Name: 小鼠异位心脏移植技术 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-08T23:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: 学习小鼠异位心脏移植技术，掌握供体心脏获取、动静脉吻合及术后每日触诊监测等关键步骤。该方法为移植生物学研究提供了可靠的手术模型。

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作者感谢 Biagio Pietra 博士在我们实验室所做的前期工作。

所有动物均在科罗拉多大学芭芭拉·戴维斯中心动物设施内，根据IACUC批准，在无病原体条件下饲养，并按照美国国立卫生研究院（NIH）指南进行护理。
麻醉深度最初通过夹捏脚趾反应来判断，一旦操作开始，则通过观察呼吸频率来评估。
1. 供体心脏获取
<ol>
	<li>通过腹腔注射戊巴比妥（60 mg/kg）使供体小鼠麻醉。</li>
	<li>使用四点固定法固定小鼠并剪除毛发，用酒精擦拭皮肤。</li>
	<li>剥离皮肤后，在膈肌下方稍低处作一横向切口，打开腹腔。</li>
	<li>在肋骨附着点后方剪开膈肌，将前胸壁向前上方提起，暴露心脏。</li>
	<li>沿左右两侧后外侧胸腔向上作全层切开，直至胸腔顶部。</li>
	<li>游离下腔静脉（IVC），并在其汇入右心房附近放置一根松绕的5-0丝线缝线。</li>
	<li>向IVC内注射1.0 cc的4 °C肝素化生理盐水（200 u/cc），随后用5-0丝线结扎该血管并切断。</li>
	<li>以类似方式游离右上腔静脉（rSVC），用5-0丝线结扎并切断。</li>
	<li>轻柔地将心脏向动物右侧翻转，游离左上腔静脉（lSVC），用5-0丝线结扎并切断，从而暴露左肺动脉。</li>
	<li>用湿纱布覆盖并固定心脏，同时钝性分离胸腺，使其脱离主肺动脉（PA）及左、右PA分支和升主动脉弓。</li>
	<li>钝性游离主动脉弓周围组织。使用显微剪刀在右头臂动脉近端处切断主动脉；i.e. 从心脏到主动脉切断点之间应无任何分支。</li>
	<li>此段主动脉弓将作为移植过程中的动脉套管。</li>
	<li>将主动脉套管向下翻折，以暴露肺动脉干及左、右PA分支。</li>
	<li>尽可能远离心脏处钝性游离左、右PA分支，以便于后续轻松分离肺动脉干周围组织。</li>
	<li>尽可能远端切断肺动脉干，切口位于其分叉点近端。此段肺动脉将作为移植过程中的静脉套管。</li>
	<li>在心脏基底部环绕并结扎一根5-0丝线，将心脏从基底切断后置于4 °C生理盐水中。总获取时间约为10–15分钟。</li>
</ol>
2. 心脏移植技术
<ol>
	<li>使用戊巴比妥钠对受体小鼠进行麻醉（初始剂量为60 mg/kg，腹腔注射；必要时追加25 mg/kg，腹腔注射）。</li>
	<li>剪除腹部毛发，使用四点固定法固定小鼠，并用聚维酮碘消毒皮肤，无菌铺巾。</li>
	<li>沿腹中线做一条长约2 cm的垂直切口，进入腹腔。</li>
	<li>将肠管向上牵拉并移至胸部区域，全程用无菌湿纱布（含无菌生理盐水）包裹以保持湿润。</li>
	<li>在肾血管下方分离腹主动脉和下腔静脉（IVC），并在吻合部位的上方和下方分别绕置4-0棉线结扎线。</li>
	<li>识别术区内的任何腰动脉，并使用10-0尼龙缝线结扎。</li>
	<li>结扎棉线，先结扎下方线结，再结扎上方线结，以使部分血液保留在主动脉内，便于后续主动脉切开。</li>
	<li>使用30 G针头刺入主动脉管腔，形成初始切口，再用精细显微剪刀沿血管纵轴方向将切口延长至约2 mm，切口应呈直线。</li>
	<li>将供体主动脉与受体主动脉行端侧吻合，操作如下：在供体主动脉和受体主动脉切口的下角处各置一针10-0尼龙缝线作为固定牵引线并打结；在供体主动脉的对侧与受体主动脉切口的上角处再置第二针10-0尼龙缝线并打结。</li>
	<li>从上至下在主动脉侧壁行连续缝合，并与先前放置的固定牵引线打结。缝合时应确保内膜（血管内表面）对合良好。随后以连续缝合法缝合内侧壁并打结。每侧的第一针和最后一针应尽可能靠近固定牵引线，两固定线之间均匀分布3针，共5针。</li>
	<li>将供体肺动脉与受体下腔静脉（IVC）行端侧吻合，操作如下：使用30 G针头穿刺下腔静脉，再用精细显微剪刀沿血管纵轴方向将切口延长约2 mm，切口应呈直线。</li>
	<li>使用10-0尼龙缝线将供体肺动脉与下腔静脉切口的下角结扎固定；在供体动脉对侧与下腔静脉切口的上角处再置第二针10-0尼龙缝线并打结。&#160;</li>
	<li>在肺动脉与下腔静脉之间行连续缝合并打结。每侧的第一针和最后一针应尽可能靠近固定牵引线，两固定线之间均匀分布5针，共7针。</li>
	<li>松开远端的4-0棉线，恢复静脉血流。</li>
	<li>观察静脉吻合口止血情况后，逐渐松开近端的4-0棉线，观察动脉吻合口是否止血。当确认两个吻合口均稳固无出血后，移除所有棉线。</li>
	<li>将肠管还纳至腹腔，以5-0丝线连续缝合方式分两层关闭腹壁。</li>
	<li>关闭腹腔时，向腹腔内注射1.0 ml无菌温生理盐水作为液体复苏；术后皮下注射0.8 ml生理盐水。术中无需其他支持措施。将动物置于保温毯上恢复。初学者的总移植时间约为90–120分钟，熟练者约为45–60分钟&#160;。手术开始时皮下注射布托啡诺镇痛剂（0.05 mg/kg，0.1–0.2 ml），术后每6–12小时重复一次，持续72小时。&#160;&#160;</li>
</ol>
3. 移植物评估
<ol>
	<li>通过经腹触诊每日评估移植物功能。</li>
	<li>将小鼠固定，如同进行腹腔注射的姿势。</li>
	<li>用食指 fingertip 轻柔按压腹壁，评估移植物搏动的强度与节律性。</li>
	<li>根据触诊质量评分，从 4 分（正常振幅与频率）到 0 分（无搏动、移植物排斥）。</li>
</ol>
重要提示：
所有器械均经过灭菌处理，操作过程中佩戴无菌手套，并维持无菌区域。供体与受体手术均在手术显微镜下进行。确保吻合口“干净”，即缝合时避免缝到血管后壁，否则将导致血流严重受阻，极有可能造成移植失败，极端情况下甚至引发后肢瘫痪。至关重要的是，缝合针必须穿透包括血管外膜和内膜在内的全层组织。缝合边缘外翻可确保内膜与内膜接触，有助于吻合口的封闭与愈合。另一个关键因素是确保吻合缝线的张力处于最佳状态：过松会导致不可逆的渗漏，过紧则会引起血流狭窄。若发生在动脉侧，将导致移植物灌注不良；若发生在静脉侧，则会引起心脏淤血。

