Name: 采用雾化脂多糖一种产生肺中性粒细胞增多 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: 了解雾化脂多糖诱导肺中性粒细胞增多的实验方法，通过暴露舱使小鼠吸入LPS气溶胶，结合支气管肺泡灌洗和免疫组织化学分析评估肺部炎症反应。该技术操作简便、分布均匀，适用于急性肺损伤研究。

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我们谨向Kerstin Thim（瑞典隆德阿斯利康公司）、Benita Dahlberg和Anders Eklund博士（瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡学院）以及Martin Stampfli博士（加拿大安大略省汉密尔顿麦克马斯特大学）致以诚挚的谢意，感谢他们提供的娴熟协助和专业建议。

动物研究已获得北斯德哥尔摩动物福利伦理委员会的批准。实验操作均依照瑞典法律进行。
1. 生成LPS气溶胶
<ol>
	<li>将 0.5 g 纯化的 P. aeruginosa LPS 溶于 50 ml 无菌生理盐水中，轻轻振荡以确保溶解。取 1 ml 溶解后的 LPS 加入 9 ml 无菌生理盐水中，终浓度为 1 mg/ml。用铝箔避光，于 -20 °C 保存。</li>
	<li>在室温下避光解冻溶解的 LPS，使用前充分混匀。</li>
	<li>在通风的二级生物安全柜中，将红色进气管插入雾化器，并通过制造商提供的管路将雾化器连接至加压的室内空气源（参见 图 1 中展示的实验装置示意图）。 
	注意：暴露操作过程中应佩戴适当的个人防护装备，包括带有颗粒过滤器的可重复使用半面罩呼吸器、护目镜、手套和防护服。</li>
</ol>
<img alt="用于气溶胶暴露研究的雾化系统示意图，其中小鼠置于有机玻璃箱内；包含管路和过滤器。" src="/files/ftp_upload/51470/51470fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1：用于生成气溶胶的实验装置示意图。 雾化器的进气口连接至气源。雾化器的出口首先通过一段15.9 mm的管路和一个空气过滤器连接至流量计，并将气源调节至2 kbar压力下5.0 L/min的流速。出口随后连接至一个带有可拆卸盖子和5 mm通气孔的有机玻璃箱，以防止压力积聚。
<ol start="4">
	<li>通过空气过滤器将雾化器的出口连接至质量流量计。将质量流量计连接至电源。</li>
	<li>调节空气供应至 5 L/min，压力保持在 1.0–2.0 bar。</li>
	<li>移除质量流量计并断开空气供应。</li>
	<li>将雾化器的出口连接至一根 15.9 mm 的导管，该导管分为两支，分别连接两个尺寸为 150 × 163 × 205 mm 的有机玻璃箱，箱体配备可拆卸盖子。每个箱子在进气口对面的侧壁上应设有一个 5 mm 的小孔，以防止压力积聚。</li>
	<li>将最多 5 只小鼠放入每个有机玻璃箱中，并盖上盖子。</li>
	<li>打开雾化器，向插入件中加入至少 4 ml 溶解于无菌生理盐水中的 LPS 或仅含载体（无菌生理盐水）；液体体积不得超过 8 ml。重新将进气口连接至空气供应。</li>
	<li>使气溶胶流入密闭的有机玻璃箱中持续 10 分钟。持续监测动物状态，并确保空气供应与雾化器进气口连接紧密。</li>
