幼年斑马鱼脊髓横断术

本实验的总体目标是通过一种相对高通量且可重复的方法，在最大化存活率的同时，确保对斑马鱼幼体实现完全的脊髓横断。该目标的实现首先需要交配具有适当基因型的成年鱼，并根据需要进行筛选。第二步是将胚胎培育至受精后五天。

接下来，使用斜面显微注射移液管进行横切操作。最后，将受伤的鱼置于含抗生素的培养基中恢复，直至实验结束。最终，通过免疫荧光显微镜观察神经前体细胞对损伤的反应。

与 Becker 实验室和 fetcher 实验室开创的现有方法相比，该技术的主要优势包括可研究的动物数量更多、恢复时间更短，以及能够使用在成年斑马鱼中通常无法获得的遗传工具。该方法有助于回答再生领域中的关键问题，例如神经前体细胞对损伤的反应。首先开始准备，使用 60 毫米培养皿和 to cell guard 180 4 硅胶弹性体试剂盒制作手术板。

按照制造商的说明操作。将培养皿填充至不超过一半的容量，使其聚合。然后将培养皿盖好，于室温下储存。

接下来，在解剖显微镜下使用与制备显微注射针相同的参数，通过在微电极拉制仪中加热并牵拉薄壁硼硅酸盐毛细管来制备微移液管。使用镊子将微移液管尖端折断至直径约为 200 微米。然后先用微型磨具将断裂边缘研磨成 35 度斜面，待研磨噪音停止后，再进行第二次研磨，形成 25 度斜面。

在解剖镜下检查，确保尖端锋利且光滑。若尖端过宽，容易划伤背主动脉，导致较高的死亡率；而尖端过窄则容易从皮肤上滑脱，无法有效切割组织。正确拉制的微细移液管应在手术前七天存放于培养皿中的少量黏土上。

设置雄性和雌性斑马鱼的交配缸。在光照开启后三小时的次日早晨收集受精胚胎，以确保获得最大产量。

若使用具有混合基因型的转基因报告基因品系，每皿放置100枚胚胎，并将培养皿置于28.5°C条件下孵育。若使用报告基因品系，于受精后48小时对胚胎进行荧光表达筛选。

将荧光胚胎置于28.5摄氏度下培养，直至幼鱼发育至受精后五天。通过在细胞筛上加入E2培养基及每升10毫克的硫酸庆大霉素和Tricaine，制备手术用培养皿。此外，向一个100毫米的培养皿中加入25毫升E2培养基和硫酸庆大霉素，制备恢复用培养皿。

下一步是通过将三根棉签用胶带绑在一起，制备一个手术刀手柄。这样可形成一个具有三个凹槽的三角形工具。接着，将已准备好的微量移液器通过胶带固定在其中一个凹槽中，完成手术刀的组装，然后将该微量移液器放置一旁备用。

每次对25条幼鱼进行手术时，首先将其麻醉。使用三卡因麻醉时，当幼鱼不再表现出触碰反应即表示麻醉充分。将幼鱼转移至手术板，并将手术板置于解剖显微镜下。

在最大放大倍数下，旋转一条幼虫，使其侧躺，背部朝向持解剖刀的手。将镊子放置在细胞保护结构上，倾斜地跨过幼虫的宽度，并将玻璃解剖刀抵在镊子的一个臂上作为支撑。

在幼虫肛门孔水平处，沿其背外侧面进行切割，注意不要超过脊索的腹侧边缘。然后扭转手术刀以切断脊髓。

所需的扭转角度通常远小于90度。对剩余的幼虫重复脊髓横断操作。完成一批幼虫的手术后，使用移液管和移液泵将受伤的动物转移至恢复培养板中。

为清除麻醉剂，在转移过程中务必首先收集幼虫的头部或尾部。在麻醉效果消退后，避免弯曲幼虫而对损伤部位造成应力。将受伤的幼虫从恢复板转移至含有25毫升E2培养基和硫酸庆大霉素的100毫米培养皿中，每皿接种密度为25只幼虫。

然后将它们放入28.5°C的培养箱中，直至伤口愈合。每天检查培养皿，移除任何生病或死亡的个体。

在培养基中可见淡水原生动物群落之前，请勿更换培养基。更换培养基时，不要将鱼类转移到新的培养皿中，而是尽可能吸除原有培养基，并用新的培养基重新充满同一培养皿。

根据需要重复更换培养基以减少共栖生物的数量。每天用少量粉末状幼体饲料喂养幼虫。此处显示的是脊髓完全横断后一天的斑马鱼。

损伤后，所有神经元均表达GFP，黄色箭头指示损伤部位。此处显示的是一条脊髓完全横断的斑马鱼，在损伤后三天的图像。该固定的UCD标记斑马鱼显示其脊髓完全横断。

黄色箭头再次标示出损伤部位。与此相反，沿脊髓腹侧边缘连续的神经元标记区域。在损伤后三天固定的斑马鱼中，这表明为不完全横断。

一旦掌握，每小时可处理 300 条幼虫。