Name: G蛋白偶联受体的基于荧光的钙动员含量表征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: 学习基于荧光的钙动员检测方法，用于孤儿G蛋白偶联受体（GPCR）的配体筛选。该方法利用HEK293T细胞和G alpha 16构建实现中高通量筛选，快速鉴定功能性激活配体。

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作者感谢佛兰德研究基金会（FWO-Vlaanderen，比利时，G.0601.11）和鲁汶大学研究基金会 GOA/11/002 的资助。IB、TJ 和 LT 获得了 FWO-Vlaanderen 的博士后奖学金支持。

注意：所有涉及细胞的操作均应在层流罩内的无菌环境中进行。
1. HEK293T 细胞系的培养与维持
<ol>
	<li>在37 °C、5% CO2的加湿培养箱中，于T-75培养瓶中培养HEK293T细胞。</li>
	<li>当细胞融合度达到80%时进行传代。注意：通常需要3至4天。持续培养的细胞可用于筛选的传代次数为20–25次。
	<ol>
		<li>提前半小时将不含氯化钙和氯化镁的Dulbecco磷酸盐缓冲液（PBS）、PBS-胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）（500 ml PBS中加入10 ml胰蛋白酶-EDTA溶液和4.5 ml 4% EDTA）以及生长培养基（500 ml高糖Dulbecco改良Eagle培养基[DMEM]，添加10%胎牛血清[FBS]和1 mM青霉素-链霉素[P-S]）置于室温下平衡。</li>
		<li>移除细胞中的旧生长培养基，用3 ml PBS冲洗去除死细胞，然后再次移除PBS。</li>
		<li>加入3 ml PBS-胰蛋白酶-EDTA，室温孵育1分钟，然后移除溶液。注意：细胞形态将从星形变为球形。</li>
		<li>轻轻敲击培养瓶使细胞从瓶底脱落，并用10 ml新鲜生长培养基反复冲洗瓶底以收集细胞。</li>
		<li>将1 ml细胞培养物转移至含有14 ml新鲜生长培养基的新T-75培养瓶中，在37 °C、5% CO2的加湿培养箱中孵育。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. HEK293T 细胞的瞬时转染
<ol>
	<li>在进行钙流测定实验前3天，将HEK293T细胞培养于T-75培养瓶中。请使用三个T-75培养瓶：一个用于转染受体表达质粒，一个用于转染空表达载体作为阴性对照，另一个用于转染对照。注意：细胞传代操作按照步骤1.2所述进行。当需要筛选多个96孔板时，可使用T-150培养瓶以获得更多的细胞产量（此时需将步骤1.2.5、2.3、3.1.3和3.1.4中列出的所有试剂用量加倍）。</li>
	<li>将培养瓶置于37 °C、5% CO2的湿化培养箱中孵育20–24小时，直至细胞融合度达到50–70%。</li>
	<li>将第一组细胞共转染编码目标G蛋白偶联受体（GPCR）的表达质粒和Gα16表达质粒，第二瓶细胞共转染空载体和Gα16表达质粒，第三瓶细胞共转染转染对照质粒和Gα16表达质粒。注意：本实验方案中，Drosophila sNPF受体被克隆至pcDNA3.1哺乳动物表达载体13中。转染使用JetPRIME试剂完成，但也可使用其他转染试剂。
	<ol>
		<li>将总共7.8 µg DNA（3.9 µg受体表达质粒或空载体，以及3.9 µg Gα16表达质粒）加入1.5 ml微量离心管中，并加入500 µl JetPRIME缓冲液。通过涡旋充分混匀后短暂离心。</li>