	<li>断开空气供应。在盖子保持关闭的情况下，让动物在有机玻璃箱中继续停留 2 分钟。</li>
	<li>打开盖子，使气溶胶充分散去，然后将动物放回笼中。若动物体表潮湿，应将笼子置于低温加热垫上，以防低体温。</li>
	<li>在实验后的最初 30 分钟内持续监测动物，之后在前 6 小时内每 2 小时监测一次。动物在雾化过程中及之后应表现出正常的呼吸模式和活动行为。</li>
</ol>
2. 支气管肺泡灌洗 (BAL)
<ol>
	<li>在实验终点，根据所在机构兽医人员的建议，使用异氟烷对动物进行深度麻醉。通过夹捏后肢足垫检查是否存在回缩反射，以确认麻醉深度足以进行重大手术。用70%乙醇喷洒动物体表毛发进行消毒。</li>
	<li>使用剪刀打开腹腔，并切断主动脉以放血处死动物。在腹部放置一块组织材料以吸收流出的血液。</li>
	<li>安乐死后，用剪刀沿腹侧正中线做一次前后向切口以暴露胸腔。用镊子夹住胸骨前缘抬起肋骨，用剪刀在最腹侧位置刺破膈肌，注意避免损伤任何肺叶。再沿前后方向做两处切口（在下颌下方汇合），以完全打开胸腔。</li>
	<li>用镊子轻轻撑开肋骨，于喉部下方剪断气管。</li>
	<li>用镊子提起气管，剪断连接肺叶与胸腔的韧带，并轻轻牵拉脂肪组织和心脏组织，完整取出肺脏。</li>
	<li>将一根聚乙烯导管（内径：0.58 mm；外径：0.965 mm）插入气管，并用丝线结扎固定导管。</li>
	<li>用丝线结扎多叶肺（右肺的四个肺叶）。</li>
	<li>将23号针头插入聚乙烯导管，使用1 ml注射器向单个肺叶缓慢注入250 µl冰上预冷的无菌PBS。</li>
	<li>轻轻叩击肺组织30次，然后通过注射器回收灌洗液。重复操作一次，加入200 µl PBS（从单个肺叶中回收的PBS总量约为300 µl，总注入体积为450 µl）。</li>
	<li>将支气管肺泡灌洗液（BALF）置于冰上保存，或立即进行细胞计数。使用血细胞计数板结合Turk溶液染色进行细胞计数11。将计数所得细胞数乘以染色液的稀释倍数及血细胞计数板计数区域内的体积，计算总细胞数。</li>
	<li>按照其他文献所述方法，对细胞离心涂片后的细胞进行分类计数11。</li>
</ol>
3. 用于组织学评估的肺组织福尔马林固定
<ol>
	<li>取出多叶肺组织，并在干冰上快速冷冻。于 -80 °C 下保存。</li>
	<li>将一个去掉活塞的 60 ml 注射器固定在金属支架上。向注射器中加入 10% 福尔马林，液面高度距实验台面 20 cm，以维持 20 cm 的恒定压力。</li>
	<li>通过带阀门的塑料管，将固定在气管上的 23 号针头连接至 60 ml 注射器，以控制福尔马林的流动。</li>
	<li>用福尔马林对肺叶进行 5 分钟的灌注。断开针头，同时牵拉丝线关闭气管以维持肺内压力，并将针头与聚乙烯管一并从气管中取出。</li>
	<li>将肺叶完全浸入福尔马林中，在 4 °C 下固定 24 小时。</li>
	<li>用 70% 乙醇清洗固定后的组织三次，每次至少 20 分钟，并按以下程序逐步脱水至二甲苯（每步 1 小时）：
	<ul>
		<li>3 次 70% 乙醇</li>
		<li>3 次 95% 乙醇</li>
		<li>3 次 100% 乙醇</li>
		<li>3 次二甲苯</li>
		<li>1 次（液态）石蜡</li>
	</ul>
	</li>
	<li>将脱水后的组织包埋于石蜡中，切成 4–5 µm 的切片，并用苏木精和伊红染色，以便进行组织学评估。</li>
</ol>

