Name: 在小鼠模型自发转移性肾细胞癌（MRCC）肾切除 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: 学习在小鼠模型中建立自发性转移性肾细胞癌的标准化方案，通过原位肾肿瘤细胞植入和肾切除术模拟临床疾病进程。该方法可用于评估实验性治疗药物的疗效，为肾癌研究提供可靠的临床前模型。

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我们感谢加拿大安大略省多伦多市多伦多大学桑尼布鲁克研究所Robert S. Kerbel博士实验室在本实验方案开发过程中提供的技术支持与专业知识。我们还要感谢Sandra Sexton博士以及罗斯韦尔公园癌症研究所实验动物资源部。本研究工作得到了罗斯韦尔公园联盟基金会（授予JMLE）的资助支持。

1. 原位肾肿瘤移植
<ol>
	<li>细胞培养
	<ol>
		<li>在进行原位移植前，将小鼠 RENCALUC 细胞以单层培养至 75% 汇合度。</li>
		<li>经胰酶消化并用含 5% FBS 的培养基重悬后，在 4 °C 条件下以 1,000 rpm 离心 5 分钟，用 PBS 洗涤 3 次。然后将细胞重悬于无血清培养基中，浓度为 5 × 104 RENCALUC/5 μl&#160;无血清培养基。 
		注意：根据所使用的细胞变体或细胞系，可将细胞重悬于基质胶（matrigel）与无血清培养基按 1:1 比例混合的溶液中，以减缓高侵袭性小鼠细胞在移植后的生长和扩散。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>手术与细胞移植 
	注意：本文所述所有动物实验，包括动物饲养管理及实验终点的确定，均依照罗斯韦尔帕克癌症研究所（Roswell Park Cancer Institute）机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准的方案进行。
	<ol>
		<li>使用异氟烷（2–3%）麻醉一只 Balb/C 小鼠。轻捏足部并检查反射以确认麻醉充分。在小鼠眼部涂抹兽用眼膏以防止角膜干燥。将小鼠置于右侧卧位，剃除前肢与后肢之间左侧体表的毛发。用酒精和碘酒对背部腰部区域进行消毒，为切口做好无菌准备。</li>
		<li>使用手术剪在最后一根肋骨与髋关节之间沿纵轴方向做一条约 1 cm 的皮肤切口。用钝头组织剪松解皮下结缔组织。再用手术剪在腹壁上沿纵轴方向做一条约 0.5 cm 的切口。用弯头镊子轻轻向下推动切口周围组织，使肾脏自然外翻，便于在注射前轻柔固定器官。</li>
		<li>用 Hamilton 注射器吸取 5 μl&#160;已准备好的细胞悬液。对于包膜下移植，可采用以下两种移植方法：
		<ol>
			<li>浅层法：&#160; 沿肾脏纵轴平行方向，将针头斜面朝上插入肾包膜下（但位于实质上方）。针头到位后，注入全部细胞，直至形成一个微小的白色液泡。缓慢退出针头，并立即用无菌棉签轻压注射部位，吸收可能渗漏的液体，防止细胞扩散。</li>
			<li>内部法：将针头斜面朝上，从肾脏最终移植位点的对侧开始，穿入肾脏实质内部，直至针头可见但未刺破包膜下间隙。注入全部细胞，直至形成白色液泡，随后擦拭注射部位以防止渗漏。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>轻柔地将肾脏复位至体腔内。使用可吸收的 5-0 Vicryl 缝线缝合腹壁。缝合完成后，拉拢皮肤并夹上 2–3 个伤口夹。确保夹子牢固且间距均匀，避免伤口暴露。在恢复前，使用 25 G 针头皮下注射 500 μl 0.9% NaCl 和 100 μl 布托啡诺（Buprenorphine，0.01 mg/ml）。术后常规监测伤口夹的位置与稳定性，并在 10 天后拆除。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 肾切除术/原发肿瘤切除
<ol>
	<li>按照上述第1.2.1节和第1.2.2节所述的相同方案进行小鼠麻醉、固定、切口及肾脏暴露操作。</li>
	<li>使用第二把镊子，从肾脏尾端轻轻分离连接的脂肪组织，并从头端分离肾上腺。在轻柔夹持肾脏的同时，使用可吸收的5-0 Vicryl缝线在输尿管、肾动脉和肾静脉周围打双结。缓慢结扎后，在结上方剪断以摘除肾脏。若出现即刻出血，或缝线对输尿管、动脉和静脉的固定可能不足时，则应使用电灼器而非&#160;剪刀在结上方切断。&#160;</li>
	<li>肾脏摘除后，仔细检查结扎的动脉是否有出血，并在必要时使用电灼器处理。使用5-0 Vicryl缝线关闭腹壁。将皮肤层拉拢，按照1.2.4节所述的相同注意事项放置2-3个伤口夹。术后每日密切观察动物是否出现痛苦、出血或活动受限等迹象。遵循机构关于动物安全的指导原则。</li>
</ol>
3. 终点时转移进展与定位的监测
<ol>
	<li>转移性疾病定量：生物发光监测
	<ol>
		<li>参见 JOVE 之前描述的方法，该方法使用转染了荧光素酶的细胞，并通过 Xenogen IVIS 成像系统进行定量以监测转移 11,12。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于比较评估转移分布的肉眼解剖指南
	<ol>
		<li>根据机构指南实施动物安乐死，终点包括出现痛苦迹象、呼吸困难、体重减轻等。 
		注意：需密切监测动物，因为自发性转移进展可能高度可变且迅速。</li>
		<li>使用手术剪在尿道上方开始切口，沿胸腔向上延伸至下颌。使用钝头剪分离腹部皮肤与腹壁肌肉。</li>
		<li>沿四肢进行切口，剥离皮肤。仔细检查皮肤筋膜和腹壁是否有结节，然后检查浅表淋巴结：腹股沟、臂部、腋窝和浅表颈淋巴结。</li>
		<li>在腹壁做切口，并沿左右两侧向上剪至膈肌。通过一次横向剪切移除腹壁前部，暴露内脏器官。</li>
		<li>观察内脏器官未受干扰时的外观，检查是否有明显可见的肿瘤。同时注意胃和肠道内容物；若为空，表明小鼠可能无法进食；若内容物呈深色，可能提示上/下消化道出血。</li>
		<li>对每只动物的各个器官进行肉眼评分，记录肿瘤存在与否，并为每组小鼠分配总分（以每组4只动物为例，见图1D-i）。 