		<li>加入37.5 µl JetPRIME试剂，涡旋混匀后在14,000 x g条件下离心1&#160;min&#160;。室温孵育转染混合物10分钟。</li>
		<li>将转染混合物逐滴加入细胞培养基中，注意移液时直接加入培养基内，避免接触培养瓶壁。将培养瓶置于37 °C、5% CO2的湿化培养箱中继续孵育20–24小时。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 钙离子动员实验
<ol>
	<li>收集转染后的细胞，并将其接种至96孔黑色壁、透明底板中。
	<ol>
		<li>将 PBS、PBS-胰蛋白酶-EDTA 和 DMEM 转移培养基（500 ml DMEM 添加 10% 透析胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素）提前半小时置于室温。</li>
		<li>用 60 µl 含纤连蛋白（0.0025%）的 PBS 每孔包被 96 孔黑壁透明底板（每板加入 5.85 ml PBS 和 150 µl 纤连蛋白 [0.1%]）。盖上盖子，室温孵育 1 小时。吸除孔内溶液，再将板子敞盖于室温孵育 1 小时。 alternatively，可使用预包被板以增强细胞贴附。</li>
		<li>从细胞中移除旧的培养基，用 3 ml PBS 洗去死细胞，然后吸除 PBS。</li>
		<li>加入3 ml PBS-胰蛋白酶-EDTA，孵育1分钟，然后移除溶液。注意：细胞形态由星形变为球形。</li>
		<li>轻轻敲击培养瓶底部使细胞脱落，用10 ml DMEM转移培养基反复冲洗收集细胞，将细胞悬液转移至50 ml Falcon管中。</li>
		<li>按每毫升计数细胞数量（此处使用 NucleoCounter，也可使用血球计数板）。取 100 µl 细胞培养液加入 1.5 ml 微离心管中。加入 100 µl 裂解缓冲液，通过轻弹管壁混匀。加入 100 µl 稳定缓冲液，通过轻弹管壁混匀。</li>
		<li>将细胞悬液加入NucleoCassette中，并使用计数仪对细胞进行计数。将计得的细胞数乘以3，因为在步骤3.1.6中加入裂解液和稳定缓冲液时，细胞被稀释了3倍。</li>
		<li>将细胞稀释至终浓度为 600,000 个细胞/ml，每孔加入 150 µl 细胞悬液至包被好的培养板中，使每孔细胞密度约为 90,000 个细胞/孔。避免产生气泡，轻敲培养板使细胞均匀分布，以获得连续的细胞层。将培养板置于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育2 湿润培养箱中培养16-24小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用荧光染料负载细胞，并准备化合物板。
	<ol>
		<li>配制 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）/HEPES/Ca2+/牛血清白蛋白（BSA）缓冲液：加入165 µl CaCl2 储存液（1 M CaCl₂）2 在蒸馏水 [dH₂O] 中2O] – 室温保存），500 µl HEPES 储存液（1 M HEPES 溶于 dH₂O）2O，pH 7.4——室温保存），并将 0.05 g BSA 加入 50 ml HBSS 中。注意，钙流检测中需使用无脂肪酸 BSA，因为脂肪酸可激活特定受体，从而干扰目标受体的钙信号。</li>
		<li>配制丙磺舒溶液（100倍，250 mM）：将0.71 g丙磺舒溶解于5 ml NaOH（1 M）中，加入50 µl HEPES储备液和5 ml HBSS/HEPES/Ca2+/BSA缓冲液——务必现配现用。注意：丙磺舒可抑制无机阴离子转运体，而这些转运体可能会将Fluo-4从细胞质中排出，从而降低荧光信号。建议在加载染料时分别在有无丙磺舒的条件下进行，以确定所研究的特定细胞系中无机阴离子转运体是否可能造成问题，因为丙磺舒甚至可能减弱激动剂介导的信号。</li>