<ol><li>King, J. D., Kocincova, D., Westman, E. L., Lam, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+Lipopolysaccharide+biosynthesis+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">Review: Lipopolysaccharide biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa.</a> Innate Immun. 15, 261-312 (2009).</li>
<li>Grommes, J., Soehnlein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+neutrophils+to+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Contribution of neutrophils to acute lung injury.</a> Mol Med. 17, 293-307 (2011).</li>
<li>Pesci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+cells+and+mediators+in+bronchial+lavage+of+patients+with+chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respir+J%22%5BJournal%5D)">Inflammatory cells and mediators in bronchial lavage of patients with chronic obstructive pulmonary disease.</a> Eur Respir J. 12, 380-386 (1998).</li>
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<li>Skerrett, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+type+1+TNF+receptor+in+lung+inflammation+after+inhalation+of+endotoxin+or+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Role of the type 1 TNF receptor in lung inflammation after inhalation of endotoxin or Pseudomonas aeruginosa.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 276, L715-L727 (1999).</li>
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<li>Didon, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+epithelial+CCAAT%2Fenhancer-binding+protein-beta+is+necessary+for+the+integrity+of+inflammatory+responses+to+cigarette+smoke%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Lung epithelial CCAAT/enhancer-binding protein-beta is necessary for the integrity of inflammatory responses to cigarette smoke.</a> Am J Respir Crit Care Med. 184, 233-242 (2011).</li>
<li>Silverpil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+feedback+on+IL-23+exerted+by+IL-17A+during+pulmonary+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Innate+Immunity%22%5BJournal%5D)">Negative feedback on IL-23 exerted by IL-17A during pulmonary inflammation.</a> Innate Immunity. 19, 479-492 (2013).</li>
<li>Mercer, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteinase-Activated+Receptor-1%2C+CCL2+and+CCL7+Regulate+Acute+Neutrophilic+Lung+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Proteinase-Activated Receptor-1, CCL2 and CCL7 Regulate Acute Neutrophilic Lung Inflammation.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. , (2013).</li>
<li>Korkmaz, B., Horwitz, M. S., Jenne, D. E., Gauthier, F. Neutrophil Elastase, Proteinase 3, and Cathepsin G as Therapeutic Targets in Human Diseases. Pharmacological Reviews. 62, 726-759 (2010).</li>
<li>Bafadhel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+Exacerbations+of+COPD%3A+Identification+of+Biological+Clusters+and+Their+Biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Acute Exacerbations of COPD: Identification of Biological Clusters and Their Biomarkers.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. , 201104-200597 (2011).</li>
<li>Hurst, J. R., Perera, W. R., Wilkinson, T. M. A., Donaldson, G. C., Donaldson, G. C., Wedzicha, G. C. Systemic and Upper and Lower Airway Inflammation at Exacerbation of Chronic Obstructive Pulmonary. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHurst%2C+JR+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22">Am. J. Respir. Crit. Care Med</a>. 173, 71-78 (2006).</li>
<li>Rabe, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Strategy+for+the+Diagnosis%2C+Management%2C+and+Prevention+of+Chronic+Obstructive+Pulmonary+Disease%3A+GOLD+Executive+Summary%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Pulmonary Disease: GOLD Executive Summary.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 176, 532-555 (2007).</li>
</ol>

Abraham Roos 已从勃林格殷格翰获得讲师费用，从阿斯利康获得差旅资助&amp;D 和阿斯利康研究基金资助&amp;D. Magnus Nord 是阿斯利康公司的全职员工&amp;D 并获得了阿斯利康（AstraZeneca）的研究资助&amp;D. Johan Grunewald 和 Tove Berg 是一项由阿斯利康（AstraZeneca）资助的非相关研究项目的共同研究者&amp;D.

雾化的脂多糖（LPS）可在气道中引发炎症反应，其特征为上皮下黏膜层、传导性气道周围间隙以及肺泡腔内出现中性粒细胞浸润。此外，支气管肺泡灌洗液（BALF）中总蛋白含量升高，提示存在血浆渗漏，符合急性肺损伤的病理特征。由于LPS诱导的是无菌性炎症，该反应不依赖于适应性免疫应答，因此在模拟细菌感染的相关性方面存在一定局限性。然而，该技术可用于在排除适应性免疫应答干扰的情况下，解析炎症反应的具体机制。
尽管该方法简单且易于调整以回答不同的科学问题，但雾化器和管路的选择至关重要。使用不同于本文所述的进样口、雾化器和管路时，必须验证LPS的沉积情况及由此引发的中性粒细胞增多。此外，由于较不常见的小鼠品系对LPS的反应可能不同，应针对每种品系确定最佳LPS剂量。再者，气溶胶化LPS所引发的中性粒细胞炎症与经鼻内递送LPS所诱导的炎症程度相当，这一点已被其他研究者观察到12,13。虽然鼻内给药操作简便，但该方法需要使用麻醉剂，并且可能将鼻腔内的微生物群带入肺部，因为鼻腔并非无菌环境，且该技术需要较大体积的载体溶液。
<p c...

