在啮齿动物中枢神经系统的体内光遗传学刺激

该程序的总体目标是在清醒、自由移动的动物中成功对啮齿动物中枢神经系统进行体内光遗传学刺激。这是通过首先设置和配置适当的激光系统来执行光遗传学刺激来实现的。接下来，设置与行为测试兼容的光纤，将激光输送到植入的光纤并进入表达 Opin 的感兴趣大脑区域。

然后将动物拴在激光系统上进行光遗传学刺激，并放入行为测试设备中。最后，实验者在动物执行行为任务时提供定义的光刺激参数以打开或关闭神经元。最终，在体内，光遗传学刺激用于允许实时控制清醒、行为动物的确定神经元或神经回路群，以确定它们在给定感兴趣行为中的功能作用。

与现有方法相比，该技术的主要优点是它允许实时控制清醒时遗传和空间定义的神经元群，行为动物具有将神经活动模式与复杂行为状态联系起来所需的时间分辨率。该协议涉及使用三类 B 激光器，并要求遵循适当的培训和安全指南。在根据文本协议设置激光设备后，必须始终佩戴安全护目镜，在对准程序存在特别高的风险时，首先将激光器背面的开关设置为电流和 TTL 为晶体管晶体管逻辑模式，以在驱动器正面进行恒定照明，从而对内部蓝色激光器进行非接触式激光耦合， 确保 Power 旋钮设置为零。

然后先打开驱动器，然后打开激光键来打开激光。为确保眼睛安全，请缓慢调整电源旋钮，使其发射大约 1 毫瓦的激光。然后等待 10 到 15 分钟让激光预热。

接下来，将光缆测试仪直接连接到耦合器跳线的自由端并打开电缆测试仪。然后调整耦合器的角度，使红色光束直接向二向色镜的中心传播。电缆测试仪发出的红光的光束路径是入射激光耦合到激光器中所需遵循的确切路径。

要执行航向对齐，请使用运动镜上的横向和水平旋钮将激光束引导到耦合器中。如果此时耦合器连接的跳线没有发出蓝光，请不要担心。现在将一张半透明纸直接放在二向色镜前，二向色镜和耦合器之间。

在这张纸的同一侧，激光器和电缆测试仪会分别出现一个蓝点和一个红点。通过仔细调整横向和水平旋钮以使红点的中心与蓝点对齐，对第一个转向镜进行微调。将纸张向后移向耦合器，使其位于耦合器的正前方，然后调整第二个二向色镜上的旋钮，使激光束与红色光束对齐。

继续对两个镜子进行微调，直到蓝色和红色光束的中心完全对齐。Coline，从耦合器线上拆下电缆测试仪。现在应允许激光从耦合器跳线的末端进入。

要确定耦合效率，请使用光功率计将进入耦合器的光功率与从光纤端发出的光功率进行比较。在保持二向色镜的位置的情况下，大于 80% 的耦合效率被认为是非常好的。使用两个转向镜对外部黄色激光器，并按照刚刚演示的对准程序耦合黄色激光器以设置用于刺激单个鼠标的光纤。

首先使用直接连接到试验板的 F-C-F-C-L 支架适配器将耦合器跳线连接到粗护套跳线。将换向器旋转接头连接到粗护套跳线的自由端。然后将动物跳线连接到换向器。

将连接分体式套管连接到动物跳线的自由金属野性端，而无需将套管完全向上。野猪留下约 0.5 厘米的袖套暴露在外，因为这是连接到通过 BNC 电缆固定在动物身上的光纤的东西。将蓝色激光驱动器连接到脉冲发生器并打开脉冲发生器。

现在戴上适当的安全眼镜。然后在确保驱动器正面的电源旋钮设置为零后，先打开驱动器打开激光器，然后将激光器设置为 TT L 正模式的激光键打开激光器。慢慢调整激光器前面的旋钮，并使用光功率计设置从动物跳线尖端发射的 5 到 10 毫瓦的光功率。

有关此设置的更多详细信息，请参阅文本协议。将蓝色激光切换到模拟模式进行体内刺激，并等待 10 到 15 分钟让激光预热。接下来，轻轻地抑制鼠标并将动物跳线上的分体套管连接到慢性植入纤维上。

确保两根光纤的末端 通过使用连接套管上的裂口作为窗口来可视化两者之间的直接接触，从而相互进行物理接触。在行为测试开始之前，让鼠标恢复几分钟。然后将动物放入行为测试设备中，确保连接器线没有障碍。

使用脉冲发生器以预定频率脉冲蓝色激光，这将激活所选选项。完成实验后，组织学确认病毒和纤维的位置，如随附文本协议中所述，以准确解释行为结果。在显微镜下，检查视蛋白表达和纤维植入物的部位，并根据所选坐标目视确认病毒注射和植入物的适当位置。

在这个通过体内光遗传学刺激获得的行为结果示例中，用稳定的阶跃函数 OPSIN 或 EYFP 作为受控病毒转导酪氨酸羟化酶乳膏小鼠腹侧区域的多巴胺神经元或 VTA，并长期植入纤维植入物。同时刺激小鼠组并记录一小时的运动行为，如此处所示。对左侧的 ops 和转导小鼠的重复刺激导致在整个刺激过程中持续存在的多动表型。

虽然在行为测试后右侧对照小鼠中没有观察到运动行为的变化，但进行了免疫组化以验证病毒对 VTA 多巴胺神经元的准确靶向，并且一旦掌握，纤维位置就被目视确认，如图所示。该技术可用于纵任何给定感兴趣大脑区域中的神经活动，并结合各种行为测试作为神经回路调制的功能读数。