<ol><li>Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+transplantation+in+congenic+strains+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Heart transplantation in congenic strains of mice.</a> Transplant Proc. 5 (1), 733 (1973).</li>
<li>Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primarily+vascularized+allografts+of+hearts+in+mice.+The+role+of+H-2D%2C+H-2K%2C+and+non-H-2+antigens+in+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H-2K, and non-H-2 antigens in rejection.</a> Transplantation. 16 (4), 343 (1973).</li>
<li>Niimi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+technique+for+heterotopic+cardiac+transplantation+in+mice%3A+experience+of+3%2C000+operations+by+one+surgeon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Heart+Lung+Transplant%22%5BJournal%5D)">The technique for heterotopic cardiac transplantation in mice: experience of 3,000 operations by one surgeon.</a> J Heart Lung Transplant. 20 (10), 1123 (2001).</li>
<li>Plenter, R. J., Zamora, M. R., Grazia, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four+decades+of+vascularized+heterotopic+cardiac+transplantation+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Surg%22%5BJournal%5D)">Four decades of vascularized heterotopic cardiac transplantation in the mouse.</a> J Invest Surg. 26 (4), 223 (2013).</li>
<li>Su, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+suture+technique+in+a+mouse+heart+transplant+model%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+J+Surg%22%5BJournal%5D)">Modified suture technique in a mouse heart transplant model.</a> Asian J Surg. 34 (2), 86 (2011).</li>
<li>Mao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+and+knotless+technique+for+heterotopic+cardiac+transplantation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Heart+Lung+Transplant%22%5BJournal%5D)">A novel and knotless technique for heterotopic cardiac transplantation in mice.</a> J Heart Lung Transplant. 28 (10), 1102 (2009).</li>
<li>Csencsits, K. L., Bishop, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrasting+alloreactive+CD4%2B+and+CD8%2B+T+cells%3A+there%27s+more+to+it+than+MHC+restriction%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Contrasting alloreactive CD4+ and CD8+ T cells: there's more to it than MHC restriction.</a> Am J Transplant. 3 (2), 107 (2003).</li>
<li>Hasegawa, T., Visovatti, S. H., Hyman, M. C., Hayasaki, T., Pinsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotopic+vascularized+murine+cardiac+transplantation+to+study+graft+arteriopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Heterotopic vascularized murine cardiac transplantation to study graft arteriopathy.</a> Nat Protoc. 2 (3), 471 (2007).</li>
<li>Linfert, D., Chowdhry, T., Rabb, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocytes+and+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Rev%22%5BJournal%5D)">Lymphocytes and ischemia-reperfusion injury.</a> Transplant Rev. 23 (1), (2009).</li>
<li>Grazia, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+cardiac+allograft+rejection+by+directly+cytotoxic+CD4+T+cells%3A+parallel+requirements+for+Fas+and+perforin%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Acute cardiac allograft rejection by directly cytotoxic CD4 T cells: parallel requirements for Fas and perforin.</a> Transplantation. 89 (1), 33 (2010).</li>
<li>Liu, F., Kang, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotopic+heart+transplantation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Heterotopic heart transplantation in mice.</a> J Vis Exp. (6), (2007).</li>
<li>Plenter, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotopic+heart+transplantation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22European+Society+for+Surgical+Research.+45th+Annual+Congress%22%5BJournal%5D)">Heterotopic heart transplantation in mice.</a> European Society for Surgical Research. 45th Annual Congress. , (2010).</li>
</ol>

