，倒出上清液，将沉淀重悬于 200 微升新鲜培养基中。取 2.5 微升浓缩样品，移液到预先准备好的 aros 垫上。将样品均匀地铺在 aros 垫的平坦表面上。
然后使用镊子从显微镜载玻片上取下粘合框架，不要接触 aros 垫。从显微镜中转移 aros 垫。滑至直径为 35 毫米的培养皿，带有玻璃盖玻片底部。
用于高分辨率成像。倒置 aros 垫，使细胞悬液与培养皿的盖玻片接触。在实验当天，至少在成像前一小时打开 OMX 3D SIM 成像系统，以使系统和激光器完全稳定。
然后打开主控制器工作站上的文本协议中列出的不同组件。单击图标打开 OMX 软件。将保存数据的文件路径设置为适当的数据文件夹。
接下来，启动软工作软件。在主屏幕的 light parameters 部分打开实验所需的激光器。从通道选择中激活 FITC 相机，然后继续检查文本协议中列出的参数。
在物镜顶部滴一滴油。将含有制备细胞的样品培养皿放入载物台中，并盖上圆形加热盖。降低载物台，直到油接触到样品培养皿的底部。
让培养皿热平衡 15 分钟在使用低曝光设置的载物台中，使用纳米定位载物台控件专注于样品。在样品中上下聚焦，以确定光线是否均匀分布在样品焦平面的上方和下方。然后使用 0.5 微米的步长并标记图像堆栈的顶部和底部，然后返回到实验选项卡中的样品中间，单击获取厚度按钮设置样品采集厚度。
使用当前曝光和透光百分比设置确定样本图像的最大强度值。该值位于图像窗口下方。对于延时成像，调整曝光和透射光的百分比以获得 1100 到 1400 的最大强度。
Above background.对于图像，请激活 experiment 选项卡中的 time lapse 部分。设置所需的帧速率和数据文件中的总时间。
输入适当的文件名。单击运行按钮，在图像采集开始时开始图像采集。请注意时间序列第一帧的图像采集开始时图像的最大强度值。
在第一帧的采集结束时，检查第一帧通过 Zack 的信号强度是否降低不超过 10%。在时间序列采集结束时，打开带有 DV 后缀的生成原始图像文件，并确定从时间序列开始到最终图像的最大信号强度的降低。从过程菜单中丢弃任何照片漂白超过 30% 的时间点，激活 SI 重建窗口。
对所有参数使用预先存在的设置。激活已使用的通道特定 OTF 按钮并设置为标准过滤器集。激活已使用的通道特定 KO angles（通道特定 KO angles）按钮并设置为标准滤波器集。
将 raw 文件拖放到输入文件空间中。单击 do it。检查 FTSZ 在 Z 环周围的分布，以创建 3D 强度图。
然后打开 3D 图像文件。查看单个 z 切片。使用位于 view 菜单选项卡下的 volume viewer 工具。
要裁剪感兴趣的区域，请在输入窗口中输入此 3D 图像的窗口编号，然后在输出窗口中输入新的和未使用的窗口编号。选择区域按钮可用于从原始 40 x 40 微米视场中裁剪单个感兴趣的 Z 环。在 rotation （旋转） 选项卡中调整所需的轴和旋转角度。
单击 do it 按钮。滚动体积以获得所需的透视，即 Z 环。使用数据检查器工具调整列行尺寸，以在单个 Z 环周围创建新的感兴趣区域。
单击图像中心以定位这个新的感兴趣区域。文本图像数据是一个自动生成的表格，显示感兴趣区域内每个像素的荧光强度。单击 3D 图形按钮，最初查看强度图。
或者，可以通过单击 save table data 按钮来导出文本图像数据。在 file 菜单中，将图像数据从保存的文本文件复制到新的电子表格中。选择电子表格中的所有单元格并创建新的 3D 表面图。
格式化 3D 强度图以发布延时数据。在 3D 图像文件中的每个不同时间点上重复这些步骤。当通过传统的宽场荧光显微镜观察时，Z 环在芽孢杆菌细微差别中表现为单个横向荧光带。
整个波段的荧光强度是均匀的。定位模式对 FTS 所述聚合物在环内的结构组织和分布的见解很少，在这里，检查了相同的细胞。使用 FAST 3D sim 方法。
3D sim 图像围绕 Z 轴旋转，可以将 Z 环可视化为三维空间中的真实环结构。分辨率的提高允许可视化 FTSZ 在环内的异质分布。通过该技术可视化的芽孢杆菌 Z 环的其他示例说明了 Z 环周围的荧光强度如何永远不会相同。
此外，观察到荧光强度非常低的区域或间隙。为了量化这些观察结果，创建了 Z 环的 3D 强度图。强度图显示，在芽孢杆菌最细微的 Z 环的不同区域，荧光量可以变化多达四倍。
3D 强度图显示，间隙几乎读取了背景荧光的基线水平，以分析 Z 环内发生的动态变化。随着时间的推移，会执行 3D 模拟延时摄影。这部电影展示了芽孢杆菌微妙 Z 环内的 FTSZ 是如何不断变化的，并通过为每个图像生成的强度图进行测量。
观看此视频后，您应该对如何培养和制备细菌细胞、如何使用 3D Sim 对它们进行成像、如何分析它们以获得定量数据，以及最后如何提供演示质量的图像有很好的了解。在图像采集过程中，监测细胞的健康状况以及在采集过程中监测荧光蛋白的表达水平非常重要。这项技术为细菌细胞生物学领域的其他人使用其他超分辨率显微镜方法并定位不同生物体中的其他细菌蛋白质铺平了道路。
按照这个程序，可以进行其他形式的超分辨率显微镜检查，例如光激活定位显微镜，以查看 FDS 所述蛋白质随时间的动态变化。
概述
本研究利用快速3D结构光照明显微镜（f3D-SIM）观察细菌细胞分裂过程中FtsZ蛋白的动态变化。该技术为细胞分裂Z环提供了独特的洞察，揭示了其珠状结构和FtsZ的快速动力学。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 显微镜技术
- 蛋白动力学
背景
- 理解蛋白动力学对于洞察细胞过程至关重要。
- FtsZ是细菌细胞分裂中涉及的关键蛋白。
- 传统显微技术可能无法提供足够的细节用于活细胞成像。
- 快速3D-SIM在捕捉动态过程方面比共聚焦显微镜具有优势。
研究目的
- 观察细菌细胞分裂过程中FtsZ的定位和动力学。
- 评估f3D-SIM在研究活细胞方面的优势。
- 探索FtsZ分布与Z环收缩之间的关系。
使用的方法
- 制备表达FtsZ-GFP融合蛋白的芽孢杆菌细胞。
- 使用3D SIM成像系统进行时间序列成像。
- 评估图像质量和光漂白效应。
- 对时间分布的荧光强度进行定量分析。
主要结果
- f3D-SIM揭示了细胞分裂过程中FtsZ的动态性质。
- 在整个过程中观察到FtsZ定位的显著变化。
- 该技术提供了Z环结构的三维洞察。
- 发现表明f3D-SIM在其他生物系统中的潜在应用。
结论
- 快速3D-SIM是研究活细胞中动态蛋白变化的强大工具。
- 该方法增强了对细菌细胞分裂的理解。
- 未来的应用可以扩展到各种细胞系统。
常见问题
Executive Industry Relevance
Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM) enables high-resolution, live-cell imaging of dynamic protein complexes such as the bacterial cytokinetic Z ring, providing quantitative spatial and temporal data critical for target validation in antimicrobial discovery. By resolving heterogeneous protein distributions and tracking constriction dynamics in real time, f3D-SIM supports mechanistic de-risking of antibacterial targets and informs structure-function relationships essential for lead identification. This capability bridges early discovery and preclinical assessment by delivering reproducible, three-dimensional readouts that enhance predictive confidence in modulating essential cellular processes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing nanoscale organization and dynamics of essential proteins like FtsZ during cell division.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct observation of target engagement and functional consequences in live bacterial systems.
