基于荧光的钙离子动员检测法表征G蛋白偶联受体

以下实验的总体目标是鉴定孤儿G蛋白偶联受体（G protein coupled receptors，G PCRs）的功能性激活配体。为此，首先在细胞表达系统中瞬时转染目标A-G-P-C-R，并共转染一种混杂性G alpha 16构建体，以实现这两种蛋白的临时异源表达。第二步，将转染后的细胞负载钙离子敏感性荧光染料flu oh four，该染料在与钙离子结合后荧光信号增强，从而检测细胞内钙库中钙离子的释放。

接下来，通过使用候选配体化合物库刺激异源表达的受体，进行基于荧光的钙流测定实验，以鉴定能够激活该受体并引发细胞内信号级联反应的化合物，该反应导致内质网中钙离子的释放，其变化可通过荧光信号进行检测。实验结果可获得浓度-反应曲线，显示激动配体的半最大效应浓度（EC50），该数据基于向细胞表达系统施加不同浓度配体后所检测到的荧光信号差异。相较于使用稳定克隆细胞系，采用瞬时转染以实现G蛋白偶联受体（GPCR）短暂表达的主要优势在于，无需耗时构建稳定转染的细胞系。

转染通用型G蛋白α16亚基可将大多数G蛋白偶联受体（GPCR）的细胞内信号通路重定向至钙离子释放，而无论其在内源性环境中的天然信号通路如何。因此，该实验体系可在短时间内实现对数百种化合物在目标GPCR上的中等通量筛选。本实验由本实验室的博士研究生Yellow Gas和技师Nick Su演示。在进行钙流检测前3天，于T75培养瓶中培养HEK293T细胞，当细胞融合度达到80%时进行传代。每组实验准备一个T75培养瓶用于转染受体表达质粒，另取一个培养瓶转染空表达载体作为阴性对照。

将培养瓶置于37摄氏度、5% CO2的湿润培养箱中孵育20至24小时，直至细胞培养物达到50%至70%汇合度，如图所示。接下来，向一个1.5毫升微量离心管中加入3.9微克受体构建体或空载体以及3.9微克G alpha 16表达构建体。加入500微升jet prime缓冲液。

涡旋混匀试管后短暂离心。然后加入37.5 µL的Jet Prime转染试剂，涡旋混匀后以最高速度离心1分钟。将转染混合物室温孵育10分钟。

在室温下，将一个细胞群体标记为转染了表达载体，该载体编码目标 GPCR 和 G alpha 16 构建体；将另一个培养瓶中的细胞标记为转染了空载体和 G alpha 16 构建体。孵育后，将转染混合物逐滴加入细胞培养基中，注意将液体直接加入培养基内，避免接触培养瓶壁。将培养瓶置于 37°C、含 5%CO₂ 的湿润化培养箱中孵育 20 至 24 小时，用于钙流测定实验。

将转染的细胞收集并接种到96孔黑色壁透明底板中。首先，每孔加入60 µL室温的包被液对板进行包被。

含纤连蛋白的磷酸盐缓冲液。将培养板盖上盖子，在室温下孵育一小时。移除孔中的溶液，再将培养板在室温下不盖盖子孵育一小时。

同时，从细胞中移除旧的培养基。用 3 mL PBS 洗去死亡细胞，然后吸除 PBS。随后加入 3 mL 室温 PBS 消化液（含 EDTA），孵育 1 分钟后吸除溶液。

此时，细胞形态由星形变为球形。轻轻敲击培养瓶底部使细胞脱落，并用10毫升室温DMem转移培养基反复冲洗收集细胞。

将细胞转移至一个50毫升离心管中。为计数每毫升的细胞数量，取100微升细胞培养液加入1.5毫升微量离心管中，然后加入100微升裂解缓冲液，并通过轻弹管壁混匀。

最后，加入 100 µL 稳定缓冲液，通过轻敲混匀。用细胞悬液填充核小体样品盒，并使用计数仪计数细胞。由于细胞被稀释了三倍，核小体观察软件会自动将细胞数量乘以三。

加入裂解和稳定缓冲液后，将细胞稀释至终浓度为每毫升600,000个细胞，并在包被的培养板中每孔接种150微升细胞悬液。为获得每孔约90,000个细胞的密度，避免产生气泡，轻敲培养板使细胞均匀分布。为形成连续的细胞单层，将培养板置于37摄氏度、5%CO2的湿化培养箱中孵育16至24小时。

弃去细胞中的培养基。每孔用 200 µL PBS 洗涤细胞，然后移除 PBS。需要注意的是，从这一步开始，所有涉及细胞操作的步骤均需在避光条件下进行，因为此后细胞将被加载荧光染料 fluoro four。

每孔加入 55 µL 上样缓冲液，用铝箔纸包裹板子以避免光照，于室温孵育 1 小时。接着，使用洗涤缓冲液在硅化处理的 1.5 mL 微型离心管中溶解干燥的多肽。制备一系列稀释样品，以进行浓度反应分析并确定配体的 EC50 值。

请注意，在检测过程中，将从化合物板中转移50微升配体至细胞板的含100微升洗涤缓冲液的孔中，因此需将化合物配制为所需终浓度的三倍。接下来，以三复孔形式在化合物板的相应孔中加入70微升配体。每块板均需设置阳性和阴性对照。

弃去细胞板中的上样缓冲液，每孔加入 100 微升洗涤缓冲液，避免光照。室温孵育 15 分钟。弃去细胞板中的洗涤缓冲液，每孔加入 100 微升新鲜洗涤缓冲液。

将细胞板、化合物板和吸头架在37摄氏度下孵育15分钟。使用软件创建并加载所需协议文件，同时启动读板腔的温度控制单元。在37摄氏度下，以525纳米波长，每次读取一行，每1.52秒进行一次连续读数，持续测量钙离子响应信号两分钟。

将flu oh four的激发波长设置为488纳米，并将总共50微升的化合物转移至细胞板中。读数后18秒开始，分配速度设为26微升/秒，移液高度设为135微升。

将化合物和细胞板以及吸头架放置在仪器设备的相应抽屉中。在开始实际的flex模式筛选之前，先以终点模式对细胞板进行一次在相同激发和发射波长下的读数。启动检测，并使用所示软件进行数据分析。

以下是 doofus 短链 NPF 一个浓度系列的三个重复实验之一对应的图表。阴性对照未诱导出荧光信号，而阳性对照则强烈激活了内源性蛋白酶激活受体 one，从而产生强烈的荧光信号。

该软件允许输入公式以计算不同浓度的激活百分比或标准误差等参数。所得数据用于绘制初步的浓度-反应曲线，以估算四种食管短链NPF肽的EC50值，如图所示。曲线还包含阴性对照数据，即在转染空载体的细胞上测试果蝇短链NPF肽浓度系列的结果。

结果表明，将这些肽类添加到细胞中对内源性受体无影响，但确实能够激活目标受体。已开展基于荧光的钙流测定的初步浓度-反应曲线实验，并调整测试浓度以覆盖曲线的动态范围。果蝇 short npf 1、2、3 和 4 的 EC50 值相似，表明它们在该实验条件下激活受体的效力相当。

还可以采用其他方法，如构效关系研究，以回答更多问题，例如肽段中哪些氨基酸对受体激活至关重要。观看本视频后，您应能够充分理解如何开展基于荧光检测的钙流实验，用于鉴定G蛋白偶联受体的功能性激活配体。该流程包括维持稳定表达系统，随后通过转染将目标受体导入细胞体系。

在进行严格的钙动员实验后可以开展。