Name: 脂质双层囊泡代使用微流控喷射 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: 了解使用微流控喷射技术制备脂质双层囊泡的方法，该技术可精确控制膜不对称性、跨膜蛋白整合及物质封装，为研究区室化生物分子提供可靠的实验手段。

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感谢加州大学伯克利分校Fletcher实验室的Mike Vahey在微射流参数方面提供的建议。本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目DP2 HL117748-01支持。

1. 无限腔室的制备
<ol>
	<li>使用计算机辅助设计（CAD）软件设计无穷室（因其形状而得名），并保存为与激光切割机兼容的文件格式。要创建此形状，请将两个直径为 0.183 in&#160;的圆分离，圆心间距为 0.15 in。使用激光切割机从厚度为 1/8–3/16 in&#160;的透明丙烯酸板上切割出该无穷室。该无穷形状有助于液滴界面双层膜的形成与稳定。</li>
	<li>在丙烯酸室边缘向无穷形凹槽处钻一个直径为 1/16 in&#160;的孔，另一侧对称位置重复相同操作。使用剪刀或激光切割机从 0.2&#160;mm 厚的丙烯酸片上裁下一小块矩形片，作为凹槽的底部。</li>
	<li>在 0.2&#160;mm 丙烯酸片的一侧均匀涂覆一层薄而完整的快干胶，并将其粘接到腔室底部。将 0.2&#160;mm 丙烯酸片紧贴腔室底部固定，并在界面处施加胶水，使胶水形成密封，但避免覆盖观察区域。确保丙烯酸片边缘与腔室壁边缘齐平，并完全覆盖无穷室的切口部分。这将确保喷流充分穿透，并防止凹槽泄漏。</li>
	<li>裁剪两小块天然橡胶以覆盖钻孔。在孔周围涂上快干胶，将橡胶片覆盖在孔上，并用镊子压紧各部位以固定。对两个钻孔均重复此操作。确保所有粘接处均形成完整密封，防止任何泄漏。</li>
	<li>使用 23 G、1 in&#160;的针头在腔室两侧的天然橡胶上穿刺小孔，以便插入压电喷墨喷头。</li>
</ol>
2. 实验准备
将脂质储备溶液用氯仿溶解后，于 -20 °C 冰箱中保存。本研究中使用 1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（DPhPC）或 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（DOPC）。通常在本方案中配制 2 ml&#160;浓度为 25 mg/ml&#160;的脂质溶液，在 -20 °C 保存条件下可使用两个月。
<ol>
	<li>将脂质从储备小瓶转移至一个小玻璃瓶中，用氩气或氮气轻轻吹干，以在 n-癸烷中重悬脂质。干燥时将玻璃瓶倾斜放置，以增大与气体接触的表面积，从而加快脂质干燥速度。</li>
	<li>将瓶盖略微拧松，使干燥后的样品在干燥器中真空放置 1–2 小时。然后加入 n-癸烷，使脂质重新溶解至浓度为 25 mg/ml。短暂涡旋混合脂质溶液，并在水浴超声仪中超声 15 分钟。将重构后的脂质溶液于 -20 °C 保存在 n-癸烷中。</li>
	<li>配制蔗糖储备溶液。在 1.5 ml 微离心管中加入 900 µl 300 mM 蔗糖溶液和 100 µl 1% 甲基纤维素（MC）。添加甲基纤维素可增加溶液黏度，有助于喷射。可选步骤：可额外加入 1 µl 深色食用染料或荧光微珠，以分别增强成像时的对比度或荧光信号。该溶液为 300 mOsm 蔗糖溶液，旨在匹配细胞渗透压，并在微喷射过程中提供对比度。</li>
	<li>用一次性 1&#160;ml 塑料注射器吸取上述溶液。持注射器使针头朝上，反复轻弹针筒以使气泡向针头方向移动，并推动活塞排出 trapped 空气。务必在继续操作前彻底排除注射器内所有空气，否则将干扰负责喷射的压电元件正常收缩。</li>
