利用快速三维结构光照明显微镜（f3D-SIM）对活体细菌中细胞分裂Z环进行超分辨率成像

本实验的总体目标是观察细菌细胞分裂过程中蛋白 FTSZ 的动态变化。该目标通过将表达 FTSZ-GFP 融合蛋白的枯草芽孢杆菌细胞接种到小型琼脂垫表面来实现。随后将琼脂垫倒置，并转移至底部带有玻璃盖玻片的培养皿中。

第二步是使用三维结构照明显微镜（3D structured illumination microscopy，3D SIM）成像系统对细菌在细胞分裂过程中的动态进行延时成像。接下来，评估原始数据的质量，剔除因光漂白导致荧光强度下降超过30%的图像。最后一步是通过测量F-T-S-Z-G-F-P蛋白随时间变化的荧光强度分布，定量分析其在细胞分裂过程中定位的变化。

最终，快速3D SIM被用于展示二酮蛋白在细菌细胞分裂过程中的动态行为。与共聚焦显微镜等现有技术相比，该技术的主要优势在于，我们能够获得活细胞分裂过程中三维结构变化的信息。尽管该方法为研究细菌细胞质分裂提供了重要见解，但它也可应用于其他需要观察动态蛋白变化的系统，例如哺乳动物细胞。

我们最初产生这一想法，是因为在观察固定细菌细胞的传统3D模拟图像时发现，FDZ蛋白在Z环周围的分布并非均匀。我们希望进一步探究这种分布是否与Z环收缩过程中发生的变化相关。通常，初次使用该技术的研究人员会遇到困难，其原因在于未能将所用油的折射率与样品匹配，从而导致成像质量不佳。

为制备用于成像的枯草芽孢杆菌细胞，需按照文本方案中的说明将细胞培养至对数生长中期。接着，将粘附框贴附到标准玻璃显微镜载玻片上：首先移除薄的聚酯薄膜，然后将框体暴露的粘性面紧密贴合在载玻片表面，从而在载玻片上形成一个方形微池。在后续步骤中，保持厚的聚酯薄膜附着在框体上，以防止盖玻片发生粘连。

接下来，将 aro 溶液在微波炉中加热至熔化并沸腾，用移液器吸取 67 µL 熔化的 aros 液体至粘附框中。立即在 aros 上方放置盖玻片以形成平整表面，并在室温下静置 5 至 10 分钟。在样品收获期间，将盖玻片移除 1 至 2 分钟。

离心后取1毫升样品，离心条件为8,000 RPM，持续数秒，弃去上清液，将沉淀重悬于200微升新鲜培养基中。取2.5微升浓缩样品，用移液器滴加到预先制备好的aroS垫上，将样品均匀涂布在aroS垫的平坦表面。

然后用镊子从显微镜载玻片上移除粘性框架，注意不要触碰 aros 垫。将 aros 垫从显微镜载玻片转移至底部带有玻璃盖玻片的 35 毫米直径培养皿中。

为了获得高分辨率图像，将 aros 垫片翻转，使细胞悬液与培养皿的盖玻片接触。在实验当天，至少在成像前一小时开启 OMX 3D SIM 成像系统，以确保系统和激光器充分稳定。

然后按照主控制器工作站文本方案中列出的顺序开启各个组件。通过点击图标打开OMX软件。将数据保存的文件路径设置为适当的数据文件夹。

接下来，启动软工作软件。在主屏幕的光参数部分打开实验所需的激光器。从通道选择中激活FITC相机，然后按照文本方案中列出的参数进行检查。

在物镜顶部滴加一滴油。将含有已制备细胞的样品培养皿放入载物台凹槽中，并盖上圆形加热盖。降低载物台，直至油浸没到样品培养皿底部。

将培养皿置于载物台上，使用低曝光设置，通过纳米定位载物台控制装置对样品进行聚焦。上下调节焦距，观察光线在样品焦平面之上和之下的分布是否均匀。然后以0.5微米为步长，标记图像堆栈的顶部和底部位置；返回实验标签页中的样品中间位置后，点击“获取厚度”按钮，以设定样品采集厚度。