		<li>配制洗涤缓冲液：将 500 µl 丙磺舒溶液加入 50 ml HBSS/HEPES/Ca 中2+/BSA 缓冲液，调节 pH 至 7.4，并过滤缓冲液。务必新鲜配制，每块板需要 50 ml 缓冲液。</li>
		<li>配制10%普鲁利克酸溶液：将50 µl普鲁利克酸（20% w/v，溶于二甲基亚砜[DMSO]）与50 µl DMSO混合——若出现结晶，于37 °C加热，并务必现配现用。</li>
		<li>配制Fluo-4 AM溶液（1 mM）：向含有50 µg Fluo-4 AM的离心管中加入44 µl 10% Pluronic酸溶液，涡旋振荡至完全溶解。避免光照，以防荧光染料漂白。</li>
		<li>配制上样缓冲液：将8.8 ml含10 mM HEPES和2.5 mM probenecid（pH 7.4）的DMEM加入Fluo-4 AM溶液（44 µl）中，涡旋混匀。始终使用新鲜配制的缓冲液。</li>
		<li>弃去细胞培养液，每孔用 200 µl PBS 洗涤细胞，然后吸除 PBS。</li>
		<li>每孔加入 55 µl 上样缓冲液，室温孵育 1 小时。用铝箔纸包裹板子，避免暴露于光线下。</li>
		<li>确保在筛选前将化合物充分干燥，如果它们溶解于对筛选有害的溶剂中例如，乙腈）用于细胞表达系统。</li>
		<li>在硅化处理的1.5 ml微量离心管中，用洗涤缓冲液溶解肽段。制备一系列稀释浓度，用于进行浓度-反应关系分析并确定EC50 配体的值。在化合物板（V型96孔板）的相应孔中加入70 µl配体，并在每块板上设置阳性对照（内源性激动剂）和阴性对照（洗涤缓冲液）。注意：如果化合物在洗涤缓冲液中不溶解，可尝试对所研究细胞无害的其他溶剂，例如水或能够乳化和溶解油类及其他水不溶性物质的溶液。例如，Kolliphor EL）</li>
		<li>所有样品均需设置三个复孔。注意，在检测过程中，会将50 µl来自化合物板的配体转移至含有100 µl洗涤缓冲液的细胞板孔中，因此化合物溶液应配制为其目标终浓度的3倍。</li>
		<li>弃去细胞板中的上样缓冲液，每孔加入100 µl洗涤缓冲液。室温孵育15分钟，并避免光照。</li>
		<li>弃去细胞板中的洗涤缓冲液，每孔加入100 µl新鲜洗涤缓冲液。</li>
		<li>将细胞板、化合物板和一个吸头架（96孔，工作站设备移液吸头）在37 °C孵育15分钟。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 在Station设备上进行检测
<ol>
	<li>使用软件创建并加载所需的实验方案文件，启动读板室的温度控制单元。在此，以37 °C测量钙离子响应，每次测量一行，持续2分钟，连续读数之间间隔1.52秒（测量完整的96孔板约需25分钟），检测波长为525 nm。将Fluo-4的激发波长设为488 nm，并在读数开始后18秒，以26 µl/sec的加样速度和135 µl的移液高度，向细胞板中加入总计50 µl的化合物。</li>
	<li>将化合物板、细胞板以及吸头架放置于仪器设备相应的抽屉位置。</li>
	<li>在启动FLEX模式的实际筛选前，先以ENDPOINT模式在相同的激发和发射波长下对细胞板进行一次单次读数。注意：该测量可获得相对荧光单位（RFU）值，用于检测板内各孔之间的变异情况。RFU值在20,000至40,000之间视为可接受。</li>
	<li>启动检测实验，并使用软件分析数据。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