		注意事项：1）淋巴结肿大并不一定意味着肿瘤生长；若其体积显著增大、质地坚硬且呈灰白色，则很可能是转移性结节。2）腹腔内出现大量乳白色或浑浊液体提示腹水。腹水中可能含有腹腔器官上的固体沉积物，尤其常见于肝脏叶间及胃部周围。3）对于肺等器官，可能存在多个结节，可进行计数以比较个体动物之间的差异（例如参见&#160;13）。</li>
		<li>通过小心取出各腹部器官（肝、脾、肾和胰腺）并用喷瓶中的 PBS 冲洗，识别肉眼可见的肿瘤或异常。</li>
		<li>移除腹部器官后，检查腹部淋巴结，包括腰部、骶部、肾周和肠系膜淋巴结。</li>
		<li>评估膈肌是否存在转移扩散的证据。 
		注意：膈肌上广泛转移可能导致其失去收缩能力，引起呼吸困难或呼吸停止。</li>
		<li>移除膈肌，并在胸腔两侧做线性切口，去除前部结构以暴露肺和心脏。</li>
		<li>轻轻夹住并提起食管，于心脏上方剪断气管，取出肺和心脏。检查组织是否存在结节。挤压心脏，若缺乏弹性可能提示存在肿瘤。</li>
		<li>使用手术剪沿颅骨线性剪开。轻轻移除小块颅骨，直至完全暴露脑组织。全面检查脑组织是否存在可见结节或异常着色区域。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+advanced+spontaneous+metastasis+for+experimental+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics.</a> Nat. Rev. Cancer. 11, 135-141 (2011).</li>
<li>Souza, B. M., Chaves, K. B., Chammas, R., Schor, N., Bellini, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endostatin+neoadjuvant+gene+therapy+extends+survival+in+an+orthotopic+metastatic+mouse+model+of+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Endostatin neoadjuvant gene therapy extends survival in an orthotopic metastatic mouse model of renal cell carcinoma.</a> Biomed. Pharmacother. 66, 237-241 (2012).</li>
<li>Amagai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+therapy+of+interleukin-2+and+sorafenib+improves+survival+benefits+and+prevents+spontaneous+pulmonary+metastasis+in+murine+renal+cell+carcinoma+models%5BTitle%5D)+AND+%22Jpn.+J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Combination therapy of interleukin-2 and sorafenib improves survival benefits and prevents spontaneous pulmonary metastasis in murine renal cell carcinoma models.</a> Jpn. J. Clin. Oncol. 40, 503-507 (2010).</li>
<li>Steeg, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+Drug+Development+Must+Consider+the+Impact+on+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Preclinical Drug Development Must Consider the Impact on Metastasis.</a> Clin. Cancer Res. 15, 4529-4530 (2009).</li>
<li>Guerin, E., Man, S., Xu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+postsurgical+advanced+metastatic+breast+cancer+more+accurately+replicates+the+clinical+efficacy+of+antiangiogenic+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A model of postsurgical advanced metastatic breast cancer more accurately replicates the clinical efficacy of antiangiogenic drugs.</a> Cancer Res. 73, 2743-2748 (2013).</li>
<li>Day, C. P., Carter, J., Bonomi, C., Hollingshead, M., Merlino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+therapeutic+response+of+residual+metastatic+disease+is+distinct+from+its+primary+tumor+of+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Preclinical therapeutic response of residual metastatic disease is distinct from its primary tumor of origin.</a> Int. J. Cancer. 130, 190-199 (2012).</li>