脂多糖（LPS）是革兰氏阴性菌细胞壁的组成成分1。LPS攻击是急性肺损伤的成熟研究模型，急性肺损伤是一种以急性中性粒细胞炎症和水肿为特征的综合征2。此外，肺部中性粒细胞增多也是慢性阻塞性肺疾病（COPD）的典型特征3，在人体中使用LPS攻击已被用于模拟COPD急性加重4。因此，LPS暴露的实验模型具有临床相关性，是研究人类病理机制的重要工具。
本文所述气溶胶化LPS肺部递送的目的是在传导气道和呼吸气道中引发中性粒细胞炎症反应，同时避免全身性影响。此前已有多种LPS激发技术的报道。静脉注射LPS是最常用的给药途径。尽管该方法操作简便，但其主要损伤靶点为血管内皮，随后因中性粒细胞迁移至肺组织而继发性破坏肺上皮。静脉给药还会诱发全身性炎症2，这可能使动物模型的临床表现复杂化。相比之下，气管内给药则未观察到全身性炎症反应。然而，该技术操作繁琐，需要使用麻醉剂并具备相当的操作经验5,6。此外，通过该途径给药时，LPS在肺部的沉积依赖于呼吸运动7。因此，为实施气管内给药所需的麻醉深度会影响肺部沉积效果，并可能导致气道内沉积量的不一致。相比之下，气溶胶化LPS的肺部递送所需培训极少，可轻松应用于大量动物，且个体间差异极小或无差异5,8。最近一项研究证实，就沉积效果而言，气溶胶递送优于气管内给药途径，并且在此模型中，更接近生理相关剂量的LPS即可诱导中性粒细胞炎症反应8。
既往研究表明，气溶胶化的Psuedomonas aeruginosa LPS刺激可在气道腔和肺实质（包括肺泡腔）引发显著的炎症反应9,10。该炎症以中性粒细胞占主导并伴有肺水肿，因此可用于研究急性肺损伤的发病机制，并进一步了解参与疾病病理过程的机制。

