Name: 完全性脊髓损伤和脑解剖协议后续Wholemount原位杂交苗种海七鳃鳗 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: 学习海七鳃鳗完全性脊髓损伤和脑解剖技术，结合整体原位杂交方法研究轴突导向机制。该技术可观察脊髓投射神经元的再生能力及轴突导向受体表达变化，为脊髓再生研究提供重要模型。

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由美国国立卫生研究院（NIH）基金项目 NS14837、R01 NS38537、R24 HD050838 以及 Shriners 基金项目 SHC-85220 资助，受资助者为 Michael E. Selzer 博士；Shriners 基金项目 SHC-85310 资助 Michael I. Shifman 博士。Antón Barreiro-Iglesias 博士获得西班牙 Fundación Barrié 及西班牙加利西亚自治区政府（Xunta de Galicia，加利西亚，西班牙）的支持。

有关本方案中使用的所有材料，请参见表1。
实验已获得天普大学机构动物护理和使用委员会的批准。
1. 动物
<ol>
	<li>从密歇根湖支流、特拉华河支流（宾夕法尼亚州）或缅因州的溪流中采集野生型海七鳃鳗（Petromyzon marinus L.）幼体，体长为 10 – 14 cm（4 – 7 龄）。</li>
	<li>在实验室中，将幼体以每组 50 - 100 尾的密度饲养于 50 加仑的淡水水箱中，水温维持在 16 °C。水箱底部铺约 2.5 厘米厚的碎石，供幼体钻埋；水需经活性炭过滤，并使用气石曝气至少 48 小时，以去除氯及其他杂质，之后方可放入七鳃鳗。动物无需额外喂食，因其可循环利用自身产生的碎屑物，直至使用当天为止。</li>
</ol>
2. 完全性脊髓横断
<ol>
	<li>在脊髓手术前，配制一份文昌鱼任氏液，其成分为：110 mM NaCl、2.1 mM KCl、2.6 mM CaCl₂2，1.8 mM MgCl2 和 10 mM Tris 缓冲液；pH 7.4。</li>
	<li>为进行脊髓横切，将幼虫置于小容器中，用含1%三卡因甲磺酸盐的冰镇林格液麻醉。</li>
	<li>麻醉后，将动物置于一个装有半满Sylgard（硅胶）的培养皿中，使用4枚昆虫针（直径0.15 mm）固定动物位置以进行手术（一枚置于动物吻部，一枚置于尾部，另两枚置于第5节段水平两侧）。th 鳃）。用任氏液将培养皿几乎加满至顶部。在体视显微镜下进行手术时，将盛有幼体的培养皿置于冰上。</li>
	<li>进行脊髓横断时，沿背侧正中线，使用手术刀（#11）在第5椎体水平做一纵向切口th 用鳃部观察脊髓。首先将刀片尖端朝上插入皮肤切开，然后非常轻柔地剪开肌肉组织，直至从上方可见脊髓。用昆虫针制作两个钩子，用于钩住体壁使其保持张开，以便进行脊髓横断操作。</li>
	<li>在第5节段完全横断脊髓th 使用剪刀（Castroviejo #8）从鳃部垂直于脊髓插入，用一次干净利落的切割完全横断脊髓。在体视显微镜下观察脊髓的切断端，确认脊髓已被完全横断。随后，使用镊子（#5）在横断后重新对齐脊髓的切断端。</li>
	<li>完成脊髓横断后，用一对精细镊子闭合背部体壁的切口，并将幼体置于冰上1小时，使伤口干燥。在冰与幼体之间放置一片滤纸，并用七鳃鳗任氏液浸湿。低温可维持动物存活，同时促进伤口晾干，从而有助于防止感染。</li>
	<li>然后将幼虫转移至装有冰水的小型水箱中（每箱1条幼虫），处理24小时。</li>
	<li>在脊髓横断术后1天检查受损的幼虫，通过行为学确认损伤部位尾端无任何运动。若幼虫仅能移动损伤部位头端的头部（位于第5体节水平），则认为脊髓横断完全th 鳃）。如果出现此情况，现在可将幼虫转移至盛有室温（23℃）淡水的独立容器中（每容器1条幼虫）。 °C）以恢复至选定的时间点。</li>
	<li>在恢复期间，每2至3天更换一次水。</li>
</ol>
3. 大脑解剖及大脑样本制备 原位 杂交
<ol>
	<li>在损伤后的预定时间点，重新麻醉幼体七鳃鳗，将其置于含有任氏液的培养皿中并固定，按上述方法进行脑组织解剖。</li>
	<li>用手术刀在鼻孔与松果体器官之间做一横向切口，以取出脑组织。随后用镊子夹住脑组织，同时使用Castroviejo剪刀开始剪除脑周围组织。</li>
	<li>脑暴露后，用镊子去除脉络丛，并使用牵开钩撑开动物头部以暴露脑神经。随后用Castroviejo剪刀横向切断脊髓。用一把镊子夹住脊髓，同时用另一把镊子剪断脑神经，从而分离出脑组织。</li>
	<li>解剖后，将脑组织置于一小块硅胶上，用两枚昆虫针插入嗅球，一枚插入脊髓，以固定其位置。随后，用剪刀沿背侧中线切断脑的后联合和 cerebrotectal 联合，将翼板向两侧展开，并用四枚昆虫针将其平展固定于硅胶上。图2).</li>
	<li>将带有脑组织的硅胶片转移至含有4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液（pH 7.4）的离心管中，在旋转摇床上室温固定3小时。</li>
	<li>固定后，按照先前所述方法（Swain 等，1994）。对照组或假手术组动物的脑组织必须始终与损伤组动物的脑组织平行处理。整装幼虫脑可采用以下方法进行研究： 原位 杂交，因其扁平且纤薄的形态以及缺乏髓鞘10，从而使大脑变得相当透明。</li>
</ol>