作者无披露事项。

该手术技术不易掌握，但一旦掌握便成为一种强大的研究工具。研究者/外科医生通过技术的一致性和对细节的关注获得回报。学习阶段的耐心至关重要。根据Niimi3的报道，借助基于视频的学习工具，平均需要11次尝试才能完成首次成功的手术操作，需要78次尝试才能达到90%的成功率。视频现已成为外科教学的重要工具11,12。
故障排除
吻合口可能发生出血，这通常是由于缝线张力不足或缝线数量过少所致。虽然使用明胶海绵等促凝剂有助于减少渗漏，但我们建议外科医生应依赖良好的手术技术。心脏充血且无搏动最常见于吻合口过紧，尤其是静脉侧过紧。移植物无搏动且无灌注通常是由进入冠状动脉之一的气泡所引起。保持湿润至潮湿的术野对于防止气泡进入血管至关重要。

技术的局限性
如果研究者希望研究对完全正常功能心脏的影响，则该技术不适用。这需要采用原位移植技术，而迄今为止该技术已被证明无法实现。
相对于现有方法的意义
如果希望研究完全血管化的实体器官移植对小鼠的影响，心脏移植模型可能是最易于掌握的。尽管小鼠的肺、肾和肝移植模型确实存在，但这些模型的学习和精通难度要大得多。
实验方案中的关键步骤
必须确保缝合针穿透包括血管外膜和内膜在内的全层组织，这一点至关重要。边缘外翻还可保证内膜与内膜之间的接触，有助于吻合口的封闭和愈合。另一个至关重要的因素是确保吻合缝线的张力处于最佳状态：过松会导致不可逆的渗漏，过紧则会引起管腔狭窄。若发生在动脉侧，将导致移植物灌注不良；若发生在静脉侧，则会引起心脏淤血。
最重要的是，重复实验、保持操作的一致性以及持续关注细节，将产生出色的结果，并获得可资助和可发表的数据。