基于荧光的钙流测定法已成功应用于验证以下功能表征 果蝇 已由Mertens完成了sNPF肽能信号系统的相关研究 等通过生物发光检测法和冯 等通过电生理学检测方法13,15. 内皮细胞50 在HEK293T细胞中通过荧光检测法获得的数值比在CHO细胞中通过生物发光检测法获得的数值低约10倍（果蝇-sNPF-1：fluo = 2.04 nM，lumi = 51 nM； 果蝇-sNPF-2：fluo = 5.89 nM，lumi = 42 nM； 果蝇-sNPF-3：fluo = 5.55 nM，lumi = 31 nM； 果蝇-sNPF-4：fluo = 0.50 nM，lumi = 75 nM）。这些差异可由多种因素解释，包括所使用的表达系统之一可能更适用于特定受体的功能性表达，或某些受体在特定细胞类型中的折叠效率较低。EC50 四个值 果蝇-sNPF 肽在其受体上的荧光和生物发光检测中均处于纳摩尔浓度范围，通常支持其肽-受体相互作用的生理相关性 体内.
需要注意的是，本次筛选未包含已知激活配体的受体作为转染对照，因为在实验设置中，果蝇（Drosophila）sNPF 信号系统通常被用作转染对照。筛选中包含了 HEK293T 细胞内源性配体的阳性对照（PAR1）以及阴性对照（洗涤缓冲液）。PAR1 的结果表明细胞状态良好。阴性对照（洗涤缓冲液）未引发荧光信号，说明溶解肽的培养基中不含可能影响实验结果的任何污染物。
本研究利用先前已表征的 Drosophila sNPF 信号系统，以说明基于荧光的钙动员检测方法。为此，可立即测试激动配体的浓度梯度。然而，当在筛选实验中对孤儿受体进行过表达，以检测包含数百种化合物的文库时，建议首先使用相对较高的配体终浓度（例如，10 或 1 µM）进行初筛。在鉴定出具有激活作用的化合物后，可进一步对该化合物进行系列稀释，以开展浓度-反应曲线检测，并确定其 EC50 值。
一旦确定了受体的激活配体，可通过调整实验方案进一步研究其细胞内信号通路。该检测可按上述方法进行，但无需共转染Gα16 亚基。当检测到钙反应时，意味着该受体与内源性Gα偶联q 细胞表达系统的亚基。当未观察到荧光信号时，可采用检测其他第二信使浓度变化的实验方案（例如，cAMP）可被应用。
还可以开展构效关系（SAR）研究，以确定肽段中激活受体所必需的核心序列。首先，通过评估截短序列来确定仍能激活受体的最短氨基酸序列。随后，可测试一系列系统性地将每个氨基酸替换为丙氨酸残基的肽段。在受体上测试合成的丙氨酸替换系列，有助于确定每个氨基酸在受体激活中的重要性24,25。
尽管该检测方法应用广泛且已证实有效，但仍需强调，本文所述的检测方案可能需要针对特定受体进行一些调整，以获得最佳结果。Gα16亚基的优点在于其可与大多数G蛋白偶联受体（GPCR）结合，但可能对内源性通过Gαq22偶联的受体产生显性负效应。在此情况下，在优化新型钙流检测时，可尝试不同的G蛋白组合，并比较Gαq偶联受体在有或无Gα16存在时的检测结果。此外，也可采用不依赖G蛋白相互作用的替代性检测方法来评估受体激活，例如GFP标记的arrestin转位实验，或检测膜电位变化（例如，使用FLIPR膜电位检测试剂盒）。除本实验所用的Fluo-4 AM外，目前已有多种其他钙离子敏感型荧光染料可供选择，每种染料均具有独特的光谱和化学特性。最合适的荧光染料应根据具体的GPCR类型、细胞种类以及可用的酶标仪进行选择，但需通过实验验证其适用性。转染DNA的用量以及DNA与转染试剂的比例，需针对每一种受体-转染试剂-细胞系组合进行优化确定。最后，需注意连续培养的细胞仅能提供20至25代可用于筛选实验的有效传代次数。