- Predictive Value: Generates quantitative intensity distribution data that correlates with Z ring constriction, aiding in prioritization of targets with validated mechanistic roles.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, super-resolution imaging readouts that detect subtle changes in protein localization indicative of compound-induced phenotypes.
- Operational Value: Delivers reproducible 3D intensity plots and z-stack data suitable for high-content screening formats requiring precise spatial quantification.
- Assay Readiness: Enables preparation of validated bacterial imaging pads compatible with time-lapse acquisition, supporting assay standardization across discovery campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Facilitates correlation of molecular target dynamics with phenotypic outcomes, supporting extrapolation from bacterial models to broader antimicrobial screening.
- Mechanistic De-risking: Reveals heterogeneity and gap formation within the Z ring, offering insights into compensatory mechanisms that may influence target essentiality.
- Predictive Confidence: Provides baseline and perturbed state comparisons of FtsZ distribution, enabling assessment of compound effects on cytokinetic fidelity.
Pipeline & Workflow Integration
f3D-SIM fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead optimization, where live-cell imaging of protein dynamics informs both early validation and preclinical progression decisions.
- Discovery Biology: Enables hypothesis-driven visualization of protein nanoscale reorganization during cellular processes, reducing ambiguity in target mechanism.
- Screening: Generates quantitative, spatially resolved fluorescence intensity metrics that support detection of phenotypic hits in compound libraries.
- Analytics: Outputs 3D intensity plots and z-sectional data that allow comparison of protein distribution states across experimental conditions.
- Translational Research: Connects molecular-scale target behavior to cellular phenotypes, supporting risk-adjusted advancement in antimicrobial programs.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform applicable to multiple targets and organisms, maximizing infrastructure investment across discovery portfolios.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances target validation confidence by resolving dynamic protein complexes at super-resolution in physiologically relevant contexts.
- Operational Value: Delivers standardized, photobleaching-controlled imaging workflows with quantitative outputs suitable for multi-user core facilities.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing mechanistic insights that reduce late-stage failure risk in antibacterial programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on direct visualization of functional dynamics and structural vulnerability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in super-resolution microscopy, sample preparation, and 3D image analysis for accurate interpretation of protein dynamics.
- Dependent on stabilized 3D-SIM systems with laser calibration and refractive index matching to prevent image degradation.
- Necessitates cross-team standardization of imaging protocols, photobleaching thresholds, and quantification methods for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when transferring the method from bacterial to mammalian or other eukaryotic systems due to differences in sample thickness and optical properties.
- Limited by the need to monitor photobleaching, with time points exceeding 30% intensity loss excluded from analysis per protocol.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:04
Sample Preparation
4:05
Preparation of the Microscope
5:01
Image Acquisition
6:44
Checking Data Quality and Reconstructing 3D-SIM Images
8:01
Generating 3D Intensity Plots of the Z Ring from 3D-SIM Image Data
9:58
Results: OMX Fast 3D-SIM to Investigate FtsZ-GFP Localization and Dynamics in Live Bacillus subtilis
11:39
Conclusion