	<li>在注射器末端安装一个 0.22 µm 滤器。为防止滤器内截留空气，将注射器垂直持握并推动活塞，直至针头前端形成一滴液体。注意：直径为 33&#160;mm 的注射器滤器单元效果最佳，但也可使用小至 3&#160;mm 直径的滤器以减少死体积。</li>
	<li>拧下喷墨装置的雌性鲁尔接头，将其牢固地压在滤器末端。再次排出液体以避免截留空气。旋紧喷墨装置顶部。完全安装后，液体应能流至喷墨装置的尖端。</li>
</ol>
3. 准备设备
<ol>
	<li>使用V型夹具将注射器组件固定在显微镜载物台上。将喷墨装置的导线连接至喷墨控制器。注意：本实验方案使用了定制的载物台；尽管载物台的设计可由用户自行决定，但必须确保对注射器具有独立的X-Y-Z方向控制，以及对样品 holder 具备X-Y方向控制。</li>
	<li>确定实现所需成像效果的放大倍数及必要的物镜组合。此处使用10倍物镜和10倍目镜。</li>
	<li>使用高速相机（≥1,000 fps）观察喷射过程及囊泡生成。成像前需完成必要的相机校准。利用相机软件中的基于图像的自动触发功能启动图像采集。</li>
	<li>将无限远腔室安装到显微镜载物台上，并用胶带将其固定在载物台指定位置。</li>
	<li>仔细将喷墨喷嘴与天然橡胶膜上的穿孔对齐（见图&#160;1b）。操作时，先将喷墨装置靠近腔室，通过肉眼初步调整位置，再通过显微镜物镜进行更精确的对准。操作需谨慎，粗调移动可能损坏喷墨喷嘴。</li>
	<li>喷墨装置对准后，将注射器组件从腔室后移，以避免加样过程中损坏喷墨装置。确保喷墨装置的移动为单向运动，以保持其与膜上小孔的对准状态。</li>
	<li>轻轻按压注射器组件的推杆，直至喷墨喷嘴处形成一小滴液滴，以提供初始的反向压力。</li>
	<li>输入喷射参数。对于梯形双极波形，使用以下参数：20 kHz脉冲频率、3 µsec上升时间、35 µsec脉冲持续时间、3 µsec下降时间、65 V施加电压（脉冲幅度）以及每次触发产生100个喷射脉冲（脉冲数量）。然而，可通过调节施加电压（脉冲幅度）和脉冲数量（每次触发的喷射脉冲数）来控制囊泡大小。</li>
</ol>
4. 囊泡生成
<ol>
	<li>在 infinity chamber 中加入 25–30 µl 溶于 n-十二烷的脂质溶液，覆盖两个孔的整个表面。</li>
	<li>将 25 µl 葡萄糖溶液（与蔗糖溶液等渗）缓慢而平稳地加至其中一个孔的最外侧边缘。由于葡萄糖溶液与脂质溶液不相混溶，加入后应形成液滴。在另一侧孔中同样加入 25 µl 葡萄糖溶液，将形成另一液滴，并在 5–10 分钟内在 chamber 中间形成脂双层膜。</li>
	<li>将喷墨探针穿过天然橡胶插入，小心引导其接近液滴界面双层膜。应缓慢接近双层膜，因为引入的喷墨探针会排开体积，可能导致双层膜破裂。</li>
	<li>当喷墨探针距离双层膜约 200 µm 时，按照步骤 3.8 中所述参数启动喷墨。喷墨距离双层膜的距离主要取决于电压和脉冲次数等参数。本方案建议逐步缓慢增加参数（电压和脉冲次数），并观察双层膜的形变情况。</li>
</ol>
5. 清洁设备
<ol>
	<li>将注射器组件从显微镜载物台上取下，并丢弃1&#160;ml塑料注射器和滤器。</li>
	<li>清洗喷墨头时，依次将喷嘴浸入以下溶液中各7-10次：70%乙醇、2% Neutrad溶液（溶于温水）、70%乙醇和ddH2O。若喷墨头无法牢固安装在吸液移液器上，可剪切移液器吸头以制作适配器。</li>
	<li>用纸巾干燥腔室。将infinity腔室放入盛有250&#160;ml含2% v/v Neutrad温水溶液的烧杯中，超声处理5-10分钟。超声后，在压缩空气下彻底干燥各孔。孔中残留的任何水分都可能影响脂双层膜的稳定性，因此建议将腔室置于60 °C烘箱中干燥15分钟。</li>
</ol>