<li>Ebos, J. M., Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiangiogenic+therapy%3A+impact+on+invasion%2C+disease+progression%2C+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Antiangiogenic therapy: impact on invasion, disease progression, and metastasis.</a> Nat. Rev. Clin. Oncol. 8, 210-221 (2011).</li>
<li>Naito, S., Walker, S. M., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+selection+of+human+renal+cell+carcinoma+cells+with+high+metastatic+potential+in+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Metastasis%22%5BJournal%5D)">In vivo selection of human renal cell carcinoma cells with high metastatic potential in nude mice.</a> Clin. Exp. Metastasis. 7, 381-389 (1989).</li>
<li>Fidler, I. J., Naito, S., Pathak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+implantation+in+essential+for+the+selection%2C+growth+and+metastasis+of+human+renal+cell+cancer+in+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">Orthotopic implantation in essential for the selection, growth and metastasis of human renal cell cancer in nude mice.</a> Cancer Metastasis Rev. 9, 145-165 (1990).</li>
<li>Saiki, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+invasive+and+metastatic+phenotype+in+human+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Characterization of the invasive and metastatic phenotype in human renal cell carcinoma.</a> Clin. Exp. Metastasis. 9, 551-566 (1991).</li>
<li>Mohanty, S., Xu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+metastasis+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Experimental metastasis assay.</a> J. Vis. Exp. 42 (1942), (2010).</li>
<li>Nunez-Cruz, S., Connolly, D. C., Scholler, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+orthotopic+model+of+serous+ovarian+cancer+in+immunocompetent+mice+for+in+vivo+tumor+imaging+and+monitoring+of+tumor+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">An orthotopic model of serous ovarian cancer in immunocompetent mice for in vivo tumor imaging and monitoring of tumor immune responses.</a> J. Vis. Exp. (45), (2010).</li>
<li>Ebos, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+metastasis+after+short-term+treatment+with+a+potent+inhibitor+of+tumor+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Accelerated metastasis after short-term treatment with a potent inhibitor of tumor angiogenesis.</a> Cancer Cell. 15, 232-239 (2009).</li>
<li>Yang, O. C., Maxwell, P. H., Pollard, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+cell+carcinoma%3A+translational+aspects+of+metabolism+and+therapeutic+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Renal cell carcinoma: translational aspects of metabolism and therapeutic consequences.</a> Kidney Int. 84 (4), 667-681 (2013).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。&#160;

