完全性脊髓损伤及脑组织解剖后续整体染色操作方案 原位 幼体海七鳃鳗的杂交

本实验的总体目标是完成脊髓完全横断及脑组织解剖，以研究损伤后轴突导向。该过程首先在第五鳃水平处横断七鳃鳗的脊髓，随后解剖脑组织并将其固定于硅胶板上。

固定脑组织后，可将其保存在甲醇中，或直接用于原位杂交。最终可观察到脊髓损伤后再生脊椎中轴突导向受体表达的变化。我们今天所要演示的技术相较于传统的石蜡切片或冰冻切片，其优势在于能够完整观察整个脑组织，包括那些投射至脊髓的、体积较大且已明确的神经元。

为我们演示该实验步骤的是本实验室的研究科学家Dr. Kathy Zang。实验所用野生型海七鳃鳗（Petromyzon marinus）幼体采自密歇根湖支流的溪流、宾夕法尼亚州的特拉华河以及缅因州的溪流中。

4至7龄幼虫体长为10至14厘米，体型足够进行损伤和解剖实验。将它们以每组52至100条的规模饲养在50加仑的淡水水箱中，水温保持在16摄氏度。

水箱需要铺设一英寸厚的砾石基质，以便七鳃鳗能够钻入其中。加入水箱的所有水都应使用活性炭过滤并曝气至少48小时后方可使用。只要动物在一年内使用，此操作过程中无需喂食。准备好 freshly prepared Ringer 溶液备用。

首先将鱼转移至饱和的苯佐卡因水溶液中。待其麻醉后，将其转移至一个装有一半硅胶颗粒的培养皿中。将培养皿置于冰上，并在培养皿上方覆盖冰块。

冰冷的林格液。用三根直径为0.15的昆虫针固定动物，一根固定在吻部，另两根固定在第五鳃处。然后将其置于体视显微镜下进行手术。

首先使用11号手术刀在第五鳃水平的背侧中线处做一纵向切口。此切口将暴露出脊髓。使用由昆虫针制成的两个钩子，并借助Castro第八号牵开器和剪刀，固定体壁。

在暴露的脊髓上做一垂直切割。检查脊髓的切端，以确保横断完全。然后使用镊子将切端重新对齐，并缝合伤口。

将七鳃鳗幼体转移到浸有林格氏液的滤纸上。将标本置于冰床上一小时，使伤口在一小时后干燥。随后将幼体转移至其独立的小型冰水容器中。

使其在该处愈合24小时。24小时后，检查横断部位是否有向头侧的运动。如果存在任何运动，则说明横断不完全。

如果没有出现上述情况，则表明横切操作成功，可在动物恢复期间将其转移至室温水箱中进行恢复。每两到三天更换一次水。当横切后的动物充分恢复后，将其麻醉，并按照前述方法进行解剖前准备。

解剖脑部时，首先在鼻孔与松果体器官之间做一横向切口。然后用 Castro 刀剪在固定动物的同时剪开脑周围组织。使用镊子。

脑干两侧的白色卵圆形结构为耳囊。暴露脑组织后，使用镊子去除脉络丛。接着，使用改良的针钩撑开动物头部，以暴露脑神经。

然后用镊子固定脊髓，同时用剪刀横向剪断脊髓。剪断脑神经以分离出脑组织。随后将脑组织转移至一小块硅胶上，并将其固定。

用一根昆虫针固定脊髓，另一根昆虫针穿过其中一个嗅球。然后使用剪刀，沿背侧中线切断两个嗅球之间的联合、大脑保护层联合以及脑干的 oex 结构。在切断联合和 oex 结构后，将 A LR 板向两侧展开，并用总共七根昆虫针将其平展固定在硅胶上：两根固定在嗅球，两根固定在大脑保护层联合切口边缘，两根固定在延伸的 oex 处，一根固定在脊髓中线位置。

现在使用无RNAs的试剂，在室温下用4%多聚甲醛轻轻振荡固定样品3小时。随后可通过原位杂交方法分析脑组织，采用所述方法检测新生成素（neogenin）转录本的表达。在对照动物和实验动物的脊髓及投射神经元中均检测到表达。此处显示的是损伤后两周的代表性未受伤对照样本。

完全脊髓横断后，neogen 受体的表达发生了变化。两周后，非对照组中的 neogen 受体优先在再生能力较差的神经元中表达，例如 M1 I 1 I 2 I 4 或 MTH 神经元。该技术的发展为我们能够在同一脑组织中同时研究导向受体、硫酸软骨素受体、蛋白聚糖受体以及金属蛋白酶活化状态的表达铺平了道路。