<ol><li>Liu, A. P., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+under+construction%3A+in+vitro+reconstitution+of+cellular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Biology under construction: in vitro reconstitution of cellular function.</a> Nature reviews. Mol. Cell Biol. 10, 644-650 (2009).</li>
<li>Yeh, B. J., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biology%3A+lessons+from+the+history+of+synthetic+organic+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthetic biology: lessons from the history of synthetic organic chemistry.</a> Nat. Chem. Biol. 3, 521-525 (2007).</li>
<li>Richmond, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forming+giant+vesicles+with+controlled+membrane+composition%2C+asymmetry%2C+and+contents%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Soc.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Forming giant vesicles with controlled membrane composition, asymmetry, and contents.</a> Proc. Natl. Acad. Soc. U.S.A. 108, 9431-9436 (2011).</li>
<li>Liu, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-induced+bundling+of+actin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Phys%22%5BJournal%5D)">Membrane-induced bundling of actin filaments.</a> Nat. Phys. 4, 789-793 (2008).</li>
<li>Brown, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+tropicalis+egg+extracts+provide+insight+into+scaling+of+the+mitotic+spindle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Xenopus tropicalis egg extracts provide insight into scaling of the mitotic spindle.</a> J. Cell Biol. 176, 765-770 (2007).</li>
<li>Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Ries, J., Kruse, K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+regulators+for+bacterial+cell+division+self-organize+into+surface+waves+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spatial regulators for bacterial cell division self-organize into surface waves in vitro.</a> Science. 320, 789-792 (2008).</li>
<li>Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome+electroformation%5BTitle%5D)+AND+%22Faraday+Disc.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Liposome electroformation.</a> Faraday Disc. Chem. Soc. 81, 301-311 (1986).</li>
<li>Bucher, P., Fischer, A., Luisi, L. P., Oberholzer, T., Walde, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+Vesicles+as+Biochemical+Compartments%3A+The+Use+of+Microinjection+Techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Giant Vesicles as Biochemical Compartments: The Use of Microinjection Techniques.</a> Langmuir. 14, 2712-2721 (1998).</li>
<li>Shum, H. C., Lee, D., Yoon, I., Kodger, T., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+emulsion+templated+monodisperse+phospholipid+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Double emulsion templated monodisperse phospholipid vesicles.</a> Langmuir. 24, 7651-7653 (2008).</li>
<li>Matosevic, S., Paegel, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+Synthesis+of+Giant+Unilamellar+Vesicles+on+a+Microfluidic+Assembly+Line%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Stepwise Synthesis of Giant Unilamellar Vesicles on a Microfluidic Assembly Line.</a> J. Am. Chem. Soc. 133, 2798-2800 (2011).</li>
<li>Hu, P. C. C., Li, S., Malmstadt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Fabrication+of+Asymmetric+Giant+Lipid+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl.+Mater.+Inter%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Fabrication of Asymmetric Giant Lipid Vesicles.</a> ACS Appl. Mater. Inter. 3, 1434-1440 (1021).</li>
<li>Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+droplet+interface+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Asymmetric droplet interface bilayers.</a> J. Am. Chem. Soc. 130, 5878-5879 (2008).</li>
<li>Stachowiak, J. C., Richmond, D. L., Li, T. H., Brochard-Wyart, F., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inkjet+formation+of+unilamellar+lipid+vesicles+for+cell-like+encapsulation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Inkjet formation of unilamellar lipid vesicles for cell-like encapsulation.</a> Lab Chip. 9, 2003-2009 (2009).</li>
<li>Meleard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+unilamellar+vesicle+electroformation+from+lipid+mixtures+to+native+membranes+under+physiological+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Giant unilamellar vesicle electroformation from lipid mixtures to native membranes under physiological conditions.</a> Methods Enzymol. 465, 161-176 (2009).</li>
<li>Nishimura, K., Suzuki, H., Toyota, T., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+control+of+giant+unilamellar+vesicles+prepared+from+inverted+emulsion+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Colloid+Interface+Sci%22%5BJournal%5D)">Size control of giant unilamellar vesicles prepared from inverted emulsion droplets.</a> J. Colloid Interface Sci. 376, 119-125 (2012).</li>
<li>Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+Microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Droplet Microfluidics.</a> Lab Chip. 8, 198-220 (2008).</li>
<li>Stachowiak, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unilamellar+vesicle+formation+and+encapsulation+by+microfluidic+jetting%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4697-4702 (2008).</li>
<li>Osaki, T., Yoshizawa, S., Kawano, R., Sasaki, H., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid-coated+microdroplet+array+for+in+vitro+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Lipid-coated microdroplet array for in vitro protein synthesis.</a> Anal. Chem. 83, 3186-3191 (2011).</li>
<li>Liu, A. P., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+polymerization+serves+as+a+membrane+domain+switch+in+model+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Actin polymerization serves as a membrane domain switch in model lipid bilayers.</a> Biophys. J. 91, 4064-4070 (2006).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