本实验方案的目的是利用同源肿瘤小鼠模型评估具有临床相关性的自发性转移性疾病，并描述肿瘤植入和切除的技术。目前，大多数评估新型实验性治疗手段的临床前研究并未纳入对转移性疾病的考察，仅有少数研究能够重现原发肿瘤生长、手术切除以及最终自发性转移扩散的各个阶段。迄今为止，为诱导自发性肾细胞疾病进展而构建的基因工程小鼠模型（GEMMs）（详见14的综述）尚不包括晚期转移阶段，且尚未见报道有关这些模型的外科干预策略。因此，目前自发性转移性肾细胞癌（RCC）的研究仅限于原位肿瘤细胞植入模型。尽管此类模型已有先前的建立&#160;2,3，但该方案在新疗法评估中尚未被广泛应用，尤其是在围手术期治疗评估中，其可能具有最高的预测价值。本方案旨在详细阐述必要的操作步骤，以促进该模型在治疗评估中的更广泛使用。在执行本方案所述技术时可能存在若干潜在问题，需特别注意几个关键因素，这些因素可能影响实验结果。首先，肿瘤细胞植入后发生泄漏可能导致腹膜内疾病播散，从而无法代表初始的局部原发性肿瘤生长。其次，必须针对所使用的每种细胞系确定最佳切除时间。这一点至关重要，因为过早地对荷瘤肾脏进行手术肾切除可能不足以引发疾病转移（...