<table><tbody><tr><td>纯化的&lt;em&gt;Pseudomonas aeruginosa&lt;/em&gt; LPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>有害。建议进行纯化。也可使用从其他细菌中纯化的LPS。</td></tr><tr><td>Pari LC sprint star 雾化器</td><td>PARI Respiratory Equipment Inc.</td><td>023G1250</td><td></td></tr><tr><td>TSI 质量流量计 4040</td><td>TSI</td><td>4040</td><td>可使用供应商提供的替代产品。</td></tr><tr><td>Saint-Gobain 15.9 mm Tygon 管</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z685704</td><td>推荐品牌。</td></tr><tr><td>带可拆卸盖子的有机玻璃箱</td><td>定制</td><td>N/A</td><td>150 x 163 x 205 mm（侧面有一个2 mm的孔）。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>3M 半面罩可重复使用呼吸器</td><td>3M</td><td>7503</td><td>推荐品牌。</td></tr><tr><td>3M 高级颗粒过滤器 (P100)&amp;nbsp;</td><td>3M</td><td>2291</td><td>推荐品牌。</td></tr><tr><td>剪刀</td><td>VWR</td><td>233-1104</td><td>可使用偏好的剪刀。</td></tr><tr><td>镊子</td><td>VWR</td><td>232-1313</td><td>可使用偏好的镊子。</td></tr><tr><td>Intramedic PE50 聚乙烯管</td><td>BD</td><td>427411</td><td>推荐品牌。</td></tr><tr><td>Ethicon 2-0 Perma-hand 丝线</td><td>VWR</td><td>95056-992</td><td>推荐品牌。</td></tr><tr><td>26 &amp;frac12; 号针头</td><td></td><td></td><td>存在其他供应商。</td></tr><tr><td>1 ml BD 滑动接头注射器，非无菌</td><td><a href="http://catalog.bd.com/bdCat/viewProduct.doCustomer?productNumber=301025" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> BD</a></td><td>301205</td><td>存在其他供应商。</td></tr><tr><td>60 ml BD 鲁尔锁注射器，非无菌，聚丙烯材质</td><td>BD</td><td>301035</td><td>存在其他供应商。</td></tr><tr><td>Fluka 苏木精-伊红染色液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3972</td><td>存在其他供应商。</td></tr><tr><td>T&amp;uuml;rk's 溶液</td><td>Merck Millipore</td><td>109277</td><td></td></tr><tr><td>台式离心机</td><td></td><td></td><td>存在其他制造商。</td></tr><tr><td>Cytospin 4 细胞离心涂片机</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78300003</td><td>可使用其他离心机。</td></tr><tr><td>HEMA-3 stat pack 染色试剂盒</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-123-869</td><td>存在其他染色试剂盒。</td></tr><tr><td>中性缓冲福尔马林溶液，10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td>存在其他供应商。</td></tr></tbody></table>

使用气溶胶化脂多糖诱导肺部中性粒细胞增多的方法

A Method for Generating Pulmonary Neutrophilia Using Aerosolized Lipopolysaccharide

急性肺损伤（ALI）是一种以肺泡中性粒细胞浸润为特征的严重疾病，目前治疗手段有限且死亡率高。ALI 的实验模型对于加深我们对疾病发病机制的理解至关重要。来源于革兰氏阳性菌的脂多糖（LPS）可在小鼠气道和肺实质中诱导中性粒细胞炎症。然而，将 LPS 等化合物有效递送至肺部仍存在困难。本文所述方法通过雾化铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）LPS 对小鼠进行攻击，实现肺部递送。将溶解的 LPS 通过连接压缩空气的雾化器雾化，使小鼠在 Plexiglas 盒中暴露于持续流动的 LPS 气溶胶中 10 分钟，随后在气溶胶停止后继续停留 2 分钟以完成适应。之后进行气管插管，继之以支气管肺泡灌洗，并进行甲醛灌注，从而实现对无菌性肺部炎症的表征。雾化 LPS 可诱导以肺泡中性粒细胞增多为特征的肺部炎症，该现象可通过支气管肺泡灌洗和组织学评估检测到。该技术仅需少量设备、成本低廉，且对操作人员的培训和经验要求极低。因此，该暴露系统可在任何实验室常规开展，有助于进一步加深对肺部病理机制的理解。

气溶胶化铜绿假单胞菌脂多糖（P. aeruginosa LPS）攻击通常会在气道腔和肺泡腔内引发显著的炎症反应，其特征是在早期和晚期时间点均以中性粒细胞为主。
气溶胶化脂多糖诱导肺部中性粒细胞增多
C57BL/6by 和 BALB/c 小鼠暴露于气溶胶化的 P. aeruginosa 单独给予LPS或载体后，对支气管肺泡灌洗液（BALF）中的中性粒细胞进行计数。仅暴露于载体气溶胶的C57BL/6小鼠，其BALF中的总细胞数通常约为或低于200,000个细胞，细胞组成中95–100%为单核细胞，仅含少量淋巴细胞（0.5–5%），BALF中无中性粒细胞。图2A-C). 经气溶胶LPS攻击的小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）中总细胞数增加，通常 &gt;6小时后为50万个细胞。24小时后细胞浸润仍处于较高水平。LPS暴露后，支气管肺泡灌洗液（BALF）中的细胞谱转变为以中性粒细胞为主（占80–95%）。图2B和C).
<p cla...