人们已开发出多种囊泡制备技术，包括电形成法、乳化法以及液滴生成法14-16。然而，仍需发展新的实验技术，以实现对生物系统的设计，使其越来越接近真实的生命系统。特别是微流控方法，能够在膜的单层性、尺寸的单分散性以及内部成分的控制方面提供更高水平的精确调控17,18，从而使囊泡模型更接近生物学真实情况。此外，利用微流控喷射技术进行的表征与实验已证实，可有效实现定向膜蛋白的整合、膜的不对称性以及物质的包封3,13。
该技术操作简便，但在某些步骤中需格外谨慎。在制备过程中，丙烯酸板和天然橡胶必须与 infinity chamber 完全密封，否则 infinity 形微室将发生泄漏，从而影响双层膜的稳定性。在实验准备阶段，研究人员必须确保在初始阶段以及每次连接组件后，彻底排除注射器组件中的空气。组件内的气泡会在射流中形成可压缩空间，削弱甚至完全抵消压电驱动器的喷射效果。在设备准备过程中，主要风险是损坏脆弱的喷墨喷嘴。最后，在囊泡生成前的步骤中，需特别注意葡萄糖的沉积，因为这一步骤将形成后续喷射所依赖的脂质双层膜。
<...

细胞生物学是一个涉及从分子到细胞多层次整合理解的多尺度问题，这一点已变得越来越明确。因此，仅了解分子各自如何精确发挥作用，还不足以理解复杂的细胞行为。这部分是由于多组分系统存在涌现性行为，例如肌动蛋白网络与脂质双层囊泡的重构相互作用4、非洲爪蟾（Xenopus）提取物中有丝分裂纺锤体的组装5，以及细菌细胞分裂机制的空间动态过程6。为了补充还原论者对生命系统分子过程进行拆解研究的方法，一种可行的替代策略是采用最少数量的生物组分来重构细胞行为。该策略的关键环节之一，是将生物分子可靠地封装在有限的空间体积内，这正是细胞的一个重要特征。
目前存在多种用于包封生物分子以研究仿生系统的策略。其中生物学相关性最高的系统是脂质双层膜，可模拟细胞质膜所施加的生化与物理限制。通过电形成法（electroformation）7 制备巨大单层囊泡（GUVs）是目前最广泛使用的 GUV 制备技术之一14&#160;，但由于该方法与高盐缓冲液不兼容，通常包封效率较低8。此外，电形成法需要较大的样品体积（&#62;100 μl），在使用纯化蛋白时可能带来困难，且由于脂质层间距较小，大分子难以扩散，导致包入效率低下。目前已开发出多种用于生成脂质囊泡的微流控方法。其中双乳液法需使组分依次穿过水-油-水（W/O/W）两相界面，依赖挥发性溶剂的蒸发驱动脂质双层的形成9。另有研究采用微流控装配线，可连续生成脂质双层囊泡10，或分两个独立步骤完成生成过程11。我们开发了一种替代技术，该方法基于在液滴界面双层上快速施加流体脉冲12，以制备尺寸、组分和包封效率可控的 GUVs。我们称之为微流控喷射（microfluidic jetting）的方法，综合了多种现有囊泡制备技术的优势，为构建功能性生物分子系统以研究多种生物学问题提供了有效途径。

