从子宫切除标本中建立原代人子宫内膜基质细胞的两种方法

本实验的总体目标是从切除的子宫标本中建立原代子宫内膜基质细胞培养。首先通过区分并分离子宫各层组织，以获取一段子宫内膜组织。第二步是在刮取法和酶解法之间选择一种细胞分离技术；当采用刮取法时，需进行如下操作。

采用机械力和刮除法分离和解离子宫内膜基质细胞。或者，在使用胰蛋白酶法时，利用胰蛋白酶的酶活性来分离和解离子宫内膜基质细胞。最终通过显微镜观察细胞的生长情况和形态，同时采用手稿中所述的其他技术验证子宫内膜基质细胞培养物。

该方法有助于回答生殖领域中一些关键的生理学问题，例如生殖周期和月经现象。本论文所使用的子宫切除标本均依照大学IRB批准的伦理协议（编号I-R-B-H-S-R 1 4 4 2 4）进行收集。在处理样本前，将患者来源的组织置于含有高糖RPMI或DMEM培养基的50毫升离心管中，并在4摄氏度条件下保存，保存时间不得超过24小时。准备开始时，用1×PBS清洗组织样本三次，每次清洗后弃去上清液。

然后向组织样本中加入4到10毫升添加了10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的生长培养基。同时加入两性霉素B，使其终浓度为0.25微克/毫升，并孵育30分钟。接着弃去生长培养基，用1倍PBS缓冲液洗涤组织两次。

将组织置于一个六厘米的细胞培养皿中，并参考这些图像识别子宫内膜层。随后分离子宫内膜，将其他组织层保存以备后续使用。使用手术刀或剃刀片在细胞培养皿表面刮擦的同时，将组织横切成小块。

划痕有助于新生的原代子宫内膜基质细胞的贴附。接下来，向划痕后的培养皿中轻柔加入两毫升生长培养基。在此阶段，可见组织碎片并因划痕动作而固定。

将培养皿置于指定的细胞培养孵育箱中，与其他细胞系分开培养，以避免污染。每天使用光学显微镜观察细胞，观察切片组织在第2天或第3天起每三天出现的小群细胞。

轻轻吸去旧的培养基，用一毫升磷酸盐缓冲液（XPBS）洗涤培养物，然后加入两毫升新鲜培养基。开始添加四毫升生长培养基。在洗涤步骤中，当增殖速率增加时，吸除残留的组织碎片。

新的克隆不太可能从组织中形成。培养一周后传代细胞，使用0.05%胰蛋白酶消化。当细胞融合度达到75%至80%时，冻存一板细胞。

当维持两到三个培养板后，原代细胞便无法无限传代。为开始胰蛋白酶介导的分离，将一小块子宫内膜组织放入锥形管中，加入两毫升含0.03毫克/毫升链霉素的0.25%胰蛋白酶溶液，然后将组织在37摄氏度下于旋转平台上孵育30分钟。

接下来，短暂涡旋组织，然后在200至400 ×g条件下离心2分钟，弃去上清液并加入新鲜的胰蛋白酶。加入制霉菌素后，将组织在37°C下旋转孵育1小时。孵育结束后，将组织涡旋5至10秒。

然后加入含有10% FBS和1%青霉素-链霉素的2毫升培养基。为灭活胰蛋白酶，将细胞在200至400 × g离心2至3分钟。然后弃去上清液，重悬细胞沉淀。

在6厘米细胞培养皿中加入2毫升培养基，将细胞悬液接种，并轻轻刮擦培养皿以促进原代细胞的贴壁。每天使用光学显微镜观察细胞生长情况，并每2至3天更换一次培养基。当细胞融合度达到75%至80%时，使用0.05%或0.25%胰蛋白酶进行传代，以分离子宫内膜基质细胞。

采用刮取法可获得早期出现的细胞簇。在手术刀划痕处，可通过成纤维细胞样形态识别子宫内膜基质细胞。胰蛋白酶法的制备时间较刮取法更长，但可更早观察到活细胞。

tryin 方法还可产生具有簇状和弥散状两种生长模式的细胞。目前尚未发现子宫内膜间质细胞的组织特异性标志物。鉴定子宫内膜间质细胞的方法之一是通过检测某一标志物的丢失程度。

对于上皮细胞，如细胞角蛋白。细胞角蛋白的缺失表明子宫内膜上皮细胞的缺失。与第二代相比，第五代中观察到细胞角蛋白染色的减少，证实了上皮细胞的缺失。

通过去细胞化实验可提供子宫内膜基质细胞存在的功能性证据。在使用CAMP和醋酸羟孕酮处理后，催乳素和类胰岛素生长因子结合蛋白1的表达升高，表明子宫内膜基质细胞培养已成功建立。观看本视频后，您应能充分掌握如何从切除的子宫标本中建立原代子宫内膜基质细胞培养体系。