Name: 一种技术，屏幕美国榉木为抵抗山毛榉介壳虫（隐球菌fagisuga林德。） (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 47 s
Description: 了解如何筛选美国榉木对山毛榉介壳虫（Cryptococcus fagisuga）的抗性。该方法通过收集虫卵、将其固定在树皮上并计数成虫，以区分抗病与易感树木，为森林保护提供科学依据。

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作者衷心感谢美国林务局森林健康保护评估监测与特殊技术发展项目提供的资助，这些资助支持了本文所述方案的开发、改进和应用，以鉴定对山毛榉绵粉蚧具有抗性或易感性的树木。&#160;我们还感谢俄亥俄州克利夫兰的霍尔登植物园持续参与并支持我们的美洲山毛榉抗性筛选项目。

1. 植物材料：成熟的田间树木、盆栽幼苗或盆栽嫁接植株
<ol>
	<li>进行野外测试时，应选择成熟健康且无介壳虫侵害或病害迹象的美洲山毛榉树，以检测其可能具备的抗性。同时需识别出明显易感的树木，作为对照使用（图1）。</li>
	<li>若对盆栽幼苗或嫁接材料进行测试，可按照 Koch &amp;#38; Carey（2004）所述方法采集并萌发山毛榉坚果，或按照 Carey et al.（2013）所述方法进行接穗嫁接。</li>
	<li>将幼苗或嫁接植株种植于混合盆栽土中，每2.8立方英尺的基质中添加47 g微量元素、477 g缓释肥料（15N-3.9P-9.9K）、700 g粗珍珠岩和75 g硫酸铝。若生长季后期需要，可每周施用一次可溶性肥料（17N-1.3P-14.1K），氮浓度为200 ppm。</li>
	<li>生长季期间，将植株置于遮阴棚内培养。秋季让植株在室外自然进入休眠状态，随后于11月至次年4月移入温度受控的贮存设施（约4 °C）中保存。</li>
</ol>
2. 榆树绵蚜卵的采集
<ol>
	<li>在受BBD侵害的林分中，使用手持放大镜检查严重受害的树木（通常因其“粉刷过”的外观而易于识别，图1A），以确认是否存在虫卵，虫卵通常在7月中旬至8月中旬大量存在。</li>
	<li>使用画笔轻轻将成虫分泌的白色蜡质团块、虫卵及其他碎屑刷入一个可密封的塑料一加仑收集袋中（图1B）。应从至少相距12米的三棵不同树木上进行采集。</li>
	<li>如有需要，可将虫卵置于密封的收集袋中，在4 °C条件下保存最多两周。在袋内贴上一小块湿润的聚乙烯泡沫（2.5 cm见方），以防止虫卵干燥。</li>
	<li>为将介壳虫卵（0.15 × 0.25 mm）与成虫（0.60 mm）及杂质分离，可使用一段短PVC管和一个接头支撑一块250微米尼龙筛网制成筛具（图2）。</li>
	<li>将收集袋中的成虫、蜡质、虫卵和杂质混合物倒入筛具中，用小画笔轻轻刷动，促使虫卵穿过筛网落入下方的玻璃培养皿中。应避免使用塑料培养皿&#160;，因其静电较强，不利于虫卵移动。筛分前后虫卵的状态如图3所示。</li>
	<li>纯化后的虫卵可在培养皿中于4 °C条件下保存至少一周。为防止虫卵干燥，可在皿盖内侧贴上湿润的泡沫块，并用Parafilm密封。</li>
</ol>
3. 卵活力检测
<ol>
	<li>为评估卵的存活率，使用10 cc注射器在60 mm玻璃培养皿底部周围涂抹一圈薄薄的凡士林（图4A）。</li>
	<li>将约100个卵转移至该环的中心，盖上培养皿盖，并用Parafilm密封。将密封的培养皿在室温下静置2周；若卵在开始检测前曾于4 °C储存，则静置3周。</li>
	<li>孵化出的若虫会粘附在凡士林中，易于计数；空卵可通过颜色和光泽与未孵化的卵明显区分（图4B）。通过将若虫数量除以空卵数与剩余完整卵数之和，计算存活率。良好的存活率应在75%至90%之间。</li>
</ol>
4. 野外大龄成熟山毛榉树木的抗逆性筛选
<ol>
	<li>进行定量检测时，使用解剖显微镜计数500粒卵，并用小刮铲将其轻轻均匀撒在预先润湿的、尺寸为10 × 15 × 1.3 cm的开孔聚乙烯泡沫矩形块中央。润湿泡沫的方法是将其浸水后用力挤出尽可能多的水分。进行定性检测时，可先计数500粒卵放入小玻璃瓶中，并在瓶壁标记“加样线”，用于后续大致量取约500粒卵的批次。</li>
	<li>将带有卵的泡沫垫放置于测试树上，使卵面紧贴树皮。使用绳子、细绳、麻线或塑料包覆的金属丝固定泡沫垫。应选用塑料或金属材质而非天然纤维材料，因为后者更容易被野生动物啃食破坏。</li>
	<li>用乙酸酯类硅胶粘合剂涂抹在预先裁剪好的23 × 30 cm透气性防水建筑膜的顶部和四周边缘，然后将其覆盖在泡沫测试垫上。将建筑膜边缘紧压于树干表面，形成防水密封。再用尼龙绳或塑料包覆的金属丝围绕树干和建筑膜缠绕固定，以确保粘合剂固化期间膜片保持原位（图5）。</li>
	<li>每棵测试树至少放置两个测试垫，最好位于树干相对的两侧。在每个试验点，至少应在2&#160;棵易感树（具有明显自然介壳虫侵染）上放置测试垫作为对照。在对照树上放置测试垫前，需使用硬毛刷清除树上自然存在的介壳虫或卵。 
	注意：带有卵的泡沫垫也可用于在树上饲养介壳虫卵，这在侵染水平较低的区域尤为有用。</li>
</ol>
5. 盆栽幼苗或嫁接苗的抗结垢筛选
<ol>
	<li>进行测试时，选择盆栽树木，其直径至少为 1 cm（距土壤线以上 5 cm 处测量），且高度足以容纳至少 2&#160;个独立的测试垫。必要时修剪细小的侧枝，以腾出空间放置测试垫。</li>
	<li>使用解剖显微镜计数 150 个卵，并将其均匀撒在一块预先切割并润湿的 2.5 × 7.6 × 1.3 cm 开孔聚乙烯泡沫垫上。</li>
	<li>将泡沫垫附着在幼苗上，使卵面紧贴树皮，使用塑料包被的金属丝固定。在泡沫垫上方稍高处，用一小块房屋防潮膜包裹幼苗，并用醋酸盐型硅胶密封（见图 6A）。</li>
	<li>将已知易感的幼苗品系或嫁接材料作为对照。</li>
</ol>
6. 数据采集
注意：在将泡沫垫和卵放置于试验树上后约52至57周，可开始收集数据。必须在成虫开始产卵之后再进行数据采集，以确定其繁殖能力。在某些抗性树种上，偶尔可见少量成虫定殖，但未发生繁殖，这种情况并不罕见。
<ol>
	<li>小心取下泡沫垫，使用手持放大镜或放大镜（10倍）仔细计数树皮上定殖的成虫蚧壳虫数量。</li>
	<li>取下泡沫垫时，部分成虫及大多数卵块常会随泡沫垫从树体上被剥离（见图7）。使用解剖显微镜，计数仍附着在泡沫垫上的卵块和成虫数量。</li>
</ol>

