采用雾化脂多糖一种产生肺中性粒细胞增多

我们描述诱导中性粒细胞肺部炎症通过挑战脂多糖雾化通过雾化，建模急性肺损伤的方法。此外，基本的手术技术对于肺隔离，气管插管和支气管肺泡灌洗也有所说明。

该程序的总体目标是通过暴露于雾化 LPS 产生一致且可重复的气道中性粒细胞增多。这是通过首先将悬浮在盐水中的 LPS 加载到连接到暴露室的雾化器中来实现的。接下来，将小鼠暴露于雾化的 LPS，然后收集支气管肺泡灌洗液并计数灌洗液中的炎症细胞。

最后，将肺组织固定，正式用于包埋和切片以及免疫组织化学分析。最终，支气管肺泡灌洗液的总细胞计数和差异细胞计数可用于评估中性粒细胞募集到肺部的情况。与气管内 LPS 给药等现有方法相比，该技术的主要优点是雾化 LPS 在整个肺部均匀分布、性能简便以及成功应用所需的最少培训要使用适当的 PPE 并在通风层内生成 LPS 气雾剂，首先将红色入口插入雾化器，然后通过管道将雾化器连接到加压室内空气制造者。

接下来，使用空气过滤器将雾化器的出口连接到质量流量计，然后将质量流量计连接到电源。将气流调整为每分钟 5 升，将压力保持在 1 到 2 巴，然后取下质量流量计并断开气流。接下来，将雾化器的出口连接到一个 15.9 毫米的分叉管，该分叉管连接到装有可拆卸盖子的 2 1 50 x 1 63 x 2 0 5 毫米有机玻璃盒。

每个盒子在与入口相对的一侧应有一个 5 毫米的孔，以防止压力积聚。现在每个盒子里最多放五只老鼠，然后盖上盖子。然后打开雾化器。

用 4 到 8 毫升溶解在生理盐水或单独生理盐水载体中的 LPS 填充插入物，然后将入口重新连接到空气供应。让气雾剂流入封闭的有机玻璃盒中，持续监测动物，并确保在气雾化过程中空气供应保持紧紧固定在雾化器的入口处。10 分钟后，断开空气供应，将动物留在有机玻璃箱中再放置 2 分钟。

然后打开盖子。让气溶胶分散并将小鼠送回实验终点的笼子依次对于每只动物，首先用剪刀做一个前后切口以露出胸部。接下来，通过胸骨前尖提起胸腔，并在最腹点刺穿横膈膜，不要切入任何肺组织。

然后打开胸腔，有两个切口，在下巴下方向前后方向相遇。胸腔打开后，用镊子轻轻将其拉开并切开喉部下方的气管。现在提起气管并切断连接肺叶和胸腔的韧带。

然后轻轻地将肺和气管向上拉，使其远离脂肪和心脏组织，并将它们放在一张注射器包装纸上。接下来，将一根 0.965 毫米的聚乙烯管插入气管并用一串丝线固定。也用丝线系住多叶，然后将 23 号针头插入聚乙烯管。

然后收集支气管肺泡灌洗液，使用 1 毫升注射器将 250 微升称为无菌 PBS 的冰缓慢注入单叶，并小心敲击肺部和工作台表面 30 次缓慢将液体吸回注射器中，并在用 200 微升新鲜 PBS 重复该过程后将其收集在管中， 将支气管肺泡灌洗液放在冰上以备后用。要固定肺组织进行组织学分析，请去除多叶并卡住。在干冰上冷冻。

将肺叶存放在零下 80 摄氏度。要固定组织以进行组织学分析，请将不带柱塞的 60 毫升注射器安装在金属支撑架上，用福尔马林充气单叶 5 分钟。然后断开针头并拉动丝线，将其与聚乙烯管一起从气管中取出。

同时关闭气管并保持肺部压力。接下来，将肺叶浸入福尔明中 4 摄氏度 24 小时。第二天，用 70% 乙醇洗涤固定的组织 3 次，每次至少 20 分钟。

将脱水组织包埋在封口膜中后，将叶切成 4 到 5 微米的切片，并用血红素和 eoin 对切片进行组织学评估。仅暴露于载体产生的气溶胶的小鼠支气管肺泡灌洗液中的总细胞数通常约为 200， 000 个细胞。这些细胞由 95% 至 100% 的单核细胞组成，只有少量淋巴细胞，没有中性粒细胞。

小鼠用每毫升 1 毫克的雾化雾化物攻击。LPS 的。然而，支气管肺泡灌洗液中的总细胞数增加，6 小时后通常超过 500， 000 个细胞，细胞浸润在 24 小时后仍然很高，并且细胞谱转向中性粒细胞为主。在雾化 5 毫克/毫升 LPS 时也观察到类似的炎症细胞谱和肺中性粒细胞增多。

LPS 攻击 6 小时和 24 小时后，在上皮粘膜下层以及传导气道和血管周围的空间观察到中性粒细胞，但未得到控制。盐水处理的小鼠。与暴露于盐水的小鼠相比，LPS 攻击小鼠支气管肺泡灌洗液中的总蛋白含量增加，并且中性粒细胞化疗引诱趋化因子 c、XCL 1 和 C XCL 2 的表达在 LPS 攻击小鼠中也增加。

尽管这种方法可以提供对 LPs 诱导的肺部炎症的见解。它也可以应用于其他疾病模型，例如细菌或病毒感染，因为雾化蒸气可以适应许多不同的挑战。