活体神经末梢中内体动态的四维荧光成像可视化

本实验的总体目标是随时间推移在三维空间中准确成像内体，即实现四维成像。首先通过解剖蛇的肌肉并将组织置于成像培养皿中来完成组织准备。第二步是使用活体染料对组织进行染色，以诱导内体形成。

接下来，对一个或多个神经肌肉接头进行四维成像。最后一步是仔细分析数据，以表征大胞饮体的行为。最终，可通过四维荧光成像展示突触前区域中胞内体随时间的存在状态及其运动情况。

该技术的主要优势在于蛇的腹肌仅由单层肌纤维构成，因此可利用标准的落射荧光显微镜获得高质量的图像。本方案将采用游蛇的组织样本。爬行类组织应保存在低温条件下，以延长其生理活性并减少细菌污染。进行溶酶体活体染料染色时，需将染料以1比5,000的比例溶解于冰冷的爬行类林格溶液中。

为了达到 0.2 微摩尔的终浓度，将染料加入组织中，并在 4 摄氏度下孵育 15 分钟。15 分钟后，用冷林格液将组织洗涤数次，适用于所有 FM 1-43 染色。染色前，先将样品置于带有磁性固定针的成像培养皿中。

本视频仅演示使用氯化钾刺激的FM 1-43染色方法。将染料按1:500比例稀释于高浓度氯化钾林格液中，得到终浓度为7 µM的染色液，加入组织中，随后在4 °C条件下孵育，时间不超过30至60秒。随后，用冷林格液快速洗涤三次，每次约一分钟。

所有组织在使用冷林格液染色并清洗后，应尽快进行成像。若使用倒置显微镜，请采用底部带有圆形薄层盖玻片的成像腔室。通常情况下，成像腔室应具有直径为25毫米的薄层不锈钢底部。

将一号厚度的玻璃盖玻片置于中央，以准备成像。使用磁性固定针调整方向，使肌肉尽可能位于成像培养皿的中心位置，并尽可能平展。用少量任氏液覆盖标本。

安装培养皿，尽可能将其置于载物台中心位置。选择合适的物镜以获得尽可能高的三维分辨率。本演示中的所有实验均使用63倍水镜。

开始此操作时，在 SlideBook 5.0 中打开成像窗口。此处的多个菜单以标签页形式呈现。使用第二个标签页 Z，选择 63 倍水镜，并设置 Z 轴步进间隔。

在此示例中，活体成像采用 1.5 微米的 Z 轴步进。选择延时成像的帧率。最佳帧率应恰好足以清晰分辨随时间发生的变化，例如运动相互作用或融合事件。

例如，总共五分钟的时间间隔内，以32秒为间隔采集10个时间点。接下来，在手动将终端实时聚焦至目标焦点顶部的同时，显示总的景深，然后略微向上移动焦点位置，选择“设置顶部”。

缓慢调节焦距，使样本逐渐失焦。此时，显示的焦平面层数和总移动距离值将反映采集窗口中所选的景深范围。选择已使用的顶部和底部位置单选按钮，以传递刚刚选定的参数。开始图像采集。

完成特定样本的所有活体成像。保留所有原始数据文件，因为数字存储通常不是问题。即使使用快速的个人计算机或工作站，数据处理所需时间也相当可观。

因此，裁剪图像以获取感兴趣区域时，应确保在整个成像过程中，整个感兴趣区域始终位于裁剪窗口内。课程 D 可能涉及使用适当的软件和正确的点扩散函数对图像堆栈进行处理，以确认分辨率得到提高，并且去卷积算法未产生任何伪影。使用插值算法扩展 Z 轴。

建议表观分辨率从实际的1.5微米像平面间距扩展至表观的0.25微米间距，即六倍扩增。可根据需要进行对比度亮度调节、噪声滤波、光漂白以及其他常规图像处理调整。

图像处理标准规定，对于大多数科学研究工作，应对同一图像序列内以及不同时间点的所有图像应用相同的校正方法。应评估特定调整对所有图像的影响。尝试使用各种滤波和图像增强技术。

例如，使用滤波可以增强小结构相对于背景的对比度。在移动窗口中，中心像素的亮度被增强，而周围区域的亮度则被降低。需要注意的是，某些滤波方法结合使用时效果不佳。

如果样本随时间发生显著移动，则应用漂移校正。即使添加了抑制动作电位和突触电位的药物，这种移动在活体肌肉中仍很常见。像素配准算法可对齐时间序列图像，从而减少此类运动，但通常无法完全消除。

本研究采用蛇类神经肌肉接头的四维活体成像技术，以确定大胞饮体或内吞小泡（me）是否向质膜移动并迅速消失，提示其数量减少可能是由于部分囊泡进入胞质所致。数据以三维体视图形式展示，共包含六个时间点，帧间隔为60秒。为说明单个突触小结的Z轴深度，可观察到一个me在数帧内逐渐远离由红色虚线指示的Y轴，并在第五和第六时间点之间消失；其消失所需时间短于帧间隔，这一现象与消失前发生胞吐作用的结果一致。

ME 似乎位于蝙蝠血浆膜上。接下来以较低放大倍数将相同的原始数据集显示为视频。在围绕 Y 轴进行的每一步 24 个 3D 旋转的开始处，序列会短暂暂停，以引起注意即将消失的 ME，该位置由红色箭头指示。

请注意，当ME接近按钮边缘时，在所有观察视角下均可见其消失且不再出现。由于Z轴分辨率低于XY轴分辨率，ME的形状会因观察视角的不同而显得伸长或缩短。电子显微镜研究表明，运动神经末梢中的内体尺寸较小，接近光的衍射极限。

因此，在光学水平上，这些内体的融合无法与紧密的空间关联完全区分开来。本研究中，Mees 用 FM 1-43 标记（绿色），酸性内体（AEs）则用溶酶体示踪染料标记（红色）。来自四维成像视频某一时间点的数据以三维体视图形式展示，包含三个不同方向的视角。

上方的图一至图三显示了从XY平面上方观察的传统视图。中间的图四至图六显示了垂直于XY平面并沿大红色箭头方向观察的视图。下方的图七至图九显示了同时垂直于上述两种视图、并沿大蓝色箭头方向观察的视图。

一个 me 由绿色箭头标记，两个 AE 由红色箭头标记。在四个 D 图像记录中偶尔观察到在两种颜色下均发出荧光而呈现黄色的结构。在此示例中，含有两种染料的内体在第 3、第 6 和第 9 面板中由黄色箭头标记。

在所有三个正交投影中，红色与绿色的重叠均完全一致，表明可能存在融合的MEAE。该视频展示了同一数据集以每秒一帧的速度绕Y轴旋转的配置。从所有视角观察，该可能的融合MEAE始终保持黄色。

数字去卷积是一种用于提高三维以及四维图像分辨率的有效工具。此处展示了原始数据与去卷积后数据的对比。对于在刺激过程中用FM 1-43染色的一个典型蛇类神经末梢而言，一旦掌握该技术，若操作得当，可在30至60分钟内完成。

完成此操作后，可进一步采用其他方法（如免疫组织化学）来回答更多问题，例如巨噬细胞内体与突触前标记物的共定位情况。