<ol><li>Houston, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+to+artificially+infest+beech+bark+with+the+scale%2C+Cryptococcus+fagisuga+%28Lindinger%29%5BTitle%5D)+AND+%22U.S.+Forest+Service%22%5BJournal%5D)">A technique to artificially infest beech bark with the scale, Cryptococcus fagisuga (Lindinger).</a> U.S. Forest Service. , Northeastern Forest Experiment Station. Broomhall, PA. (1982).</li>
<li>Houston, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((American+beech+resistance+to+Cryptococcus+fagisuga%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding%2C+IUFRO+beech+bark+disease+working+party+conference%22%5BJournal%5D)">American beech resistance to Cryptococcus fagisuga.</a> Proceeding, IUFRO beech bark disease working party conference. , U.S. Department of Agriculture, Forest Service, Northeastern Forest Experiment Station. Washington, D.C. 38-42 (1983).</li>
<li>Ehrlich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beech+bark+disease%3A+a+nectria+disease+of+Fagus%2C+following+Cryptococcus+fagi%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The beech bark disease: a nectria disease of Fagus, following Cryptococcus fagi.</a> 10, 593-692 (1934).</li>
<li>Papaik, M. J., Canham, C. D., Latty, E. F., Woods, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+an+introduced+pathogen+on+resistance+to+natural+disturbance%3A+beech+bark+disease+and+withdrow%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Effects of an introduced pathogen on resistance to natural disturbance: beech bark disease and withdrow.</a> 35, 1832-1843 (2005).</li>
<li>Miller-Weeks, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+of+beech+bark+disease+in+New+England+and+New+York%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding%2C+IUFRO+beech+bark+disease+working+party+conference%22%5BJournal%5D)">Current status of beech bark disease in New England and New York.</a> Proceeding, IUFRO beech bark disease working party conference. , U.S. Department of Agriculture, Forest Service, Northeastern Forest Experiment Station. Washington, D.C. 21-23 (1983).</li>
<li>Houston, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beech+bark+disease%3A+The+aftermath+forests+are+structured+for+a+new+outbreak%5BTitle%5D)+AND+%22J.+For%22%5BJournal%5D)">Beech bark disease: The aftermath forests are structured for a new outbreak.</a> J. For. 73, 660-663 (1975).</li>
<li>Twery, M. J., Patterson, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variations+in+beech+bark+disease+and+its+effects+on+species+composition+and+structure+of+northern+hardwood+stands+in+central+New%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Variations in beech bark disease and its effects on species composition and structure of northern hardwood stands in central New.</a> 14, 565-574 (1984).</li>
<li>Jakubus, W. J., McLaughlin, C. R., Jensen, P. G., McNulty, S. A., et al. Alternate year beechnut production and its influence on bear and marten populations. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJakubus%2C+WJ+%22Beech+Bark+Disease%3A+Proceedings+of+the+Beech+Bark+Disease+Symposium%22">Beech Bark Disease: Proceedings of the Beech Bark Disease Symposium</a>. Evans, C. A., et al. , U.S. Forest Service, Northern Research Station. Newtown Square, PA. 79-87 (2005).</li>
<li>Koch, J. L., Carey, D. W., Mason, M. E., Nelson, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+beech+scale+resistance+in+full-+and+half-sib+families%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+For.+Res%22%5BJournal%5D)">Assessment of beech scale resistance in full- and half-sib families.</a> Can. J. For. Res. 40, 265-272 (2010).</li>
<li>Koch, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beech+bark+disease%3A+The+oldest+%E2%80%9Cnew%E2%80%9D+threat+to+American+beech+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Outlooks+Pest+Manag%22%5BJournal%5D)">Beech bark disease: The oldest “new” threat to American beech in the United States.</a> Outlooks Pest Manag. 21, 64-68 (2010).</li>
<li>Koch, J. L., Mason, M. E., Carey, D. W., et al. Screening for resistance to beech bark disease: improvements and results from seedlings and grafted field selections. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKoch%2C+JL+%22Proceedings+of+the+4th+International+Workshop+on+Genetics+of+Host-Parasite+Interactions+in+Forestry%22">Proceedings of the 4th International Workshop on Genetics of Host-Parasite Interactions in Forestry</a>. Palmieri, K., et al. , U.S. Forest Service, Pacific Southwest Research Station. Albany, CA. (2012).</li>
<li>Leak, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fifty+year+impacts+of+the+beech+bark+disease+in+the+Bartlett+Experimental+Forest%2C+New+Hampshire%5BTitle%5D)+AND+%22Northern+J.+Appl.+For%22%5BJournal%5D)">Fifty year impacts of the beech bark disease in the Bartlett Experimental Forest, New Hampshire.</a> Northern J. Appl. For. 23, 141-143 (2006).</li>
<li>Koch, J. L., Carey, D. W., et al. Controlled cross-pollinations with American beech trees that are resistant to beech bark disease. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKoch%2C+JL+%22Proceedings+of+the+14th+Central+Hardwood+Forest+Conference%22">Proceedings of the 14th Central Hardwood Forest Conference</a>. Yaussy, D. A., et al. , U.S. Forest Service, Northeastern Research Station. 358-364 (2004).</li>
<li>Carey, D. W., Mason, M. E., Bloese, P., Koch, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hot+callusing+for+propagation+of+American+beech+by+grafting%5BTitle%5D)+AND+%22HortSci%22%5BJournal%5D)">Hot callusing for propagation of American beech by grafting.</a> HortSci. 48, 620-624 (2013).</li>
<li>Koch, J. L., Carey, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+resistance+of+American+beech+to+beech+bark+disease%3A+knowledge+through+2004%5BTitle%5D)+AND+%22Beech+Bark+Disease%3A+Proceedings+of+the+Beech+Bark+Disease+Symposium%22%5BJournal%5D)">The genetics of resistance of American beech to beech bark disease: knowledge through 2004.</a> Beech Bark Disease: Proceedings of the Beech Bark Disease Symposium. Evans, C. A., et al. , U.S. Forest Service, Northern Research Station. Newtown Square, PA. 98-105 (2005).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