<ol><li>Rodicio, M. C., Barreiro-Iglesias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lampreys+as+an+animal+model+in+regeneration+studies+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Neurol%22%5BJournal%5D)">Lampreys as an animal model in regeneration studies after spinal cord injury.</a> Rev Neurol. 55, 157-166 (2012).</li>
<li>Davis, G. R. Jr, McClellan, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extent+and+time+course+of+restoration+of+descending+brainstem+projections+in+spinalcord-transected+lamprey%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Extent and time course of restoration of descending brainstem projections in spinalcord-transected lamprey.</a> J Comp Neurol. 344, 65-82 (1994).</li>
<li>Jacobs, A. J., Swain, G. P., Snedeker, J. A., Pijak, D. S., Gladstone, L. J., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+neurofilament+expression+selectively+in+regenerating+reticulospinal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Recovery of neurofilament expression selectively in regenerating reticulospinal neurons.</a> J Neurosci. 17, 5206-5220 (1997).</li>
<li>Shifman, M. I., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+netrin+receptor+UNC-5+in+lamprey+brain+modulation+by+spinal+cord+transection%5BTitle%5D)+AND+%22Neurorehabil+Neural+Repair%22%5BJournal%5D)">Expression of the netrin receptor UNC-5 in lamprey brain modulation by spinal cord transection.</a> Neurorehabil Neural Repair. 14, 49-58 (2000).</li>
<li>Barreiro-Iglesias, A., Laramore, C., Shifman, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sea+lamprey+UNC5+receptors+cDNA+cloning%2C+phylogenetic+analysis+and+expression+in+reticulospinal+neurons+at+larval+and+adult+stages+of+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The sea lamprey UNC5 receptors cDNA cloning, phylogenetic analysis and expression in reticulospinal neurons at larval and adult stages of development.</a> J Comp Neurol. 520, 4141-4156 (2012).</li>
<li>Shifman, M. I., Yumu, lR. E., Laramore, C., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+repulsive+guidance+molecule+RGM+and+its+receptor+neogenin+after+spinal+cord+injury+in+sea+lamprey%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Expression of the repulsive guidance molecule RGM and its receptor neogenin after spinal cord injury in sea lamprey.</a> Exp Neurol. 217, 242-251 (2009).</li>
<li>Busch, D. J., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synuclein+accumulation+is+associated+with+cell-specific+neuronal+death+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Synuclein accumulation is associated with cell-specific neuronal death after spinal cord injury.</a> J Comp Neurol. 520, 1751-1771 (2012).</li>
<li>Shifman, M. I., Zhang, G., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+death+of+identified+reticulospinal+neurons+after+spinal+cord+injury+in+lampreys%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Delayed death of identified reticulospinal neurons after spinal cord injury in lampreys.</a> J Comp Neurol. 510, 269-282 (2008).</li>
<li>Swain, G. P., Jacobs, A. J., Frei, E., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+in+situ+hybridization+in+wholemounted+lamprey+brain+neurofilament+expression+in+larvae+and+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">A method for in situ hybridization in wholemounted lamprey brain neurofilament expression in larvae and adults.</a> Exp. Neurol. 126, 256-269 (1994).</li>
<li>Bullock, T. H., Moore, J. K., Fields, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+myelin+sheaths%3A+both+lamprey+and+hagfish+lack+myelin%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Evolution of myelin sheaths: both lamprey and hagfish lack myelin.</a> Neurosci Lett. 48, 145-148 (1984).</li>
<li>Cohen, A. H., Kiemel, T., Pate, V., Blinder, J., Guan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+can+alter+the+function+outcome+of+spinal+cord+regeneration+in+larval+lampreys%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Temperature can alter the function outcome of spinal cord regeneration in larval lampreys.</a> Neuroscience. 90, 957-965 (1999).</li>
</ol>