在一个能够对小鼠进行肾、肺、肝和胰腺移植的时代，自1973年以来作为基础器官移植与免疫学研究基石的，仍然是小鼠异位心脏移植模型1-4。在此期间，已有多篇论文发表，详细阐述了对该手术技术的改进与优化5,6。
作为主要由血管化供血的实体器官移植模型，该手术方法首屈一指。一旦掌握，该技术可用于同种异体排斥反应7、慢性血管病变的形成8以及缺血再灌注损伤机制9的研究。
成功掌握该手术操作的关键与其他外科手术一样，需要指导者和受训者具备耐心，并注重细节。在学习初期，新手外科医生会发现每次移植手术都需要花费大量时间。随着经验的积累，手术时间将显著缩短，从而大幅减少缺血时间。只要关注每一步操作的细节，最终必将取得成功。
尽管指导教师会尽力传授并预见到这些手术过程中可能遇到的所有潜在陷阱，但富有“创造性”的学员仍可能会发现一些他们自己独有的问题！
该手术的基本步骤如下：将供体升主动脉弓以端侧吻合的方式连接至受体腹主动脉，同时将供体肺动脉以端侧吻合的方式连接至受体下腔静脉（IVC）。血液从受体主动脉逆向流经供体主动脉，进入冠状动脉。当血液流经冠状循环系统后，经冠状窦回流至右心房，随后被泵入右心室，并通过肺动脉进入受体下腔静脉。通过这种方式，冠状循环系统获得动脉血供，且在再灌注后1–2分钟内，移植物即可恢复窦性心律。由于心脏左心腔基本处于低压负荷状态，左心室游离壁会随时间推移逐渐发生萎缩。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;仪器&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Roboz 编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Fine Science Tools 编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Arosurgical 编号&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>直头显微解剖镊 #5</td><td>RS-5015</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>弯头显微解剖镊 #7</td><td>RS-5047</td><td>11297-00</td><td></td></tr><tr><td>弯头带齿镊</td><td>RS-5137</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>Vannas 显微解剖剪，短头</td><td>RS-5610</td><td></td><td>09.140.08</td></tr><tr><td>显微解剖剪，直头，锐利，长头</td><td></td><td>11.602.11</td><td></td></tr><tr><td>微型弹簧手柄持针器</td><td></td><td></td><td>11.549.15</td></tr><tr><td>直头蚊式钳</td><td></td><td>91308-12</td><td></td></tr><tr><td>显微解剖剪，直头，钝头</td><td>RS-5962</td><td>14078-10</td><td></td></tr><tr><td>显微解剖剪，弯头，钝头</td><td>RS-5981</td><td>14079-10</td><td></td></tr><tr><td>微型牵开器</td><td>RS-6540</td><td></td><td></td></tr><tr><td>器械托盘，10&amp;rdquo; x 6 &amp;frac12;&amp;rdquo; x &amp;frac34;&amp;rdquo;</td><td>RT-1350S</td><td></td><td></td></tr><tr><td>丝线缝合线，5/0，22.5 米卷装</td><td></td><td>18020-50</td><td></td></tr><tr><td>10/0 尼龙线</td><td></td><td></td><td>T4A10Q07</td></tr><tr><td>5/0 丝线</td><td></td><td></td><td>E19A05N</td></tr><tr><td>手套</td><td></td><td>Medex Supply 提供的 Biogel 手套</td><td></td></tr><tr><td>手术巾</td><td></td><td>Precept，编号 #64-9012-9</td><td></td></tr><tr><td>注射器</td><td></td><td>B-D 1 cc 胰岛素注射器，编号 #329424</td><td></td></tr><tr><td>棉签</td><td></td><td>Fisher 品牌，编号 #23-400-100</td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘棉片</td><td></td><td>PDI，编号 #B40600</td><td></td></tr><tr><td>4/0 棉线结扎线</td><td></td><td></td><td>与器械一同高压灭菌的国产棉线</td></tr></tbody></table>

小鼠异位心脏移植技术

Murine Heterotopic Heart Transplant Technique

自Corry、Wynn和Russell首次报道该技术以来，至今已有四十多年。尽管其他实验室经过数年才逐步掌握并应用该技术，但如今该技术已被全球众多实验室广泛使用。2001年，Niimi对该原始技术进行了重要改进并予以报道。本文所述的技术是在本中心三位外科医生（Plenter、Grazia、Pietra）手中历经十余年不断发展而形成的。这些技术目前正在传承给新一代的外科医生和研究人员。
在很大程度上借鉴了Niimi的经验，我们所采用的操作流程在细微之处已有所发展和完善——这些细节内容我们将力求在此清晰呈现，以便其他研究者能够更好地应用这一非常有价值的模型。与Niimi一样，我们发现视频辅助学习对于初学者而言是一种极为宝贵的资源。