成功实施本实验的关键步骤包括对卵进行活力检测，以及在每个测试地点和盆栽材料中使用敏感性对照。&#160;此外，每棵树或每株幼苗应使用多个测试垫。&#160;我们发现，无论是在田间试验还是在对盆栽植物进行的更受控的测试中，测试垫失效都是常见的误差来源。&#160;例如，在田间即使已采用房屋防潮膜覆盖测试垫以防止湿度过高，沿树干流下的水分仍可能偏向树的一侧，导致测试垫失效。&#160;

为了获得准确的结果，必须同时对垫片下方的树皮表面以及泡沫垫本身进行计数。&#160;除了成虫和卵块外，介壳虫生活史中唯一的移动阶段——一型若虫，也可能被观察到。&#160;这些可移动的若虫最终会将取食口针插入树皮，转变为二型若虫。&#160;两种类型的若虫在大小和外观上均与小型椭圆形的卵非常相似，而较大的成虫则呈更接近球形的形态。&#160;一型若虫与卵的区别在于其具有红色的眼睛且能够移动，但这种活动性使得准确计数变得非常困难。二型若虫很容易被误认为是卵，尤其是在野外使用手持放大镜或放大镜而非显微镜进行数据记录时。&#160;基于这些原因，我们建...

自19世纪90年代末，入侵性介壳虫——水青冈绵蚧（Cryptococcus fagisuga）被引入加拿大新斯科舍省以来，山毛榉树皮病（BBD）已对北美地区的美洲山毛榉造成了严重危害3。&#160;该病害复合体始于山毛榉介壳虫将其取食口器刺入树皮，形成微小裂隙，从而为一种Neonectria属真菌（Neonectria ditissima或Neonectria faginata）的侵染提供入口。&#160;随着真菌菌丝的生长，大片组织可能死亡，最终导致树木被完全环割。&#160;病害造成的损伤使树木结构变弱，容易在强风中折断4。&#160;在病害暴发的第一波中，树木死亡率据报高达50%5。&#160;幸存的树木常因溃疡形成而严重变形，降低了其作为木材产品的经济价值。&#160;这类树木倾向于从根部萌发新枝，形成“山毛榉密丛”，阻碍其他更具生态或经济价值的树种定植，&#160;从而降低&#160;林分的经济与生态价值6。&#160;尽管山毛榉树皮病不太可能导致美洲山毛榉灭绝，但它改变了林分组成与健康状况，导致野生动物的食物和栖息地减少7,8。

在受山毛榉树皮病（BBD）影响多年的林分中，已有报道发现一些树木未表现出任何疾病症状。&#160;人工接种试验表明，这些树木对介壳虫具有抗性2。&#160;在没有介壳虫侵染的情况下，Neonectria 感染的机会极小，从而降低了真菌的影响。&#160;迄今为止，从未有报道显示在无先前介壳虫侵染的情况下，Neonectria 感染导致美洲山毛榉大规模死亡，因此对山毛榉介壳虫的抗性即意味着对BBD的抗性。&#160;

近期关于山毛榉树枯萎病（BBD）管理的研究主要集中在鉴定、扩繁、培育和保留对山毛榉绵粉蚧具有抗性的美洲山毛榉树。&#160;遗传学研究表明，对绵粉蚧的抗性具有可遗传性，通过精心选择和培育抗性植株，可在单一代际内实现显著的遗传改良9。&#160;这一发现推动了美国各州及国家林业管理部门建立区域性抗性美洲山毛榉种子园的努力，旨在为生态恢复种植提供遗传多样性丰富的抗BBD种子来源10,11。研究还表明，通过移除感病树木并保留抗性树木，对林分遗传结构进行森林培育干预，可实现林分质量的提升9,12。&#160;