作者声明不存在相互竞争的经济利益。

本文介绍了一种在幼体海七鳃鳗中进行完整脊髓横断及后脑解剖的详细方案。该方法可通过整体脑原位杂交技术，分析脊髓损伤后投射至脊髓的可识别神经元之间基因表达的差异。本方案的关键步骤是正确实施完整的脊髓横断，可通过体视显微镜下观察脊髓切断端来控制操作，并在24小时后用镊子轻触幼体吻部，观察损伤部位尾侧是否无运动反应以确认横断成功。此外，为保障动物术后恢复，手术所用剪刀必须锋利，且需一次性完成干净利落的切割，以确保脊髓被完全横断。
在手术期间以及伤口晾干的一小时内将动物置于冰上，并在术后最初24小时内将其置于冰水环境中，可显著提高动物受伤后的存活率。在此阶段之后，伤口已闭合，动物即可转移至室温的淡水水箱中饲养。
由于在较高温度下，大多数幼体七鳃鳗在损伤后能够恢复完整的运动行为功能，因此允许其在室温下恢复，而不是在通常的低温环境下恢复11。在完全脊髓横断术后8至10周可观察到正常运动模式的恢复。
在完成选定时间点的全脊髓横断和幼体脑组织解剖后，不仅可对幼体脑组织...

在哺乳动物中，脊髓损伤（SCI）是一种破坏性疾病，会导致损伤部位以下的功能永久性丧失，因为受损的轴突无法穿过创伤区域并重新连接到其相应的靶点。与哺乳动物不同，八目鳗在完全脊髓损伤后能够恢复运动功能1。有趣的是，八目鳗具有一组36个可投射至脊髓的神经元，由于其体积较大，在整体脑组织标本中可被单独识别2,3（图1）。高位完全脊髓横断会切断所有这些脊髓投射神经元的轴突。我们课题组及他人的前期研究表明，即使在脊髓损伤后功能恢复的情况下，其中一些神经元仍表现出极低的再生能力（被认为是“再生能力差的神经元”），而另一些神经元通常能够使轴突穿过损伤部位实现再生（被认为是“再生能力强的神经元”）2,3。这一特性使得八目鳗成为一种有趣的脊椎动物模型，可用于研究再生能力强与弱的脊髓投射神经元之间基因表达的差异，进而揭示在相同外部环境中尝试轴突再生的神经元其内在再生能力差异的分子基础1。
利用该模型，我们先前已证明，再生能力较低的脊髓投射神经元会表达轴突导向分子受体，如 UNC54,5 和 neogenin6，这些受体分别介导了 netrin 和 RGM 的抑制作用。此外，通过使用该方法，我们课题组还发现，只有再生能力良好的神经元在损伤后及再生过程中表现出神经丝蛋白表达的恢复。最近，Busch 和 Morgan7 通过免疫荧光技术显示，再生能力差的神经元在损伤后 α-synuclein 的表达升高，作者认为这与“再生能力差”的脊髓投射神经元在完全性脊髓横断后缓慢死亡的现象相关5,7,8。因此，七鳃鳗完全性脊髓损伤模型已成为研究轴突切断后何种因素决定脊髓投射神经元成为“再生能力差”类型的非常有用的模型。
为了开展我们的研究，我们在损伤后设定的时间点进行完全性脊髓横断手术以及后脑解剖，以制备全组织标本 原位 杂交。在本文方法学文章中，我们提供了一套详细的实验方案，用于正确实施幼体七鳃鳗全脊髓损伤手术，随后的动物饲养维护，以及最终的脑组织解剖和整体脑标本制备 原位 杂交。已有文献详细报道了在幼体七鳃鳗脑组织中进行整体原位杂交的实验方案。9 此外，该脊髓损伤与脑组织解剖方案也可用于后续对脑组织进行免疫组织化学或其他组织学方法的处理。