<table><tbody><tr><td>压电喷墨</td><td>MicroFab Technologies</td><td>MJ-AL-01-xxx</td><td>xxx 表示喷嘴直径，单位为微米</td></tr><tr><td>Jet Drive III 控制器</td><td>MicroFab Technologies</td><td>CT-M3-02</td><td></td></tr><tr><td>高速相机</td><td>Vision Research</td><td>MiroEX2</td><td></td></tr><tr><td>氯仿中的 DPhPC 脂质</td><td>Avanti</td><td>850356C</td><td>以小份量分装于小瓶中订购</td></tr><tr><td>33 mm PVDF 滤膜，0.2 &amp;micro;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>SLGV033RS</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 注射器</td><td>Fisher Scientific</td><td>14823434</td><td></td></tr><tr><td>正癸烷</td><td>Acros Organics</td><td>111871000</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Acros Organics</td><td>410950010</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903-1KG</td><td></td></tr><tr><td>甲基纤维素</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9084958</td><td></td></tr><tr><td>1/8 英寸丙烯酸板</td><td>McMaster Carr</td><td>8560K239</td><td>infinity 形微流控腔室的 CAD 设计图可应要求提供</td></tr><tr><td>0.2 mm 丙烯酸板</td><td>Astra Products</td><td>Clarex clear 001</td><td></td></tr><tr><td>丙烯酸胶水</td><td>TAP Plastics</td><td>10693</td><td></td></tr><tr><td>Loctite 495 瞬干胶</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9011323</td><td></td></tr><tr><td>Loctite 3494 紫外增强型胶粘剂</td><td>Strobels Supply</td><td>30765</td><td></td></tr><tr><td>天然橡胶</td><td>McMaster Carr</td><td>85995K14</td><td></td></tr><tr><td>定制样品台</td><td>自制</td><td>N/A</td><td>CAD 设计图可应要求提供</td></tr></tbody></table>

利用微流控喷射技术生成脂质双层囊泡

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

自下而上的合成生物学为研究和重建生物化学系统，乃至构建最简生命体，提供了一种全新的方法。这一新兴领域融合了工程学、化学、生物学和物理学的研究人员，致力于从基础生物元件出发，自下而上地设计并组装成复杂且具有功能的生物系统。这类自下而上的系统有望推动人工细胞的发展，用于基础生物学研究以及创新疗法1,2。巨型单层囊泡（GUVs）因其具有类似细胞的膜结构和尺寸，可作为合成生物学的理想模型平台。微流体喷射技术（microfluidic jetting），又称微喷射技术，能够精确控制GUVs的尺寸、膜组成、跨膜蛋白的整合以及内含物的封装3。该方法的基本原理是利用压电驱动的喷墨装置产生多个高频液流脉冲，使悬浮的脂双层发生形变，进而形成GUVs，其过程类似于从皂膜中吹出肥皂泡。通过调节喷射溶液的组成、周围溶液的成分和/或脂双层中包含的组分，研究人员可利用该技术制备定制化的囊泡。本文描述了通过微喷射技术从液滴界面双分子层制备简单囊泡的实验流程。