通过树木改良措施或实施森林培育方案来管理山毛榉树皮病（BBD），需要能够筛选并区分对山毛榉绵蚧具有抗性与感性的树木。&#160;本文所述方法改编自 Dave Houston 首次提出的人工接种山毛榉绵蚧卵的方法1。&#160;该方法可作为筛选工具，用于鉴定与抗性相关的数量性状位点（QTL），或在遗传学研究中区分具有抗性与感性的盆栽幼苗或嫁接无性系。&#160;此外，也可用于田间成年树木的筛选，以鉴定可用于建立种子园或在林分中保留的抗性植株。&#160;通过识别感性植株并予以清除，可降低病害影响。&#160;

<table><tbody><tr><td>尼龙网片，250 微米</td><td><a href="http://www.amazonsupply.com/dp/B000FMWH1S/ref=sp_dp_g2c_asin" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> 小型部件</a></td><td>CMN-0250-D</td><td>网孔尺寸：250 微米方形，开孔面积百分比：34，丝径：180 微米，宽度：24&amp;rdquo;，长度：12&amp;rdquo;，包装数量：1</td></tr><tr><td>Tyvek 建筑防潮层</td><td><a href="http://www.lowes.com/pd_14582-2020-D13499991_0__" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> DuPont</a></td><td>D1349991</td><td>9 英尺 × 150 英尺卷装，可要求将其裁剪成两半。</td></tr><tr><td>聚乙烯泡沫 &amp;frac12;&amp;rdquo; 厚&amp;nbsp;</td><td><a href="http://www.colsfoam.com/apcfp/products.htm" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> 哥伦布泡沫产品</a></td><td></td><td>2 英尺 x 50 英尺卷装</td></tr><tr><td>MetroMix 510</td><td><a href="http://sungro.com/products_displayProduct.php?product_id=118&amp;amp;brand_id=17" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sun Gro Horticulture</a></td><td></td><td>2.8 立方英尺 树皮、泥炭藓、蛭石、树皮灰、启动营养素（含石膏）、缓释氮及&amp;nbsp;白云质石灰岩</td></tr><tr><td>Osmocote Plus 15-9-12</td><td><a href="http://everris.us.com/product/15-9-12" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Everris</a></td><td>E903206</td><td>标准 3-4 个月发布</td></tr><tr><td>Sight Savers 10X</td><td><a href="http://www.amleo.com/Bausch---Lomb-Illuminating-Codington-Magnifier-10x/p/CM10/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Bausch &amp;amp; 隆布</a></td><td>813434</td><td>10倍放大率照亮科丁顿透镜</td></tr><tr><td>尼康 Mini Field 体视显微镜</td><td><a href="http://www.opticsplanet.com/nikon-fieldmicroscope.html" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> 尼康</a></td><td>7314</td><td>20倍放大</td></tr><tr><td>Silicone II 透明</td><td><a href="http://www.midlandhardware.com/159538.html" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> GE</a></td><td>159538</td><td>2.9 oz 透明窗口 &amp;amp; 门窗密封胶</td></tr></tbody></table>

一种筛选美国山毛榉对山毛榉绵粉蚧（cryptococcus fagisuga lind.）抗性的技术

A Technique to Screen American Beech for Resistance to the Beech Scale Insect (Cryptococcus fagisuga Lind.)

山毛榉树皮病（BBD）会导致初期树木大量死亡，幸存下来的树木也往往严重衰弱并发生畸形。&#160;该病害由入侵性山毛榉绵粉蚧Cryptococcus fagisuga的取食活动引发，其取食行为为Neonectria属真菌中的一种提供了侵染入口。&#160;若无绵粉蚧的侵染，真菌感染几乎难以发生。在受BBD严重影响的林分中，利用绵粉蚧卵对健康树木进行人工接种，结果表明这些树木对病害复合体中的绵粉蚧部分具有抗性1。&#160;本文介绍了一种基于Houston所建立的人工接种技术2而改进的实验方案，可用于在田间以及小型盆栽幼苗和嫁接植株中筛选抗绵粉蚧的个体。&#160;鉴定出具有绵粉蚧抗性的树木，是通过树木改良计划和森林经营措施来管理BBD的重要环节。