肾细胞癌（RCC）患者死亡的主要原因是全身性转移性疾病，这类转移通常在肾脏原发肿瘤经手术切除后发生。然而，目前在小鼠中评估实验性治疗手段的临床前肿瘤模型极少包含转移性疾病，能够真实模拟局部生长、手术切除以及自发性微转移形成与进展等临床阶段的模型更是少之又少&#160;1-3。随着新疗法的不断涌现，这一测试环节的缺失变得愈发重要，因为在动物模型中观察到的显著抗肿瘤效果并不总能转化为对患者的同样成功治疗&#160;4。这种结果差异可能源于局部异位或原位原发肿瘤模型与晚期转移性疾病之间药物疗效的不同5-7。以肾细胞癌为例，仅有少数研究采用了包含自发性复发疾病的成熟动物实验方案，而这类复发情况可模拟临床上通常已将带瘤肾脏完全或部分切除的患者状况&#160;2,3。造成小鼠模型应用不足的原因多种多样。首先，动物成本高昂，且肿瘤细胞的选择及其转移潜能存在固有的变异性。例如，人类肾癌细胞系通常极少发生转移，必须经过多轮原位植入和转移性筛选，才能获得能够稳定播散并形成远端病灶的亚系（参见此类人类细胞系建立过程的描述&#160;8-10）。相反地&#160;，在免疫健全小鼠模型中，小鼠来源的肿瘤细胞往往表现出较强的侵袭性，因此必须使用较低细胞数量并联合Matrigel注射，以减少立即发生的全身扩散3。其次，实施准确的原位植入、手术切除（肾切除术）以及对自发性转移生长进行追踪（和定量）存在技术上的困难，在应用该技术时需考虑多个关键变量（详见讨论部分）。本实验方案的目的是详细描述肾细胞癌原位植入、切除（肾切除术）及自发性转移疾病监测的关键步骤（以及潜在的技术难点），并为科学实验室在评估实验性治疗手段疗效时提供标准化且更广泛应用的操作指南。