<table><tbody><tr><td>三卡因甲烷磺酸盐</td><td>光谱</td><td>TR108</td><td>用于安乐死的 PBS 中苯佐卡因饱和溶液</td></tr><tr><td>手术刀 #3</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>手术刀刀片：#11</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo剪刀#8</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>15002-08</td><td></td></tr><tr><td>4号镊子 &amp;& #5</td><td>杜蒙，瑞士</td><td>Roboz RS4955</td><td>#4 用于脊髓解剖；#5 用于剥离脑膜</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Olympus</td><td>SZ51</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>道康宁公司</td><td>184</td><td></td></tr><tr><td>昆虫针 0.15、0.20 mm</td><td>奥斯特利茨</td><td>无目录编号</td><td>0.15 毫米用于固定脑和脊髓；0.20 毫米用于躯体</td></tr><tr><td>带盖 7 ml 高密度聚乙烯闪烁管</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-1</td><td></td></tr><tr><td>16% 多聚甲醛</td><td>电子显微镜科学（EMS）</td><td>19210</td><td>用 PBS 稀释至 4%</td></tr></tbody></table>

完全性脊髓损伤及脑组织解剖后续整体染色操作方案 原位 幼体海七鳃鳗的杂交

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

在完全性脊髓损伤后，海七鳃鳗最初在横断水平以下出现瘫痪。然而，数周后它们能够恢复运动能力，这一过程伴随着脊髓内轴突以及脑干发出的脊髓投射轴突的短距离再生（数毫米）。在36个可识别的大型脊髓投射神经元中，有些神经元轴突再生能力较强，而另一些则较弱。这些神经元在整体中枢神经系统标本中可被最方便地识别。为了理解脊椎动物中枢神经系统损伤后有利于或抑制轴突再生的神经元内在机制，我们分析了强再生神经元与弱再生神经元之间的基因表达差异，并研究脊髓横断对基因表达的影响。本文介绍了在淡水水箱中饲养幼体及近期完成变态的成年海七鳃鳗、在显微镜下实施完全脊髓横断，以及制备脑和脊髓整体标本用于原位杂交的技术。简而言之，动物在16℃条件下饲养&#160;°C，并在含1%苯佐卡因的七鳃鳗任氏液中进行麻醉。使用虹膜剪从背侧入路横断脊髓，随后将动物置于23 °C的新鲜水箱中恢复。对于 原位 杂交后，动物重新麻醉，通过背侧入路取出脑和脊髓。

作为使用该方法可获得结果的一个示例，图2展示了整体染色脑组织的代表性图像，显示了对照组以及损伤后两周的幼体海七鳃鳗中可识别的脊髓投射神经元内新生成素（neogenin）转录本的表达情况。关于新生成素在完全脊髓横断后表达变化与海七鳃鳗可识别脊髓投射神经元再生能力之间关系的完整细节，请参见先前的研究6。简而言之，研究结果表明，损伤后可识别的脊髓投射神经元中新生成素受体的表达发生变化。在完全脊髓横断后两周，新生成素受体优先在再生能力差的神经元（如M1、I1、I2、I4或Mth神经元）中表达（见图2B）。这些结果展示了本实验方案的应用效果，并提示新生成素受体可能参与了这些细胞再生失败的过程。
<img alt="显示昆虫神经节中神经元通路和标记核团的神经网络示意图。" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51494/51494fig1highres.jpg" width=...

七鳃鳗在完全脊髓损伤后能够恢复运动功能。然而，某些脊髓投射神经元具有良好的再生能力，而另一些则不然。本文阐述了海七鳃鳗幼体（以及近期完成变态的成体）的饲养技术、完全脊髓横断手术的实施方法，以及全脑和脊髓整体装片的制备方法。 原位 杂交。