图6 显示了一株抗性幼苗（C）和两株表现出不同程度感病性的感病幼苗（D、E）。在人工接种试验建立57周后，感病成年植株的典型症状如图5B所示。当将泡沫从树体上剥离时，介壳虫及其卵块常常会残留在泡沫上（如图7所示），因此必须同时从树体和泡沫垫上收集数据。
图8展示了在两个不同林分中人工接种的树木上每100粒卵成功发育为成虫的平均数量，这两个林分分别位于宾夕法尼亚州的阿勒格尼国家森林（ANF）和密歇根州的卢丁顿州立公园（LSP）。两个林分均受到栗疫病（BBD）侵染，且在每个林分中均鉴定出一组健康树木（LSP抗性组和ANF抗性组），并基于DNA分析确定为克隆群体（数据未显示）。在LSP还鉴定出一个BBD敏感型树木的克隆群体（LSP敏感组），而在ANF则使用了五株不同的敏感型树木（ANF敏感组）。克隆群体内部及之间，树木大小存在差异，胸径（DBH）范围为2...

山毛榉树皮病始于山毛榉绵粉蚧的取食活动，其取食会在树皮上形成真菌侵入点。&#160;对绵粉蚧具有抗性的树木同样具有抗病性。&#160;本文介绍了我们开发的用于筛选单株山毛榉对山毛榉绵粉蚧抗性的实验方案。

