一种用于探测细胞变形能力的微流控技术

以下实验的总体目标是利用一种简单的基于微流控的检测方法，研究不同类型细胞的变形能力。该目标通过制备聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流控装置来实现，用于探测细胞通过一系列微米级狭窄通道所需的时间尺度。随后，采用压力驱动流动将细胞推过微流控通道，从而检测单个细胞的变形过程及其随时间依赖的松弛行为。接下来，运行自动图像分析程序，处理视频数据并获得细胞通过时间的直方图。

结果表明，不同细胞类型在通过一系列收缩结构时，其细胞变形能力会因细胞类型的不同而存在差异。与原子力显微镜或微管吸吮等现有技术相比，该技术的主要优势在于微流控装置能够实现高通量操作。尽管其他微流控装置也可用于检测细胞变形能力。

我们设计了该装置，使细胞依次通过一系列收缩区域，这种结构在生理环境中较为常见，例如肺毛细血管床。首先，通过选择收缩阵列通道的宽度约为细胞平均直径的30%至50%，通道高度至少为细胞直径的50%，来设计微流控装置。在入口端加入过滤器，以去除碎片并分散细胞团簇。

在开始实验之前，使用光刻微加工的标准技术制备装置母版。使用轮廓仪验证图案特征的高度。接下来，利用压缩空气罐以及一系列空气调压器和接头，连接并调试用于压力驱动流动的气源。

首先安装一个空气供应罐和手动调节器。然后将一个电子控制的压力调节器与手动调节器串联连接。使用在 LabVIEW 中编写的简单代码输入所需的压力值。

电-气转换器利用内部反馈回路调节阀门出口压力，使其与微流控装置两端的设定压力相匹配。通过使用标准流式细胞仪管和一个可在管口形成密封的加工盖帽组装成细胞悬液腔室，构建一个加压腔室，以驱动细胞悬液流动。压力腔室盖帽包含两个孔口：一个连接至压缩空气罐的进气口，以及一个使细胞从加压腔室流入装置的出气口。

接下来，设置一台配备相机的倒置显微镜，该相机的采集速率至少为每秒100帧。为了捕获细胞流经收缩阵列时的图像，需在磷酸盐缓冲液（PBS）中配制储备用表面活性剂溶液，因为在细胞培养液中加入少量表面活性剂有助于减少细胞在PDMS通道壁上的黏附。为了制备带有微流控通道的PDMS块，将1克固化剂加入10克PDMS基质中，并充分混合。

将混合物倒入装置上。在真空干燥器中进行脱气处理，施加真空直至截留的气泡消失，或持续约10至20分钟。此过程结束后，在空气与PDMS界面处可能仍存在少量气泡，此现象属正常。

这些气泡通常会在烘烤过程中消散。待装置冷却后，在65摄氏度下将脱气装置烘烤四小时。从母模中取出微流控装置。

首先轻轻掀开装置的一个角落。与直接将PDMS模块垂直抬起相比，缓慢而轻柔地剥离可减少对PDMS和模具的应力。使用剃刀片从PDMS模块上切割出单独的微流控装置，并将其从模具上取下。在PDMS装置上打孔，以形成连接端口，实现管路与微通道之间的通路。使用活检打孔器从通道侧穿透至装置外侧，完成打孔。

用异丙醇冲洗PDMS装置，以去除灰尘和残留的PDMS碎屑。使用挤压瓶将纯净的异丙醇稳定地通过打孔处冲洗，确保孔洞中无残留物。用过滤空气吹干。

用甲醇冲洗玻璃基底以进行清洁。随后用过滤空气吹干，并置于200摄氏度的加热板上加热5至10分钟，以确保在等离子处理前玻璃完全洁净且干燥。如文本方案中所述，在显微镜下检查微流控装置。

使用低倍物镜确保通道未发生塌陷或破损，并确认进样口和出样口孔洞均直接与微流控芯片通道相连。将细胞悬液置于流式细胞仪管中，连接至压力帽，再将管路连接到微流控装置，调节压力至约14至21千帕，冲洗直至细胞悬液从管路末端流出。随后，将装置放置于平坦表面，将管路插入装置的进样口。

由于盖玻片粘附在PDMS装置的底部，较为脆弱。将含有细胞悬液的管路尖端插入装置的入口。然后将一段管路插入出口端口，并将其引导至一个空管中用于收集废液，例如固定在显微镜载物台侧面的空Falcon管。

缓慢增加压力至约 28 千帕，或直至细胞流经通道。调整装置位置，使多个通道位于视野范围内，并与屏幕底部垂直。开始数据分析时，打开主脚本 m 文件并运行程序。

从弹出的 Windows 资源管理器窗口中选择要分析的第一个视频。指定所选视频的帧率，然后按回车键。此时将出现一个图形界面，提示用户选择一个矩形裁剪区域。

对于第一个视频，选择一个从左到右涵盖所有通道的窗口，并使其位于通道阵列第一个膨大部位的上方并与之相交。在图像的顶部和底部，从裁剪后的图像中选择收缩区域。该算法将显示每个视频前50帧的细胞分割结果。

密切观察左上角的图像，以确定算法是否准确定位了细胞。经过处理的图像会叠加在源视频上。为展示已识别细胞的位置，请从 Windows 资源管理器窗口中选择下一个要处理的视频。

该算法将重复执行。对于所选的每个视频，选择取消。一旦所有目标视频均已通过 Windows 资源管理器窗口添加完毕，以指示视频列表已完整，即可获得 HL 60 细胞及中性粒细胞型 HL 60 细胞的典型实验结果，结果显示单个细胞通过一系列收缩结构的通过时间的时间尺度。

在一系列七个七微米收缩处，分别测量单个细胞群体通过每个收缩处所需的时间。在28千帕的驱动压力下，HL 60细胞暂时阻塞第一个收缩处的中位时间为9.3毫秒，随后逐步通过后续收缩处。相比之下，中性粒细胞型HL 60细胞在通过前仅阻塞第一个收缩处4.3毫秒。

细胞通过第一个收缩段后，会以更快的速度通过第二至第七个收缩段，其中HL-60细胞的中位通过时间为4.0毫秒，中性粒细胞样细胞为3.3毫秒。通过比较不同细胞群体的通过时间，可以揭示细胞变形能力的差异。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用简单的微流控检测方法来测量不同类型细胞的变形能力。

此处采用压力驱动流动使细胞通过微流控通道，从而能够检测单个细胞的变形与复原过程。