我们介绍了一种通过雾化吸入脂多糖激发中性粒细胞性肺部炎症以模拟急性肺损伤的方法。此外，还描述了肺隔离、气管插管和支气管肺泡灌洗的基本外科技术。

急性肺损伤（ALI）是一种以肺泡中性粒细胞浸润为特征的严重疾病，治疗选择有限且死亡率高。实验模型……

本实验的总体目标是通过暴露于气溶胶化脂多糖（LPS）来诱导稳定且可重复的气道中性粒细胞增多。首先将悬浮于生理盐水中的LPS加入连接至暴露室的雾化器中，随后使小鼠暴露于气溶胶化的LPS。之后收集支气管肺泡灌洗液，并对灌洗液中的炎症细胞进行计数。最后，将肺组织进行固定，随后进行包埋、切片以及免疫组织化学分析。最终，可通过支气管肺泡灌洗液中的总细胞计数和分类计数来评估中性粒细胞向肺组织的募集情况。与现有的气管内滴注LPS等方法相比，该技术的主要优势在于气溶胶化LPS在肺内分布更为均匀、操作简便，且成功实施所需培训较少。为生成LPS气溶胶，需在正确佩戴个人防护装备（PPE）的条件下，在通风良好的二级生物安全柜内操作：首先将红色进气管插入雾化器，然后通过制造商提供的管路将雾化器连接至加压的室内空气源。接下来，使用空气过滤器将雾化器的出口连接至质量流量计，然后将质量流量计连接至电源。调节气流速率为每分钟5升，保持压力为1至2巴，随后移除质量流量计并断开气流。接着，将雾化器的出口连接至一个直径为15.9毫米的分叉管，该分叉管连接两个尺寸为150 mm × 163 mm × 205 mm、配有可拆卸盖子的有机玻璃箱。每个盒子的侧面（与进气口相对的一侧）应开一个5毫米的孔，以防止压力积聚。现在将最多五只小鼠放入每个盒子中，并盖上盖子。然后打开雾化器。向插入件中加入4至8毫升溶于生理盐水的LPS溶液，或仅加入生理盐水对照溶液，然后将进气口重新连接至气源。使气溶胶持续流入密闭的聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）箱中，同时持续观察动物状态，并确保在气溶胶化过程中气源始终牢固连接于雾化器的进气口。10分钟后，断开气源，将动物继续留在PMMA箱中静置2分钟。然后打开盖子，让气溶胶充分扩散，并在实验终点将小鼠放回笼中。对每只动物依次操作：首先用剪刀沿腹背方向做一条从前到后的切口，暴露胸腔；接着抓住胸骨前端抬起肋骨，于最腹侧位置刺破膈肌，注意避免刺入任何肺组织。然后沿前后方向进行两处切割，使切口在下颌下方相交，打开肋骨笼。打开肋骨笼后，用镊子轻轻将其分开，并在喉部下方切断气管。现在提起气管，切断连接肺叶与胸腔的韧带。然后轻柔地将肺和气管从脂肪组织和心脏组织中向上提起并分离，放置在一片注射器包装纸上。接着，将一根0.965毫米的聚乙烯管插入气管，并用丝线固定。同时用丝线结扎多叶肺组织，然后将一根23号针头插入聚乙烯管中。然后，为了收集支气管肺泡灌洗液，使用1毫升注射器将250微升冰上预冷的无菌PBS缓慢注入单个肺叶中，轻轻敲击肺组织，并在工作台表面缓慢来回轻拍30次，再小心地将液体重新吸入注射器中，收集至离心管内。重复上述操作，加入200微升新鲜PBS，将收集到的支气管肺泡灌洗液置于冰上，用于后续分析。为了固定肺组织以进行组织学分析，取出多叶肺组织并迅速在干冰上冷冻。将肺叶置于零下80摄氏度保存。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

采用雾化脂多糖一种产生肺中性粒细胞增多

我们展示了如何使用双光子显微镜观察感染肺组织中中性粒细胞的动态行为，包括其中性粒细胞吞噬病原体或形成中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的过程。...