脊髓完全损伤后，七鳃鳗在横断水平以下最初会出现瘫痪。然而，经过数周后，它们能够恢复运动功能。

本实验的总体目标是完成脊髓完全横断及脑组织解剖，以研究损伤后轴突导向。该过程首先在第五鳃水平处横断七鳃鳗的脊髓，随后解剖脑组织并将其固定于石蜡盘上。固定脑组织后，可将其保存在甲醇中，或直接用于原位杂交，最终可观察到轴突导向受体表达的变化。在脊髓损伤后，可在再生的脊椎中观察到这些受体表达的改变。我们今天将要演示的这一技术相较于传统的石蜡切片或冰冻切片的优势在于，它能够使您观察到完整的脑组织，包括那些投射至脊髓、体积较大且可被识别的神经元。为我们演示该操作的是本实验室的研究科学家 Kathy Zang 博士。这些野生型海七鳃鳗幼体来自密歇根湖支流的溪流、宾夕法尼亚州的特拉华河，以及缅因州的溪流。所用的海七鳃鳗（Petromyzon marinus）幼体均由此处获得。4至7龄幼虫体长为10至14厘米，体型足够进行损伤实验和解剖。将它们以每组52至100条的规模饲养在50加仑的淡水水箱中，水温保持在16摄氏度。水箱需要铺设一英寸厚的砾石基质，以便七鳃鳗能够钻入其中。加入水箱的所有水都应先经过活性炭过滤和曝气处理至少48小时，方可加入水箱。只要动物在一年内使用，则此操作过程中无需喂食。准备好 freshly prepared 林格氏液备用。首先将鱼转移至饱和的苯佐卡因水溶液中。待其麻醉后，将其转移至一个装有一半硅胶颗粒的培养皿中。将培养皿置于冰上，并在培养皿上方覆盖冰块。冰冷的林格液。用三根直径为0.15的昆虫针固定动物，一根固定在吻部，另两根固定在第五鳃处。然后将其置于体视显微镜下进行手术。首先使用11号手术刀在第五鳃水平的背侧中线处做一纵向切口。进行此切口时将暴露出脊髓。使用由昆虫针制成的两个钩子，并用Castro第八号持针器和剪刀固定体壁。在暴露的脊髓上做一垂直切口。检查脊髓的切端，以确保横断完全。然后使用镊子将切端重新对齐，并缝合伤口。将七鳃鳗幼体转移到浸有林格液的滤纸上。将标本置于冰床上一小时，使伤口在一小时后干燥。随后将幼体转移至其独立的小型冰水容器中。使其在此处恢复 24 小时。24 小时后，检查横断处是否有向心性运动。如果存在任何运动，则说明横断不完全。如果没有出现上述情况，则表明横切操作成功，可将动物转移至室温水箱中恢复，同时让动物继续恢复。每两到三天更换一次水。当横切后的动物充分恢复后，将其麻醉，并按照此前所述方法进行解剖前准备。解剖脑部时，首先在鼻孔与松果体器官之间做一横向切口。然后用 Castro 刀剪在固定动物的同时剪开脑周围组织。使用镊子。脑干两侧的白色卵圆形结构为耳囊。暴露脑组织后，用镊子去除脉络丛。接着，使用改良的针钩撑开动物头部，以暴露脑神经。然后用镊子固定脊髓，同时用剪刀横向剪断脊髓。剪断脑神经以分离出脑组织。随后将脑组织转移至一小块硅胶上，并将其固定。使用一根昆虫针插入脊髓，另一根昆虫针穿过其中一个嗅球。然后用剪刀沿背侧中线切断两个嗅球之间的联合、大脑保护层联合以及脑干的 oex 结构。一旦这些联合结构和 oex 被切断，将左右（A LR）板向外侧展开，并用总共七根昆虫针将其平展固定在硅胶上：两根固定在嗅球处，两根固定在大脑保护层联合切口边缘，两根固定在延伸的 oex 处，一根固定在脊髓中线位置。现在使用无RNA酶的试剂，在室温下用4%多聚甲醛轻柔振荡固定样品3小时。随后可通过原位杂交方法分析脑组织，采用所述方法检测新基因（neogen）转录本的表达。在脊髓、对照动物的投射神经元以及实验动物中均检测到其表达。损伤后两周，此处显示的是具有代表性的未损伤对照样本。 完全脊髓横断后，新生态受体的表达发生了变化。两周后，非对照组中的新生态受体在再生能力较差的神经元（如 M1 I1 I2 I4 或 MTH 神经元）中优先表达。该技术的发展为我们探索同一脑组织中导向受体、硫酸软骨素受体、蛋白聚糖受体以及碱基激活状态的表达铺平了道路。

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小鼠脊髓局灶性注射溶血卵磷脂诱导脱髓鞘与再髓鞘化的实验方法

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大规模扫描透射电子显微镜（纳米解剖学）对健康与损伤斑马鱼脑组织的成像

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斑马鱼脊髓感觉和运动神经元电生理记录的 in situ 脊髓制备

我们改进了Marmarou落锤模型，用于成年斑马鱼，以研究钝力性创伤性脑损伤（TBI）后多种病理变化以及继发性神经元再生的潜在机制。该钝力性TBI模型具有可扩展性，可诱导轻度、中度或重度TBI，并重现了人类TBI中观察到的损伤异质性。...

一种可扩展的模型用于研究钝力损伤对成年斑马鱼的影响

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