利用该手术技术可开展简单的移植物存活/排斥研究，也可实施相当复杂的实验方案。在下图简要描述的研究中，我们旨在明确Fas和/或穿孔素是否参与CD4 T细胞介导的心脏移植排斥反应的机制。这一研究得益于当今可获得的种类繁多的小鼠品系。结果表明，CD4效应T细胞对心脏同种异体移植物的直接排斥需要移植物Fas表达与T细胞穿孔素表达的共同作用。据我们所知，这是首次证明CD4 T细胞的细胞溶解活性在初次急性同种异体移植物排斥中具有不可或缺的作用。

关键词：手术技术，移植物排斥，CD4 T细胞，心脏移植，Fas，穿孔素，小鼠品系，细胞溶解活性，同种异体移植物 体内
<img alt="Kaplan-Meier 生存曲线；移植物存活率百分比 vs. CD4 T细胞移植后天数；免疫学研究。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51511/51511fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51511/51511fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图1. 穿孔素和Fas是CD4 T细胞介导心脏移植排斥反应的必需且平行的两条通路 采用B6、B6 PFPKO（穿孔素基因敲除）以及B6gld（Fas配体缺陷型）的CD4 T细胞，分别重建接受C3H野生型或Fas缺陷型C3Hlpr心脏异体移植物的B6rag-/-受体小鼠。仅从供体心脏中去除Fas（♦，与对照组野生型C3H + B6 CD4 T细胞相比，p=NS），或仅从CD4 T细胞中去除穿孔素（■，与对照组野生型C3H + B6 CD4 T细胞相比，p=NS），均未能阻断排斥反应的发生。有趣的是，从效应性CD4 T细胞中去除FasL可显著延迟排斥反应（●，与野生型C3H + B6 CD4 T细胞相比，p &lt; 0.02；与野生型C3H + B6 PFPKO CD4 T细胞相比，p &lt; 0.01；与C3Hlpr + B6 CD4 T细胞相比，p &lt; 0.01）。然而，大多数移植物仍最终被排斥（5例中4例）。重要的是，同时去除供体Fas和CD4 T细胞中的穿孔素，则完全阻断了排斥反应（○，与对照组野生型C3H + B6 CD4 T细胞、野生型C3H + B6 PFPKO CD4 T细胞以及C3Hlpr + B6 CD4 T细胞相比，p &lt; 0.002）。这种阻断效应显著强于单独去除CD4 T细胞FasL的情况（○，与对照组野生型C3H + B6gld CD4 T细胞相比，p &lt; 0.003）。引自Grazia et al10。经许可转载。