一种筛选美国山毛榉对山毛榉绵粉蚧（Cryptococcus fagisuga Lind.）抗性的技术

山毛榉树皮病（BBD）会导致初期高死亡率，幸存下来的树木也往往严重衰弱且形态畸形。

本实验的总体目标是区分抗山毛榉树皮病与易感该病的美洲山毛榉树。首先从美洲山毛榉树上直接采集成年山毛榉介壳虫及其虫卵，以完成第一步。第二步是通过将虫卵与成虫及其他碎屑分离，获得一批均质的虫卵。接下来，将卵计数后放置于泡沫垫上，并固定在试验树木的树皮上。同时，设置实验以确认卵的活力。大约一年后，取下试验垫，统计成虫数量和卵块数量。最终，这种通过人工接种滨木虱来感染海滨树木的技术可用于鉴定对海滨树皮病具有抗性或易感性的树木。与戴夫·休斯顿（Dave Houston）先前开发的人工木虱接种技术相比，本技术的优势在于采用了对照树木和卵活力检测，并且具有足够的定量性和可重复性，适用于遗传学研究。该方法有助于制定海滨树皮病的管理决策，例如确定哪些树木对疾病具有抗性，应在采伐时保留，或哪些树木最适合作为种子园的候选植株——特别是那些遭受严重滨木虱侵染的美洲海滨树木。昆虫因其灰白色的外观而易于识别。使用手持放大镜确认卵的存在，这些卵通常在7月中旬至8月中旬数量丰富。将一个可密封的塑料一加仑收集袋用胶带固定在受侵染的树干上，然后用画笔轻轻将成虫介壳虫的白色蜡状团块、卵及其他碎屑刷入袋中。从至少相距12米的三棵不同树木上采集卵。取一块2.5厘米见方的聚乙烯泡沫，将其润湿后用胶带固定在袋内侧，以防止卵干燥。然后密封袋子。向袋中呼气，以增加一层保护性空气垫，便于卵的运输。卵可在密封的收集袋中于4°C条件下保存长达两周。为将鳞片状的卵与成体及碎屑分离，可通过夹层法制作一个筛网。将一块250微米的正方形尼龙筛网置于一段短的2英寸PVC管和一个接头之间。在筛网下方放置一个玻璃培养皿，然后将收集袋中的成虫、蜡质卵和碎屑混合物倒入筛网上。接着使用一把小的油漆刷轻轻刷动，促使卵通过筛网落入下方的玻璃培养皿中。为防止卵干燥，将一块湿润的泡沫用胶带固定在盖子上，并用石蜡密封。经纯化的卵可在培养皿中于4°C条件下保存至少一周。为了获得有活力的介壳虫，首先需要能够识别成年产卵昆虫，并通过吸液法将其与卵分离。最后，您需要能够通过卵活力检测来确认这些卵的存活能力。为评估卵的活力，使用10 cc注射器将一圈薄薄的凡士林涂抹在60毫米玻璃培养皿底部的边缘周围。用刮勺舀取约100个卵，并将其转移至该环的中心位置。然后将培养皿盖上盖子，并用封口膜密封。将密封好的培养皿在室温下静置两周至三周；若卵之前在4°C条件下储存过，则静置三周。两周至三周后，使用解剖显微镜计数孵化出的若虫数量，这些若虫通常会黏附在石蜡油中。然后统计未孵化卵的数量，未孵化卵呈不透明的淡黄色；再统计已孵化卵的数量，已孵化卵颜色较浅且呈半透明状。通过将孵化出的若虫数量除以空卵数量与剩余未孵化卵数量之和，计算孵化率。良好的孵化率应在75%至90%之间。通过野外检测评估对滨蚧的抗性。若仅需进行定性检测，可使用便携式解剖显微镜计数500粒卵来完成；若需定量检测，可将500粒卵放入带有刻度线的小瓶中，该刻度线可用于测量后续约500粒卵的其他批次。