使用当前的曝光时间和透光率设置，确定样本图像的最大强度值。该值位于图像窗口下方。对于延时成像，调节曝光时间和透光率，使最大强度值达到1100至1400。

高于背景。对于图像，在实验选项卡中激活时间推移部分。设置所需的时间帧率以及数据文件中的总时间。

输入合适的文件名。点击运行按钮以开始图像采集，并记录时间序列第一帧图像采集开始时的最大强度值。

在第一帧采集结束时，检查该第一帧通过Zack的信号强度下降是否未超过10%。在时间序列采集结束后，使用DV后缀打开生成的原始图像文件，并确定从时间序列开始到最终图像的最大信号强度下降情况。从“Process”菜单中丢弃任何光漂白超过30%的时间点，并激活SI重建窗口。

所有参数均使用预设设置。激活所用通道对应的 OTF 按钮，并设置为标准滤光片组。激活所用通道对应的 KO 角度按钮，并设置为标准滤光片组。

将原始文件拖放到输入文件区域。点击“开始”。通过分析Z环周围FTSZ的分布情况，生成三维强度图。

然后打开一个3D图像文件。要查看各个z平面切片，请使用位于“视图”菜单选项卡下的体积查看器工具。

要裁剪感兴趣区域，请将此 3D 图像的窗口编号输入输入窗口，并将一个新且未使用的窗口编号输入输出窗口。此时“选择区域”按钮将变为可用状态，可用于从原始 40 × 40 微米视野中裁剪出感兴趣的单个 Z 层环状区域。在旋转选项卡中调整所需的轴向和旋转角度。

点击“执行”按钮。滚动浏览图像序列，获得所需的视角，即 Z 环。使用数据检查工具调整行列尺寸，在单个 Z 环周围创建新的感兴趣区域。

单击图像中心以确定此新的感兴趣区域。文本图像数据是一个自动生成的表格，显示感兴趣区域内每个像素的荧光强度。单击3D图形按钮可初步查看强度图。

或者，可单击“保存表格数据”按钮导出文本图像数据。在文件菜单中，将保存的文本文件中的图像数据复制到新的电子表格中。选中电子表格中的所有单元格，并创建一个新的三维曲面图。

为延时数据的3D强度图绘制适合发表的格式。对3D图像文件中的每个不同时间点重复这些步骤。在常规宽场荧光显微镜下观察时，Z环在枯草芽孢杆菌中呈现为一条单一的横向荧光带。

该条带中的荧光强度是均匀的。这种定位模式对于了解FTS所述聚合物在此处环状结构中的组织构型和分布情况提供的信息有限，这些相同的细胞使用FAST 3D sim方法进行了观察。

围绕Z轴旋转3D模拟图像，可实现Z环在三维空间中真实环状结构的可视化。分辨率的提升使得Z环内FTSZ分布的异质性得以呈现。通过该技术观察到的更多芽孢杆菌Z环实例进一步表明，Z环周围的荧光强度从不均一。

此外，还可观察到荧光强度极低的区域或间隙。为了量化这些现象，我们绘制了 Z 环的三维强度图。强度图显示，在枯草芽孢杆菌 Z 环的不同区域，荧光强度最高可相差四倍。

3D 强度图显示，间隙处的荧光背景几乎降至基线水平，从而能够分析 Z 环内部发生的动态变化。随着时间推移，进行 3D SIM 时间序列成像。该视频展示了芽孢杆菌中 Z 环内的 FtsZ 蛋白持续发生动态变化，并通过为每幅图像生成的强度图进行量化测量。

观看本视频后，您应能够充分理解如何培养和制备细菌细胞，如何使用三维结构光照明显微镜（3D Sim）对它们进行成像，如何分析图像以获得定量数据，以及最终如何生成适合展示的高质量图像。在图像采集过程中，非常重要的两点是：密切监测细胞的健康状态，以及监测荧光蛋白在表达后的表达水平。该技术的建立为细菌细胞生物学领域的研究人员提供了基础，使他们能够应用其他超分辨率显微技术，并在不同生物体中定位其他细菌蛋白。

采用此方法后，还可进行其他形式的超分辨率显微成像，例如光激活定位显微成像，以观察FDS所述蛋白随时间发生的动态变化。