我们在一台常规的倒置荧光显微镜上搭建了一个微流控喷射装置，其定制载物台由机械加工部件和手动微米尺构成（图1）。对喷墨过程的表征有助于理解囊泡生成机制。喷墨喷嘴与脂质双层之间的距离变化会影响施加在膜上的力，从而引起膜的形变。当喷嘴更接近双层膜时，可使喷流更加集中，并防止能量在囊泡生成位点以外耗散。涡流的传播距离随压电驱动器所施加电压的增加而增大，这与我们的预期一致（图2）。囊泡形成过程及典型的喷射囊泡如图3所示。图3a展示了通过微喷射形成囊泡的代表性图像序列。囊泡形成后，其稳定性通常随囊泡直径变化，较小的囊泡更稳定。
<img alt="用于油滴操控的微流控装置，采用喷墨喷嘴和显微镜平台。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51510/51510fig1highres.jpg" src="/files/ftp_...

通过微流控喷射技术作用于液滴界面脂双层，可可靠地生成具有可控膜不对称性、跨膜蛋白整合及物质包封能力的囊泡。该技术可用于研究多种需要区室化生物分子的生物系统。

自下而上的合成生物学为研究和重建生物化学系统以及潜在的最简生命体提供了一种全新的方法。

本实验的总体目标是制备具有更高膜控制性、非对称性、摩尔浓度、单分散性以及可控内含物的磷脂双分子层囊泡。利用计算机辅助设计（CAD），由丙烯酸板和天然橡胶加工制造一个腔室。通过向该腔室内加载脂质和溶液，形成悬浮的脂质双层膜。接下来，将含有待包封溶液的喷墨装置安装至喷射设备上。一旦设定好适当的参数，喷射出的液体脉冲即可形成脂质双分子层囊泡。最终，微流控喷射技术可重复地生成单分散的双分子层囊泡。与现有的电形成、乳化或液滴生成等方法相比，该技术的主要优势在于能够更精确地控制膜的特性、单侧摩尔浓度、单一分散性以及内部成分。演示该实验流程的是来自实验室的研究生 Johanna Harrow，协助操作的是本科生 Kara Patel。使用 CAD 软件设计一个腔室形状，该腔室可通过激光切割机从亚克力材料上加工而成；首先在组装好的亚克力腔室两侧各钻一个 1/16 英寸的通孔，用于连接至 infinity 形状的储液井。第二步，使用剪刀从一块0.2毫米厚的亚克力板上裁下一小块矩形，作为infinity型微流控芯片的底部。使用快干胶将该亚克力片牢固固定到位，注意避免将胶水沾到观察区域。亚克力片应与腔室侧壁齐平，并牢固粘接在腔室底部。第三，使用快干胶将一小片天然橡胶片粘贴在钻好的孔上，用镊子将其压紧固定。测试所有粘合接缝是否漏气。不应有任何残留物。最后，使用23号针头通过已钻好的孔在橡胶上穿孔，压电喷墨针头将通过这些孔插入。储备的磷脂应溶解于氯仿中，并在-20°C下保存。D-P-H-P-C 或 DOPC。本演示中使用了脂质。将溶解在氯仿中的脂质转移至玻璃小瓶中，转移时将小瓶倾斜放置，然后在氩气或氮气氛围下轻轻干燥脂质。然后将小瓶的瓶盖略微松开，在真空条件下放置一至两小时，以去除残留溶剂。此步骤也可使用干燥器完成。现在用末端溶剂溶解脂质，使脂质的终浓度为 25 毫克/毫升。涡旋溶液。用石蜡短暂封住瓶盖，然后超声处理15分钟。将该溶液在-20摄氏度下保存。接下来，配制具有生理渗透压的蔗糖储备溶液，作为喷射溶液。可考虑向溶液中加入一滴深色食用染料或荧光微球，以增强对比度或产生荧光。用1毫升注射器吸取蔗糖溶液以去除截留的空气。轻弹注射器，使任何气泡上升至接头开口处并排出。接着，将一个33毫米、0.22微米的滤器连接到注射器上，并通过滤器推出一滴溶液。现在拧下喷墨装置的雌性引诱剂接头，将其压到滤器末端。推出少量液体以排除任何滞留的气泡。最后，将注射器连接到喷墨装置液体的顶部。如果注射器已正确安装，则应使墨水喷嘴移动到位。首先，将注射器组件安装到显微镜载物台上，并为此实验连接好喷墨控制器。载物台和注射器需要独立控制，两者均需在三个维度上移动以实现可视化。设置一台高速相机，其拍摄速度至少达到每秒1000帧。将相机设置为使用基于图像的自动触发模式以启动录像。现在，用胶带将腔室固定在载物台上，并仔