<table><tbody><tr><td>DMEM-高糖，含丙酮酸钠和L-谷氨酰胺</td><td>康宁</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶 EDTA</td><td>康宁</td><td>25-053-CL</td><td></td></tr><tr><td>不含钙的1x DPBS &amp;和镁</td><td>康宁</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD 生物科学</td><td>354234</td><td>必须保持在冰上</td></tr><tr><td>人工泪液-润滑性眼膏</td><td>Akorn动物健康</td><td>17478-162-35</td><td></td></tr><tr><td>口袋式宠物修剪器</td><td>布雷因特里科学公司</td><td>CLP9931B</td><td></td></tr><tr><td>酒精棉片</td><td>VWR</td><td>326895</td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘溶液棉签</td><td>VWR</td><td>67618-152-01</td><td></td></tr><tr><td>直头微解剖剪，钝头 - 25 mm 刀片 - 4.5&quot;&amp;nbsp;</td><td>南点外科手术</td><td>RS-5982</td><td></td></tr><tr><td>虹膜镊，带齿，弯曲型，10 cm 长</td><td>Kent scientific</td><td>INS15915</td><td>需要两个这样的</td></tr><tr><td>10 &amp;micro;10 微升汉密尔顿注射器</td><td>Hamilton</td><td>7635-01</td><td></td></tr><tr><td>30 G，45度，RN针头</td><td>Hamilton</td><td>7803-07</td><td></td></tr><tr><td>无菌棉签</td><td>VWR</td><td>10805-144</td><td></td></tr><tr><td>高温电烙器套件</td><td>Kent scientific</td><td>INS500392</td><td></td></tr><tr><td>5-0 涂层薇乔线，普通切割针&amp;nbsp;</td><td>Ethicon</td><td>J834</td><td></td></tr><tr><td>7 mm 结扎夹自动施夹器</td><td>Kent scientific</td><td>INS500343</td><td></td></tr><tr><td>反射夹，7 mm，非无菌</td><td>Kent scientific</td><td>INS500344</td><td></td></tr><tr><td>移除镊子，12 cm 长</td><td>Kent scientific</td><td>INS500347</td><td></td></tr><tr><td>0.9% 氯化钠</td><td>Baxter Healthcare</td><td>2B1322</td><td></td></tr><tr><td>布托啡诺 0.01 mg/ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>25 G 5/8&quot; 针</td><td>VWR</td><td>BD305122</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 无针注射器</td><td>VWR</td><td>BD309659</td><td></td></tr><tr><td>D-荧光素</td><td>Gold Bio technology</td><td>LUCK-1G</td><td></td></tr></tbody></table>

在小鼠肾切除术后建立自发性转移性肾细胞癌（mrcc）模型

Modeling Spontaneous Metastatic Renal Cell Carcinoma (mRCC) in Mice Following Nephrectomy

在肾细胞癌（RCC）新实验性治疗药物的改进测试中，一个关键挑战是建立能够真实模拟早期和晚期转移性疾病的进展模型。典型的肿瘤移植模型通常采用异位或原位的原发性肿瘤植入，但很少包含能够模拟临床情况的全身性自发转移性疾病。本实验方案描述了构建与患者疾病进展阶段相似的RCC模型的关键步骤。首先，该方案采用高转移性的小鼠肿瘤细胞系，在同源模型中实现原位肿瘤细胞植入，方法包括将细胞与Matrigel混合后植入肾包膜下空间，以防止细胞泄漏和早期扩散，该操作既可经浅表途径也可经内部途径进行。接着，方案详细说明了带瘤肾脏切除（肾切除术）的操作流程，并强调了术前和术后小鼠护理的关键要点。最后，方案概述了监测和评估微转移及大转移疾病进展所必需的步骤，包括生物发光成像，并提供了一份详细的可视化尸检指南，用于评分全身性疾病的分布情况。本方案的目标是促进临床相关性高的转移性RCC模型的广泛应用，从而提高未来治疗测试的预测价值。&#160;

图1A 展示了本方案摘要中详细说明的操作流程示意图。每一步骤均需考虑若干重要因素。例如，在步骤1中，展示了将肿瘤细胞植入肾脏包膜下的两种方法。可通过产生微小白色气泡来确认肿瘤细胞被准确地定位于包膜下间隙，同时在拔出针头后小心擦拭溢出的液体，以防止泄漏（图1B-i）。为防止泄漏，也可先将细胞植入肾实质内部，使其进入包膜下空间（图1B-ii），并可与Matrigel混合使用，以阻止肿瘤细胞过早进入血液循环。关于肾脏的手术切除，具体时间取决于所用细胞系的生长速度和转移潜能。最佳的肾切除操作应快速但可控，以尽量减少小鼠的痛苦并促进恢复。使用Vicryl线牢固结扎输尿管、肾动脉和肾静脉是防止出血的关键（见图1C）。可使用电灼止血，但仅在可能出现大量出血时才进行干预。最后，通过非侵入性生物发光检测对自发性疾病进行追踪，可实现对隐匿性病灶及其生长的持续监测，并在实验终点进行定量分析（见图1D）。然而，在自发性转移模型中使用荧光素酶标记的细胞时，有时会导致克隆性肿瘤细胞筛选出不表达转染...

