使用气溶胶化脂多糖诱导肺部中性粒细胞增多的方法

本实验的总体目标是通过暴露于雾化LPS来诱导稳定且可重复的气道中性粒细胞增多。首先将悬浮于生理盐水中的LPS加入连接暴露室的雾化器中，随后使小鼠暴露于雾化的LPS，然后采集支气管肺泡灌洗液，并对灌洗液中的炎症细胞进行计数。

最后，将肺组织用福尔马林固定，以便进行包埋、切片以及免疫组织化学分析。最终，支气管肺泡灌洗液中的总细胞计数和分类计数可用于评估中性粒细胞向肺组织的募集情况。与现有的气管内注射LPS等方法相比，该技术的主要优势在于气溶胶化LPS在肺内分布均匀、操作简便，且成功应用所需培训极少。为生成LPS气溶胶，需在正确佩戴个人防护装备（PPE）的情况下，在通风良好的二级生物安全柜内操作：首先将红色进气管插入雾化器，然后通过制造商提供的管路将雾化器连接至加压的室内空气源。

接下来，使用空气过滤器将雾化器的出口连接至质量流量计，然后将质量流量计连接至电源。调节气流速率为每分钟5升，保持压力在1至2巴，随后移除质量流量计并断开气流。接着，将雾化器的出口连接至一个直径为15.9毫米的分叉管，该分叉管连接两个尺寸为150 mm × 163 mm × 205 mm、配有可拆卸盖子的有机玻璃箱。

每个盒子的侧面（与进气口相对的一侧）应开一个5毫米的孔，以防止压力积聚。现在将最多五只小鼠放入每个盒子中，并盖上盖子。然后打开雾化器。

向插入件中加入4至8毫升溶于生理盐水的LPS，或仅加入生理盐水作为对照，然后将进气口重新连接至气源。让气溶胶持续流入密闭的聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）箱中，同时持续监测动物状态，并确保在气溶胶化过程中气源始终牢固连接至雾化器的进气口。10分钟后，断开气源，将动物继续留在PMMA箱中2分钟。

然后打开盖子，让气溶胶充分扩散，并在实验终点将小鼠放回笼中。对每只动物依次操作：首先用剪刀沿腹背方向做一条单一的前后切口，暴露胸腔；接着抓住胸骨前端抬起肋骨，于最腹侧位置刺破膈肌，注意避免刺入任何肺组织。

然后沿前后方向进行两处切割，使切口在下颌下方相接，打开肋骨笼。肋骨笼打开后，用镊子轻轻将其分开，并在喉部下方切断气管。现在提起气管，切断连接肺叶与胸腔的韧带。

然后轻柔地将肺和气管从脂肪组织和心脏组织中向上提起并分离，放置在一片注射器包装纸上。接着，将一根0.965毫米的聚乙烯管插入气管，并用丝线固定。同时用丝线结扎多叶肺组织，然后将一根23号针头插入聚乙烯管中。

然后收集支气管肺泡灌洗液，使用1毫升注射器将250微升冰上预冷的无菌PBS缓慢注入单个肺叶中，轻轻敲击肺组织，并在工作台表面缓慢来回轻拍30次，再将液体缓慢抽回注射器中，收集至离心管内。用200微升新鲜PBS重复该操作后，将收集的支气管肺泡灌洗液置于冰上，用于后续分析。为进行组织学分析而固定肺组织时，取出多叶肺组织并迅速在干冰上冷冻。

将肺叶置于零下80摄氏度保存。为进行组织学分析，将一个60毫升无活塞的注射器安装在金属支架上，向单个肺叶中灌注福尔马林5分钟。随后拔下针头，拉动丝线，将聚乙烯管一并从气管中取出。

同时闭合气管并保持肺部压力。接着，将肺叶置于福尔马林中，在4°C条件下浸泡24小时。第二天，用70%乙醇对固定后的组织清洗三次，每次至少20分钟。

将脱水组织包埋于石蜡膜后，切成四到五微米的切片，并用苏木精和伊红染色，以进行组织学评估。仅暴露于溶剂气溶胶的小鼠支气管肺泡灌洗液中的总细胞数通常在 200,000 个细胞左右或更低。这些细胞由 95% 至 100% 的单核细胞组成，仅含少量淋巴细胞，无中性粒细胞。

小鼠经雾化吸入浓度为1毫克/毫升的LPS后，支气管肺泡灌洗液中的总细胞数显著增加，通常在6小时后即超过500,000个细胞，且细胞浸润水平在24小时后仍维持较高状态，细胞构成以中性粒细胞为主。同样，雾化吸入5毫克/毫升LPS也可观察到类似的炎性细胞谱型及肺部中性粒细胞增多现象。

在LPS刺激后6小时和24小时，可在上皮下黏膜层以及传导性气道和血管周围的腔隙中观察到中性粒细胞，但在对照组生理盐水处理的小鼠中未观察到。与暴露于生理盐水的小鼠相比，LPS刺激小鼠支气管肺泡灌洗液中的总蛋白含量增加，且中性粒细胞趋化因子C、XCL1和CXCL2的表达在LPS刺激小鼠中也升高。

尽管该方法可提供关于脂多糖诱导肺部炎症的见解，但它也可应用于其他疾病模型，例如细菌或病毒感染，因为气溶胶化蒸汽可被调整以递送多种不同的刺激物。