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脂质双层囊泡代使用微流控喷射

本方案描述了一种用于制备亚微米尺寸且高度均一的脂质体囊泡的挤出方法。该方法采用压力可控的系统，并通过控制氮气流速来制备脂质体。本文将介绍脂质体制备1,2、脂质体挤出及粒径表征方法。...

用于制备纳米级脂质囊泡的恒压控制挤出法

支撑脂双层和天然膜颗粒是可模拟细胞膜特性的便捷体系，可被整合到多种分析策略中。本文展示了一种制备微阵列的方法，该微阵列由涂覆有支撑脂双层的SiO2微珠、磷脂囊泡或天然膜颗粒组成。...

采用刮刀式组装方法制备生物膜微阵列

我们介绍一种制备支撑脂双层的方案，并利用原子力显微镜和力谱技术对其进行表征。...

原子力显微镜成像与支持性脂双层的力谱分析

本文展示了蛋白质功能化的平面玻璃支持脂双层的制备、蛋白质在脂双层内的流动性测定以及蛋白质密度的测量方法。同时概述了构建低噪声全内反射显微镜的路线图，该显微镜能够以高时空分辨率对脂双层中单个荧光染料分子进行可视化观察。...

单分子荧光显微镜在平面支撑双层膜上的应用

我们展示了一种可储存、可运输的脂双层形成系统。当冷冻的膜前体恢复至室温后，可在1小时内形成脂双层膜，成功率超过80%。该系统将减少与离子通道研究相关的繁琐操作和对专业技术的依赖。...

使用聚二甲基硅氧烷薄膜自动形成脂双层膜

本文介绍了一种基于微流控平台的支撑脂双层，用于通过基于pH调节的无标记方法研究蛋白质与磷脂酰肌醇之间的相互作用。...

基于芯片的PIP研究：蛋白质-磷脂酰肌醇相互作用的无标记分析

本方案描述了模拟细胞的单脂质和多脂质囊泡、支撑脂双层以及悬浮脂双层的制备方法。这些 体外 模型可进行调整以包含多种脂质类型，并可用于研究各种分子和大分子间的相互作用。...

用于研究分子相互作用的模拟细胞支撑及悬浮脂双层模型的构建

本文介绍了一种利用单分子全内反射荧光（smTIRF）显微镜技术，在人工拥挤的脂质膜上对单个分子的结合、运动性和组装行为进行观测与分析的实验方案。...

单分子在聚合物拥挤的脂质膜上的扩散与组装

本方案描述了辛醇辅助脂质体组装（OLA）技术，这是一种用于生成生物相容性脂质体的微流控方法。OLA...

芯片上辛醇辅助脂质体组装用于生物工程

本文介绍了一种基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的双层装置的制备方法，用于在油包水乳液（液滴）中生成组合文库。方案中详细描述了实现液滴自动化生成所需的硬件和软件，并展示了荧光液滴定量文库的制备过程。...

用于组合式液滴生成的双层微流控装置

本文介绍了一种制备具有囊泡内嵌囊泡结构的复合型巨大单层囊泡（cGUVs）的方法，可定制其内层、环形间隙及外层区域的电导率。通过电形成法合成简单的GUVs，再经渗透冲击将其转化为口形体和cGUVs，为研究有核细胞的生物物理特性提供了有价值的模型。...

合成复合型巨大单层囊泡：一种模拟有核细胞的生物仿生模型

了解使用微流控喷射技术制备脂质双层囊泡的方法，该技术可精确控制膜不对称性、跨膜蛋白整合及物质封装，为研究区室化生物分子提供可靠的实验手段。

利用微流控喷射技术生成脂质双层囊泡

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