自发性转移性肾细胞癌（RCC）疾病进展模型可用于在具有临床相关性的环境中评估治疗方法。本实验方案展示了原位肾肿瘤细胞植入、规范的肾切除术操作步骤，最后提供了一套尸检指南，用于对转移负荷及定位进行肉眼观察和生物发光评分。

在小鼠肾切除术后建立自发性转移性肾细胞癌（mRCC）模型

肾细胞癌（RCC）新实验性治疗药物在改进测试过程中面临的关键挑战之一是建立能够真实模拟……的模型

本实验的总体目标是建立具有临床相关性的自发性转移肾细胞癌模型。首先，需准备用于移植的Reka Luke细胞；第二步，进行原位肾肿瘤细胞移植。接下来，在肿瘤生长后，通过肾切除术切除原发性肿瘤。最后一步是监测肾切除术后自发性转移的进展情况，并评估肿瘤在不同部位的分布情况。最终，该方案可实现对自发性转移性肾细胞癌疾病的监测，并为标准化评估实验性治疗药物的疗效提供指导。与现有的异位移植方法（通常是浅表或皮下肿瘤细胞植入）相比，该技术的主要优势在于能够重现患者中肾细胞癌（RCC）的真实情况，包括肿瘤细胞向全身其他部位扩散的能力。该技术的应用意义在于肾细胞癌的治疗，因为系统性转移性疾病才是导致患者死亡的主要原因。而小鼠模型通常无法模拟肾切除术后可能发生的自发性转移性疾病。 尽管该方法可为自发性转移性肾细胞癌疾病提供研究依据，但也可应用于其他类型的癌症，这些癌症通常会切除原发性肿瘤，而术后转移性疾病的复发是导致死亡的主要原因。其中包括乳腺癌和黑色素瘤等模型。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，原因主要有两点：第一，难以准确定位肾脏，并确保肿瘤细胞在植入后保持局部定位，不发生泄漏；第二，需要高效地完成操作，以便动物在术后顺利恢复。在进行原位植入前，将表达荧光素酶的小鼠 reca 细胞或 reka Luke 细胞以单层培养至 75% 融合度，经胰酶消化后，用含 5% FBS 的培养基重悬，反复离心三次，每次用 PBS 洗涤，最后将细胞重悬于无血清培养基中，调整浓度为每 5 微升无血清培养基中含有 5 × 10⁴ 个 renco Luke 细胞。用2%至3%的异氟烷麻醉海鼠后，涂抹眼膏以防止眼睛干燥，然后轻捏其足部以确认麻醉是否充分。将海鼠置于右侧卧位，剃除左后肢与前肢之间的体表毛发。随后，在背部腰部区域依次使用酒精和碘酒消毒。使用手术剪在最后一根肋骨与髋关节之间沿纵轴方向做一道长约1厘米的皮肤切口。然后使用钝头解剖剪松解皮肤下的结缔组织。接着，使用手术剪在腹壁纵向做0.5厘米的切口。现在用弯头镊子轻轻向下推动开放伤口周围的组织。此操作可将肾脏外置，并在注射前轻柔固定器官。用Hamilton注射器吸取5 µL已制备的细胞混合物，用于浅表性肾囊下植入。持针时使针头与纵向放置的肾脏平行，斜面朝上，将针头插入肾包膜下方但实质上方。针头到位后，注入全部细胞，直至形成一个小的白色气泡。缓慢将针头从包膜中抽出，并立即使用无菌棉签堵住注射部位，以实现包膜下内部植入。操作从肾脏上与预期植入部位相对的一侧开始。持针时使针尖斜面朝上并朝内，从肾脏内部插入针头，直至可见针头穿过肾脏，但不要刺破对侧的肾包膜下间隙。注入细胞，直至形成白色泡状隆起，然后擦拭注射部位，以防止液体渗漏。轻柔地将肾脏放回体腔内。使用可吸收的5.0 Vicryl缝线缝合腹壁。操作完成后，对合皮肤层，并在恢复前放置两到三个伤口夹。皮下注射 500 µL 的 0.9% 氯化钠溶液和 100 µL 布托啡诺。植入后 26 至 30 天，麻醉动物并按先前方法暴露肾脏。然后用镊子轻轻去除肾脏套管端连接的脂肪组织，并从肾脏头端去除肾上腺。用镊子轻轻夹住肾脏，然后将可吸收的5.0 Vicryl缝线绕过输尿管、肾动脉和肾静脉。接着，用止血钳夹住缝线后缓慢打一个双重结。使用剪刀在结上方剪断缝线，并移除肾脏。肾脏摘除后，仔细检查结扎处、动脉是否有出血，必要时进行电灼止血。使用5.0 Vicryl缝线缝合腹壁后，用伤口夹关闭皮肤。每日监测动物是否有痛苦、出血或活动受限等迹象。处死动物后，使用手术剪从尿道上方开始剪开，沿胸腔向上延伸至下颌骨下缘。用钝头剪刀将腹部壁肌肉上的皮肤分离。接着，沿四肢剪开皮肤，并缓慢将皮肤剥离。仔细检查皮肤筋膜和腹壁是否有结节，然后检查浅表淋巴结。在腹壁做一切口，并沿左右两侧向膈肌方向剪开。进行一次水平切口，移除腹壁的前部以暴露内脏。在未扰动的情况下检查内脏的外观，观察是否有明显的肿瘤。同时注意观察胃和肠道内容物，以获取摄食或出血的证据。根据包含22个位点的检查清单，逐项目视评估每个器官是否存在肿瘤，并对特定组别动物的评分结果进行统计，以比较疾病分布情况。随后小心取出肝脏，并用PBS冲洗。然后检查其是否有明显的肿瘤或异常，并按之前的方法进行评分。接着，继续切除并评分脾脏、肾脏和胰腺。接下来，检查腹腔淋巴结，包括腰骶淋巴结、肾周淋巴结和肠系膜淋巴结。在评估膈肌是否存在转移性扩散迹象后，移除膈肌并在胸腔内做两个侧向切口，去除前部组织以暴露肺和心脏，轻轻提起食管并在心脏上方切断气管。移除肺和心脏后，检查组织是否有结节。接下来，使用镊子挤压心脏。弹性不一致可能提示肿瘤的存在。最后，使用手术剪沿直线剪开颅骨。轻轻移除颅骨的小块碎片，直至整个大脑完全暴露。采用视觉评分系统评估五组动物的疾病状况、疾病分布范围及严重程度。这些组别表现出不同程度和严重性的疾病。另外，在动物安乐死后立即进行生物发光成像，以定量评估微小和大范围转移性病灶。一旦掌握技术，若操作得当，每只动物的植入、肾切除或尸检均可在5到10分钟内完成。为检测不同类型的转移性肿瘤细胞对治疗的反应是否存在差异。来自转移性肾细胞癌的细胞。目前，患者来源的肿瘤被直接植入动物体内，以评估局部和转移性疾病的生长情况，从而在疾病发展后进行研究。该技术为肾细胞癌（RCC）领域的研究人员探索具有临床相关性的疾病进展以及对治疗的反应奠定了基础。特别是，可用于研究这些治疗反应是否因原发局限性疾病或自发性转移性生长而存在差异。请注意，操作经历多次手术的微小动物时，必须严格遵守机构的动物实验规程指南和无菌操作条件。动物的舒适度和术后恢复是正确实施该操作的关键因素。

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在小鼠模型自发转移性肾细胞癌（MRCC）肾切除

建立该模型可采用两种技术：将癌细胞悬液注射至盲肠壁，或将皮下肿瘤组织块移植到盲肠。该模型可用于研究结直肠癌的自然进展过程，以及评估针对结直肠癌的新型治疗药物。...

