内吞体动力学在生活神经末梢与四维荧光成像可视化

该程序的总体目标是随着时间的推移在三维空间或四维空间中准确成像内体。这是通过首先解剖蛇肌并将组织排列在成像皿中来实现的。第二步是用活性染料对组织进行染色，以刺激内体形成。

接下来，对一个或多个神经肌肉接头的准备物进行四个维度成像。最后一步是仔细的数据分析，以表征大内体的行为。最终，突触前空间内内体的存在和移动可以通过四维荧光成像来证明

该技术的主要优点是蛇腹肌只有一根纤维厚，这允许使用标准 epi 荧光显微镜生成高质量的图像，该方案将使用来自吊袜带蛇的组织制剂。爬行动物组织应保存在低温下，这样它可以更长时间地保持生理状态，并减少细菌污染。对于溶酶体活性染料染色，将染料溶解在冷爬行动物林格溶液中 1 至 5， 000

要获得 0.2 微摩尔的最终浓度，请将染料添加到组织中，并在 4 摄氏度下孵育 15 分钟。15 分钟后，用冷振铃器清洗组织数次，以进行所有 FM 1 43 染色。染色前，将样品预装在带有磁性针的成像皿中。

出于本视频的目的，将仅演示使用氯化钾刺激的 FM 1 43 染色。将染料在高氯化钾环状液中稀释 1 至 500 以获得最终浓度为 7 微摩尔的染料添加到组织中，然后将组织在 4 摄氏度下孵育最多 30 至 60 秒。随后，用冷铃声快速洗涤 3 次，每次漂洗约 1 分钟。

所有组织在染色并用冷振铃液洗涤后应尽快成像。如果使用倒置显微镜，请使用底部包含薄圆盖玻片的成像室。通常，成像室应具有直径为 25 毫米的薄不锈钢底部。

在中心放置一号厚度的玻璃盖玻片，以配置成像准备工作。使用磁针定位它，使肌肉在成像皿中尽可能居中并尽可能平放。用少量林格溶液覆盖制剂。

安装培养皿，使其尽可能靠近舞台中心。选择合适的物镜以获得尽可能高的 3D 分辨率。本演示中的所有实验都将使用 63 x 水物镜。

要开始此过程，请在 Slide Book 5.0 中打开成像窗口。选项卡中包含多个菜单。使用第二个选项卡 Z 选择 63 x water 目标，设置 Z 堆栈间隔。

在此示例中，1.5 微米的 Z 步长用于实时成像。选择延时帧速率。最佳速率是指足以平滑解决随时间变化的速率，例如运动交互或融合事件。

例如，第 32 个间隔的 10 个时间点，总时间间隔为 5 分钟。接下来，选择总景深，同时实时显示手动聚焦到感兴趣焦点顶部的终端，然后稍微高于它。选择 set top。

慢慢聚焦整个样品，直到所有东西都失焦。同样，显示的平面数和总行程值将指示在捕获窗口中选择的景深。选择已使用的 top 和 bottom positions 单选按钮，以传输刚刚选择的参数For image capture， start image acquisition。

完成特定准备的所有实时成像。保留所有原始数据文件，而数字存储通常不是问题。即使使用快速的个人计算机或工作站，处理时间也很长。

因此，将图像裁剪到感兴趣区域可确保整个感兴趣区域在整个时间内都位于裁剪的窗口中。课程 D 可以涉及使用适当软件和正确的点扩散函数的图像堆栈，确认分辨率得到提高，并且反卷积算法没有产生伪影。使用插值算法扩展 Z 轴。

表观分辨率，建议从实际的 1.5 微米图像平面分离扩展到表观 0.25 微米的分离 6 倍。执行对比度亮度、杂色过滤、照片漂白和其他典型的图像处理调整。如果需要。

图像处理标准规定，对于大多数科学工作，将相同的校正应用于堆栈内和不同时间点的所有图像是合适的。应在所有图像中评估特定调整的结果。尝试各种筛选和图像增强技术。

例如，lelos 和过滤可用于增加背景上方小结构的对比度。运行窗口中心的像素亮度增强，而周围区域的亮度降低。请注意，某些筛选方法组合使用效果不佳。

如果准备工作随着时间的推移有很大的变动，则应用漂移校正。这种运动在活体肌肉中很常见，即使添加了抑制动作电位和突触电位的药物也是如此。像素配准算法对齐延时图像，可以减少但通常不会完全消除此类运动。

在这项研究中，使用蛇神经肌肉末梢的 4 D 实时成像来确定大内体或 me 是否向质膜移动并迅速消失，这表明它们的数量减少，因为它们中的一些进入细胞。数据在 6 个时间点显示为 3D 卷视图，帧间隔为 60 秒。为了说明单个 buton 的 Z 深度，可以观察到一个 me 在几个帧内从红色虚线指示的 Y 轴上移开，然后在时间点 5 和 6 之间消失，消失所需的时间小于帧间隔与消失前的胞吐作用一致。

ME 似乎位于棒状质膜上。相同的原始数据集接下来显示为放大倍数较低的电影。在绕 Y 轴的每 24 个 3D 旋转步骤开始时，该序列会短暂暂停，以引起人们对红色箭头指示的即将消失的 me 的注意。

请注意，ME 是可见的，接近 buton 的边缘会消失，并且不会在所有查看视角中返回。由于 Z 轴分辨率低于 XY 分辨率，因此 ME 的形状似乎会根据查看视角而变长和变短。电子显微镜研究表明，运动末梢中的内体在接近光的衍射极限时体积较小。

因此，这些内体的融合不能与光水平上的紧密空间关联绝对区分开来。在这项研究中，Mees 用绿色表示的 FM 1 43 标记，酸性内体或 AE 用溶酶体标记。来自四维电影的一个时间点的红色数据中指示的活体染料在三个方向上显示为 3D 体积视图。

顶部面板 1 到 3 显示了从 XY 平面上方的常规视图。中间面板 4 到 6 显示了垂直于 XY 平面和红色大箭头方向的视图。底部面板 7 到 9 显示了一个视图，该视图沿蓝色大箭头的方向与上面的两个视图相互垂直。

一个 me 用绿色箭头标记，两个 AE 用红色箭头标记。在两种颜色中都发出荧光，呈黄色的结构偶尔会出现在 4 个 D 图像记录中。在这个例子中，包含两种染料的内体在第 3、6 和 9 组中用黄色箭头标记。

在所有三个正交投影中，红色和绿色的重叠都同样完整，表明假定的融合 em me ae。此影片显示配置为以每秒一帧的速度在 Y 轴上旋转的相同数据集。推定的熔融 MEAE 从各个角度来看都保持黄色。

数字反卷积是提高 3D 和 4D 图像分辨率的有用工具。此处显示了原始数据和下放数据之间的比较。对于一种典型的蛇神经末梢，在用 FM 1 43 刺激期间染色 一旦掌握，如果作得当，这项技术可以在 30 到 60 分钟内完成。

在此程序之后，可以执行其他方法，例如免疫组化，以回答其他问题，例如大内体与突触前标志物的共定位。