G蛋白偶联受体（GPCRs）是所有细胞表面蛋白中最大且最多样化的一类家族。它们存在于脊椎动物、无脊椎动物、植物、酵母、黏菌以及原生动物和最早的双胚层后生动物中，表明GPCRs是与信号转导相关的最古老的分子之一1。这些受体的天然激活配体涵盖了多种外部刺激物，包括肽类、生物源性胺类、气味分子、糖蛋白以及光子2。因此，这类受体-配体信号系统参与了多种多样的生理过程。其广泛的生物学功能使其成为治疗多种人类疾病药物开发的理想靶点。目前约50%-60%的药物靶点属于GPCRs3,4。除了在制药工业中的重大意义外，GPCRs也正受到广泛关注，用于开发新一代物种特异性的杀虫剂5,6以及广义上的农药。由于许多GPCRs的天然配体仍未被鉴定，它们被归类为孤儿受体。对这些受体进行去孤儿化研究将有助于深入理解其在生物体内的生理功能，并可能揭示出可用于新药开发的潜在靶点7。

自基因组时代以来，反向药理学策略已广泛应用于G蛋白偶联受体（GPCR）的去孤儿化研究8。该策略是指利用孤儿受体作为“钩子”，从生物提取物或合成化合物文库中“钓取”其激活配体。因此，首先克隆目标GPCR，并将其转染至细胞表达系统中。在最常用的方法中，通过检测第二信使分子浓度的变化来判断受体是否被激活9。主要的受体筛选检测方法依赖于钙离子敏感的生物发光蛋白（例如，aequorin）10或荧光钙指示剂（例如，Fluo-4）11。基于荧光的检测方法在配体筛选前先将表达受体的细胞负载荧光钙指示剂，具有操作简便、读数时间短以及可在同一块微孔板上灵活筛选多个孤儿受体的优势，因而适用于高通量筛选12。

在此，通过孤儿受体去孤儿化过程，详细描述并图示了基于荧光的钙流测定方法 Drosophila melanogaster 短神经肽F（sNPF）受体。该神经肽信号系统最初由Mertens表征 等. 于2002年13 使用中国仓鼠卵巢（CHO）细胞进行的钙离子生物发光检测14 和 Feng 等 2003年采用电生理学检测方法 非洲爪蟾 卵母细胞15. sNPF 信号系统似乎仅限于节肢动物门，该系统参与多种生理过程，包括摄食、生长、应激反应、运动以及昼夜节律的调控16.

对昆虫神经肽信号系统的研究不仅可能为开发新型杀虫剂提供新的靶点，而且由于许多信号系统在进化过程中普遍保守，相关功能知识还可外推至其他生物体17。在过去十年中，昆虫神经肽G蛋白偶联受体（GPCR）的去孤儿化研究取得了显著进展。尽管如此，目前仅有少数受体被成功匹配到其对应的配体，而随着基因组学的快速发展，大量新的孤儿GPCR序列信息已被陆续获得18。因此，中高通量筛选方法的建立显得尤为宝贵，例如基于荧光的钙流检测技术已被证实为一种广泛应用的手段9,18。

此处所述的基于荧光的钙流测定法在人胚胎肾293T（HEK293T）细胞系中进行，利用荧光探针检测受体激活后细胞内钙离子浓度的变化。为确保受体的高效表达与翻译，在受体编码序列的5’端添加Kozak共识序列19，随后将其克隆至表达载体中（例如，用于哺乳动物细胞系的pcDNA载体系列）。由于仅凭序列信息难以预测孤儿G蛋白偶联受体（GPCR）的内源性G蛋白偶联特性，因此在配体鉴定之前，受体激活后所调控的第二信使分子（例如，钙离子或cAMP）通常尚不明确。为克服这一问题，可共表达Gq家族的通用G蛋白（例如，小鼠Gα15或人Gα16［本文所用］）或嵌合G蛋白（例如，Gαqi5），这些G蛋白可与大多数GPCR相互作用并诱导钙离子释放20,21,22。当配体与其受体结合后，GPCR发生构象变化，从而激活特定的细胞内信号通路。在静息状态下结合于Gα16亚基的鸟苷二磷酸（GDP）分子将被鸟苷三磷酸（GTP）取代。这一过程引发异源三聚体G蛋白解离为Gα16亚基和Gβγ亚基。Gα16亚基激活磷脂酶Cβ（PLCβ），后者进一步水解膜结合的磷脂酰肌醇二磷酸（PIP2），生成二酰甘油（DAG）和三磷酸肌醇（IP3）。IP3在细胞质中扩散，并激活内质网膜上IP3依赖性钙通道，从而诱导钙离子从内质网释放至细胞质中。