结直肠癌小鼠原位模型

本视频介绍了建立结直肠癌患者来源异种移植瘤（PDX）自发转移小鼠模型的实验方案。这些异种移植模型可部分模拟人类癌瘤的特征，有助于理解人类恶性肿瘤的关键特征，包括侵袭和转移过程。...

自发性转移小鼠模型：研究原位注射结直肠癌细胞转移潜能的平台

在本视频中，我们建立了一种肾细胞癌的原位小鼠模型。该模型可在注射侧肾脏中形成可重复的原发性肿瘤，并在肺部产生转移性肿瘤，从而能够评估疾病进展及治疗效果。...

建立肾细胞癌模型：通过癌细胞肾内植入构建原位肾细胞癌小鼠模型的方案

关键词：肾细胞癌，原位小鼠模型，肾内植入，肿瘤模型，癌症研究，实验动物模型

这种人源前列腺癌原位模型可用于定量分析肿瘤大小、循环肿瘤细胞以及肺部特异性转移灶的形成。由于肿瘤细胞必须逃逸出原发器官，进入血液循环，并在继发部位定植，该模型能够有效重现人类肿瘤转移的真实情况。...

一种人前列腺癌转移的原位小鼠模型

本文描述了一种原位乳腺癌原发肿瘤模型，以及通过手术切除原发肿瘤以延长小鼠生存期从而产生自发性转移的方法。肿瘤的生长和进展通过荧光素酶成像进行监测和定量。...

一种自发性乳腺癌转移的原位小鼠模型

前列腺癌是美国癌症相关死亡的第二大常见原因。原位癌模型为理解前列腺癌的生物学特性以及评估治疗方案的有效性提供了一种有效的方法。本方案详细描述了建立原位前列腺癌小鼠模型所需的各个步骤。...

人前列腺癌的临床前原位小鼠模型

在免疫功能健全的小鼠中建立肾细胞癌原位模型，可为研究者提供一种具有临床相关性的实验体系，该体系在同一动物体内同时表现出原发性肾肿瘤和肺转移灶。该模型可用于多种治疗方法的临床前测试。 体内.

一种用于定量和纵向评估临床前疗法的同系小鼠转移性肾细胞癌模型

我们介绍了一种利用生物发光技术量化肿瘤负荷的小鼠原位乳腺癌模型和根治性乳房切除术模型，以模拟人类乳腺癌的进展过程。...

建立小鼠原位转移性乳腺癌模型及实施小鼠根治性乳房切除术

本方案描述了通过将高级别尿路上皮细胞癌细胞经膀胱内灌注，或将结直肠癌细胞经直肠内注射至非肥胖型糖尿病/重度联合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠体内，建立患者来源的原位异种移植模型，以在淋巴结基质细胞影响下实现原发肿瘤生长及自发性转移，从而模拟人类转移性疾病的进展过程。...

源自患者的膀胱上皮细胞癌和结直肠癌原位异种移植模型用于肿瘤生长及自发性转移研究

我们详细描述了一种具有临床相关性的结直肠癌肝转移（CRLM）肿瘤模型，以及肝脏缺血再灌注（I/R）对肿瘤生长和转移的影响。该模型有助于更好地理解手术促进肝转移性生长的潜在机制。...

缺血再灌注损伤背景下小鼠转移性肝肿瘤模型

转移性透明细胞肾细胞癌是一种尚无全面动物模型用于深入临床前研究的疾病。本方案介绍了该疾病的两种新型动物模型：原位移植小鼠模型和鸡绒毛尿囊膜模型，这两种模型均能表现出类似临床病例的肺转移。...

比较在小鼠肾脏和鸡绒毛尿囊膜上建立的转移性透明细胞肾细胞癌模型

学习在小鼠模型中建立自发性转移性肾细胞癌的标准化方案，通过原位肾肿瘤细胞植入和肾切除术模拟临床疾病进程。该方法可用于评估实验性治疗药物的疗效，为肾癌研究提供可靠的临床前模型。

在小鼠肾切除术后建立自发性转移性肾细胞癌（mRCC）模型

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