该论文描述了在小鼠中进行异位心脏移植所需的步骤。

距Corry、Wynn和Russell首次报道该技术至今已有四十多年。尽管其他实验室花费了数年时间才逐步采用……

本实验的总体目标是实施并评估小鼠异位心脏移植的健康状况。首先，需仔细摘取供体心脏；第二步，通过手术在受体动物体内构建移植部位，以提供足够的空间来植入供体组织。接下来，通过建立动脉和静脉吻合来移植供体心脏。最后一步是在关闭受体胸腔前确认血管缝合线的止血情况。最终，可通过每日触诊监测移植物的健康状况，以评估各种因素对供体移植物存活的影响。该方法的可视化演示至关重要，因为吻合步骤难以掌握。缝线的张力必须恰到好处，以避免泄漏和血流受阻。获取供体心脏时，首先使用四点固定法将麻醉后的供体动物固定不动。剪去毛发后，用酒精擦拭皮肤。剥离皮肤后，在膈肌下方稍低位置做一横向切口。为打开腹腔，需在肋骨附着点后方切开膈肌。充分切开全层，在胸部冰的左右两侧后外侧胸腔进行切开，游离下腔静脉（IVC），然后在下腔静脉靠近其入口处放置一根松散的5-0丝线缝线。将1毫升4摄氏度的肝素化生理盐水经右心房注入下腔静脉，随后用5-0丝线结扎该血管并切断。随后以类似方式结扎并缝合右侧上腔静脉，轻柔地将心脏向动物右侧翻转，分离并结扎左侧上腔静脉，暴露左肺动脉。现在用湿纱布固定心脏，钝性分离胸腺与主肺动脉、左肺动脉和右肺动脉分支以及升主动脉弓。将主动脉弓从周围组织中钝性游离，然后使用显微剪刀在右锁骨下头臂动脉近端切断主动脉，直至心脏与主动脉切断点之间无任何分支。主动脉弓的这一部分将形成植入过程中的动脉套管。接下来，将主动脉套管向下翻折，以暴露肺动脉干以及左、右肺动脉分支。然后钝性分离左、右肺动脉分支，尽可能远离心脏方向将其从周围组织中解剖出来。尽可能靠近肺动脉干分叉处近端切断，以形成移植所需的静脉袖状结构。随后，用5-0丝线在心脏基底部结扎，于基底处剪断，并将切除的组织转移至4°C的生理盐水中。总体取心时间约为10至15分钟以植入供体心脏。将受体动物麻醉并固定后，用聚维酮碘擦拭皮肤，并用酒精或无菌水冲洗间隔区域。重复此步骤三次，然后以无菌方式覆盖手术部位。然后开始操作，沿中线做一道长两厘米的垂直腹部切口。进入腹腔后，将肠管向上方牵拉，并将其外置于胸部，用无菌生理盐水浸湿的无菌纱布包裹。接着，游离肾血管下方的腹主动脉和下腔静脉，并在吻合部位的上方和下方各放置两根0号棉线结扎线。辨认术区内的任何腰动脉，并使用10-0尼龙线将其结扎。缝合时，先打下方棉线结，再打上方结，以在主动脉内保留部分血液，便于进行主动脉自体切断。结扎固定后，用30号针头穿入主动脉管腔内。然后使用精细的显微剪刀沿血管的纵轴方向，将切口以直线延长至约两毫米的长度。现在放置一根10-0尼龙缝线，将供体主动脉与受体主动脉切口的下角进行固定缝合，以实现供体主动脉与受体主动脉之间的端对侧吻合。缝合打结后，在供体主动脉与切口上角及腹主动脉相对应的位置，放置第二根10-0尼龙缝线，与第一根相对，同样打结固定。第二根缝线就位后，从主动脉侧壁的上方至下方进行连续缝合，注意将内膜对合整齐，并将其与先前放置的固定缝线打结固定。接着，以连续缝合方式缝合内侧壁，并打结固定，使每侧的第一针和最后一针尽可能靠近固定缝线。在这两个缝合点之间均匀缝合三针，共完成五针缝合。然后，将供体肺动脉与受体下腔静脉进行端侧吻合：首先用30号针头穿刺下腔静脉，再用精细显微剪刀沿血管纵轴方向直线延长切口约2毫米。接下来，用10-0尼龙线将供体肺动脉与下腔静脉切口的下角结扎固定。在供体动脉和下腔静脉切口的上角处，与第一根缝线相对的位置放置第二根10-0尼龙缝线并打结。然后在肺动脉和下腔静脉之间进行连续缝合并打结，第一针和最后一针应尽可能靠近固定缝线的位置。目标是在这两针之间均匀分布五针，共缝合七针。现在松开远端的四根OTT棉线，恢复静脉血流。观察到静脉吻合口止血后，逐渐松开近端的四根OTT棉线，观察动脉吻合口是否止血。当确认两个吻合口均稳固后，将棉线从小鼠体内移除，将肠管还纳至腹腔，并使用5-0丝线以两层缝合法关闭腹壁。以连续操作的方式，在关闭腹腔时向腹部注入一毫升无菌温热的生理盐水，作为液体复苏；同时皮下注射0.8毫升生理盐水。最后，为通过每日经腹触诊评估移植物功能，将小鼠固定至腹腔注射时的体位，然后用食指 fingertip 轻轻按压腹壁，以确定移植物搏动的强度与节律。根据搏动的幅度和频率，将触诊质量评分从正常的4分到无搏动的排斥移植物0分进行评定。该手术技术既可简化移植物存活研究，也可用于复杂的实验方案。例如，在本代表性实验中，探讨了快速反应和/或穿孔素在CD4阳性T细胞介导的心脏排斥反应中的作用机制。实验结果表明，CD4阳性效应T细胞对心脏同种异体移植物的直接排斥作用需要移植物快速表达和T细胞持续表达的共同参与，首次证明了CD4阳性T细胞的细胞毒活性在体内原发性急性移植排斥反应中具有不可或缺的作用。观看本视频后，您应能够充分理解如何在吻合术中放置缝线，以获得健康跳动的心脏移植物。

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小鼠异位心脏移植技术

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