受体激活后钙离子的释放发生在数秒之内，可通过在筛选实验前用钙离子敏感性染料（如 Fluo-4 乙酰甲氧基酯（AM）11）对细胞进行负载来检测。AM 酯基团使荧光染料能够穿过细胞膜，并在进入细胞后被胞质酯酶水解，从而暴露出荧光染料的负电荷，阻止其扩散出细胞，使其可与钙离子结合。在静息状态下，细胞内钙离子浓度处于纳摩尔（nM）范围，Fluo-4 的荧光信号极微弱；然而，当受体激活引起钙离子释放时，荧光信号可随钙离子浓度升高而增强，最高可达 100 倍以上，从而确保较高的信噪比。Fluo-4 在钙离子浓度约为其 Kd(钙) 值 345 nM 附近具有较大的动态响应范围，适用于多种细胞中生理相关钙离子变化的检测。Fluo-4 的激发波长为 488 nm，发射荧光在 525 nm 处检测11。荧光检测仪如荧光成像微孔板读板仪（FLIPR）23、NOVOstar 或 FlexStation（station device）12 属于中高通量系统，可在实验板的每个孔中同步实现化合物添加及受体激活后 Fluo-4 信号的检测。本文所述的钙离子动员实验基于 station device 的 96 孔微孔板系统。

SoftMax Pro 软件用于操作工作站设备以及进行数据分析。该程序会立即以96孔板格式将结果以图形形式显示。可同时选择多个孔，以便在同一图表上比较这些孔的结果。每个列中各孔的相对荧光单位（RFU）值会在两分钟内被同时测定，测定从向孔中加入化合物前开始，并持续至受体激活后荧光信号的测量结束。通常情况下，激动剂曲线的趋势在加入激活化合物前与基线一致，加入后则导致荧光信号迅速上升。峰的高度与孔中激动剂的最终浓度相关。峰后，荧光信号缓慢下降，趋近于基线水平。RFU 测量值可转换为浓度-反应曲线，以确定配体的 EC50 值（半最大有效浓度）。一般而言，应至少进行三次独立的实验，每次实验包含一个浓度系列的三个重复，以构建可靠的浓度-反应曲线。

建议在实验设计中包含多个阳性和阴性对照。首先，应设置转染对照，即使用已知配体的受体进行实验，以验证转染试剂是否有效。建议同时设置内源性受体激动剂的对照实验以及阴性对照（例如，洗涤缓冲液），以监测细胞的健康状态和存活能力，并排除洗涤缓冲液被可能引发自发荧光反应的因子污染的可能性。常用的激动剂包括来自蛋白酶激活受体-1（PAR1）的肽段，该肽段作为PAR1选择性激动剂发挥作用，以及卡巴胆碱（carbachol），其可激活乙酰胆碱受体。还应检测转染空表达载体的细胞，以排除活性化合物与细胞内源性受体相互作用的可能性。针对不同的信号系统，可能需要对下述方案中描述的多个参数进行优化。基于荧光的钙流测定完整实验流程示意图见Figure 1。
<img alt="荧光检测中的静态平衡；细胞培养系统示意图；G蛋白激活动力学。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51516/51516fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51516/51516fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 基于荧光的钙流测定整体实验流程示意图。 自动化液体处理和同步荧光检测由软件控制的多功能酶标仪工作站完成。该工作站包含三个抽屉：分别用于放置细胞板、化合物板和移液枪头架。内置移液器将化合物从化合物板的一列转移至细胞板的对应列（步骤1）。细胞板的每个孔中均含有一层HEK293T细胞，这些细胞已共转染了目标G蛋白偶联受体（GPCR）和通用型Gα16亚基。当化合物激活受体时，与Gα16结合的GDP被GTP取代。随后，Gα16亚基从Gβγ复合物中解离，并激活磷脂酶Cβ（PLCβ），后者进一步水解磷脂酰肌醇二磷酸（PIP2），生成二酰甘油（DAG）和三磷酸肌醇（IP3）。IP3可激活内质网膜上的IP3依赖性钙通道，促使钙离子释放到细胞质中。钙离子与细胞预先负载的Fluo-4染料结合后产生荧光信号（步骤2）。软件以相对荧光单位（RFU）随时间变化的形式呈现结果，荧光峰值高度与配体浓度呈浓度依赖性相关。这些数据可进一步转换为浓度-反应曲线，用于确定配体-受体对的EC50值（步骤3）。