接下来用开孔聚乙烯泡沫浸湿，然后尽可能挤出多余的水分。使用小型金属实验刮刀，将500枚卵轻轻均匀地撒在湿润的泡沫中央。此时卵已准备好用于人工感染实验。选择成熟、健康的美国榆树，确保无介壳虫、虫害或病害迹象。将尼龙绳绑在待测树木上，然后将泡沫垫放置于树干上，使有卵的一侧紧贴树皮。将绳子从垫子上方穿过并固定。在树的另一侧绳子下方插入第二块垫片。每棵树上至少应放置两块垫片。应使用塑料或金属材料，而非绳子、细绳或麻线，因为后者更容易被野生动物取走。预先裁剪。取一块23厘米×30厘米的透汽防水防潮膜，用醋酸盐基硅胶粘合剂涂抹其顶部和侧面。然后将防潮膜覆盖在泡沫测试垫上，并将边缘压紧至树干，以形成防水密封。在树干和防潮膜周围缠绕尼龙绳或塑料包覆的五金钢丝，以在粘合剂固化期间固定防潮膜。选择明显易感的树木作为对照组使用。使用硬毛刷清除测试垫放置区域上可能存在的天然介壳虫或虫卵。然后在每个测试地点的至少两棵易感树木上放置测试垫。首先在改良的盆栽土混合物中培育幼苗或接枝植株。在生长季节后期，于遮阴棚内对盆栽幼苗或接穗进行测试。在生长季节期间，根据需要每周为植物施肥一次，并将植物置于遮阴棚内。在秋季将植物移至4°C的储存环境之前，使其在室外进入休眠状态。在种植后的一至两年内，从11月到次年4月，当植株主干足够高、可在其上放置至少两个独立的测试垫，且在土壤线以上5厘米处用游标卡尺测量主干直径达到至少1厘米时，植株即可进行测试。必要时修剪掉细小的侧枝，以腾出空间安放测试垫。使用解剖显微镜计数150粒卵，均匀撒在预先切割并润湿的开孔聚乙烯泡沫垫上。使用塑料包被的金属丝将泡沫垫固定在幼苗上，泡沫的卵面紧贴树皮。在泡沫上方稍高处，用一小块房屋防潮膜包裹幼苗，并用醋酸盐型硅胶密封。对照处理时，将含有卵的泡沫垫附着于已知易感的幼苗品系或嫁接植株上。大约一年时间。将泡沫垫放置在树木上后，小心地从幼苗或成年树上取下泡沫垫。然后使用手持放大镜或10倍放大镜，计数树皮上已定殖的成年介壳虫数量。移除泡沫垫时，部分成虫和大多数卵块随泡沫垫从树上被扯下是常见现象。在解剖显微镜下，统计附着在泡沫垫上的卵块和成虫数量。此处展示的是一株抗性幼苗。黑色线条标示了泡沫垫的范围。树皮未见侵染。此处显示的两株易感幼苗表现出不同程度的易感性。此处显示的是人工接种后57周的感病成熟树木。树木在宾夕法尼亚州的阿勒格尼国家森林和密歇根州的卢顿州立公园被人工接种了水蜡树胶蚧卵。该图表比较了抗性树木与感病对照树木的情况。每组测试的树木数量列于括号中。每100个提供的卵所发育成的成虫数量为该组内所有树木的平均值。尽管在感病树木上成功建立的成虫数量存在较大变异，但仍可明显检测到感病树木与抗性树木之间的差异。在尝试该技术时，重要的是确保树干包裹材料牢固地密封在树干上。这将防止泡沫垫上积聚过多水分，从而避免影响实验结果。观看本视频后，您应能够采集并纯化介壳虫卵，并利用这些虫卵开展检测，以确定海滨树木对介壳虫是否具有抗性或易感性。介壳虫与一种真菌共同构成致病复合体，该真菌实际上是导致山毛榉树皮病的原因。

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