利用双光子显微镜直接观察感染肺组织中中性粒细胞的吞噬作用及中性粒细胞胞外诱捕网（NET）的形成

关键词：中性粒细胞，吞噬作用，中性粒细胞胞外诱捕网（NET），双光子显微镜，肺部感染，活体成像

来源：Yuan, Z., et al. 脂多糖诱导的脓毒症肺损伤中的支气管肺泡灌洗外泌体。 J. Vis. Exp.

小鼠脂多糖诱导急性肺损伤用于外泌体与免疫分析

本视频介绍了在小鼠皮下组织中建立气囊并收集脂多糖刺激后炎性渗出液的操作流程 体内...

一种用于脂多糖诱导炎症渗出液采集的气囊小鼠模型

宿主对病原体感染的免疫反应是一个受到严密调控的过程。利用小鼠脂多糖肺暴露模型，可对与疾病发病机制相关的复杂机制进行高分辨率评估。...

利用经口咽气管内给予PAMP及支气管肺泡灌洗评估小鼠宿主免疫反应

本研究展示了使用舌下免疫疗法可增强小鼠肺部的先天免疫反应，并对急性肺炎链球菌性肺炎提供保护作用的便利性。...

舌下免疫疗法作为诱导抵抗急性呼吸道感染的替代方法

文献中已描述了多种在小鼠中建立细菌性肺炎模型的方法。本文介绍一种非侵入性、低成本且快速的方法，通过将细菌接种物滴加至口咽部，使其吸入（即，经气道吸入）以诱导肺炎。同时详细阐述了用于评估肺部固有免疫反应的后续检测方法。...

一种用于小鼠实验性细菌性肺炎诱导与表型分析的非侵入性且技术简便的方法

经腹腔注射LPS的小鼠在支气管肺泡灌洗（BAL）液中分泌含有miRNA的外泌体。利用共培养系统，我们发现BAL液中释放的外泌体可破坏支气管上皮细胞中紧密连接蛋白的表达，并增加促炎性细胞因子的表达，从而加剧肺损伤。...

脂多糖诱导的脓毒性肺损伤中支气管肺泡灌洗外泌体

本文介绍了一种通过直接气管内滴注脂多糖在小鼠中诱导急性肺损伤的逐步操作方法，以及对血液样本、支气管肺泡灌洗液和肺组织进行流式细胞术分析的方法。该方法具有侵入性小、操作简便、可重复性好以及可滴定疾病严重程度等优点。...

通过直接气管内滴注脂多糖在小鼠中诱导急性肺损伤

经臭氧与细菌内毒素联合暴露的小鼠表现出广泛的细胞死亡，包括中性粒细胞的死亡。我们观察到细胞发生多种适应性变化，例如细胞骨架片状伪足结构的破坏、支气管肺泡灌洗液中复合体V...

可视化臭氧与脂多糖联合诱导的小鼠急性肺损伤过程中的肺细胞适应性变化

此处，我们提出一种经气管递送脂多糖（LPS）的实验方案 通过 无创经口咽气管插管。该方法可最大限度地减少手术操作对动物造成的创伤，并能准确地将LPS输送至气管，进而进入肺部。...

小鼠非侵入性气管内脂多糖滴注

在本研究中，采用一种非侵入性气管内滴注技术，通过基本的喉镜确保将脂多糖（LPS）精确递送至肺部，从而在大鼠中建立急性肺损伤（ALI）模型。LPS被滴注入气管 通过 使用喉镜插入气管插管。在多个时间点评估肺损伤程度。...

非侵入性经气管给予脂多糖诱导啮齿类动物急性肺损伤

了解雾化脂多糖诱导肺中性粒细胞增多的实验方法，通过暴露舱使小鼠吸入LPS气溶胶，结合支气管肺泡灌洗和免疫组织化学分析评估肺部炎症反应。该技术操作简便、分布均匀，适用于急性肺损伤研究。

使用气溶胶化脂多糖诱导肺部中性粒细胞增多的方法

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