<table><tbody><tr><td>HEK293T 细胞</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA 溶液（0.25%）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（EDTA）</td><td>MP Biomedicals</td><td>195173</td><td></td></tr><tr><td>杜氏改良伊格尔培养基-高糖&amp;nbsp;（DMEM）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（P-S）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>jetPRIME</td><td>Polyplus transfection</td><td>114-01</td><td>FuGENE HD 转染试剂（Promega）；Lipofectamine LTX &amp;amp; Plus 试剂（Life technologies）</td></tr><tr><td>透析胎牛血清（FBS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0392</td><td></td></tr><tr><td>人血浆来源的纤连蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0895</td><td></td></tr><tr><td>试剂 A100，裂解缓冲液</td><td>Chemometec</td><td>910-0003</td><td></td></tr><tr><td>试剂 B，稳定缓冲液</td><td>Chemometec</td><td>910-0002</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 缓冲液：Hank's 平衡盐溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8264</td><td></td></tr><tr><td>丙磺舒</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8761</td><td></td></tr><tr><td>NaOH（1 M）</td><td>Vel</td><td>2781</td><td></td></tr><tr><td>普鲁尼克酸</td><td>Invitrogen</td><td>P-3000MP</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Invitrogen</td><td>F14201</td><td>Fluo-3、Rhod-2、Fluo-5、Calcium Green-1 等（Invitrogen）</td></tr><tr><td>TPP 细胞培养瓶（T-75 和 T-150）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z707503 和 Z707554</td><td></td></tr><tr><td>FlexStation 仪器</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>NOVOstar（BMG Labtechnologies）；FLIPR（荧光成像板读取仪）（Molecular Devices）</td></tr><tr><td>黑色壁、透明底的聚苯乙烯板（96 孔）</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655090</td><td>Corning 96 孔平底透明黑色聚苯乙烯多聚赖氨酸包被微孔板</td></tr><tr><td>NucleoCassette</td><td>Chemometec</td><td>941-0001</td><td></td></tr><tr><td>NucleoCounter NC-100</td><td>Chemometec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>硅化微量离心管</td><td>BioCision</td><td>BCS-2470</td><td></td></tr><tr><td>聚苯乙烯 V 型 96 孔板</td><td>Greiner Bio-One</td><td>651101</td><td></td></tr><tr><td>96 孔 FlexStation 移液吸头</td><td>Molecular Devices</td><td>9000-0912</td><td></td></tr><tr><td>Soft Max Pro 软件</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

基于荧光的钙离子动员检测法表征g蛋白偶联受体

Characterization of G Protein-coupled Receptors by a Fluorescence-based Calcium Mobilization Assay

二十多年来，反向药理学一直是发现孤儿G蛋白偶联受体（GPCR）激活配体的主要策略。反向药理学实验的起始步骤是在细胞表达系统中克隆并转染目标G蛋白偶联受体。随后，将异源表达的受体与候选配体化合物文库进行孵育，以鉴定能够激活该受体的配体。受体激活可通过检测第二信使报告分子（如钙离子或cAMP）浓度的变化来评估。本文所述的基于荧光的钙流测定法是一种常用的中通量反向药理学检测方法。该方法中，将孤儿G蛋白偶联受体瞬时表达于人胚胎肾293T（HEK293T）细胞，并共转染一种广谱性Gα16构建体。配体结合后，Gα16亚基的激活会诱导内质网释放钙离子。在进行配体筛选前，需先用荧光钙离子探针Fluo-4乙酰甲酯（Fluo-4 acetoxymethyl）对表达受体的细胞进行负载。在静息状态下，Fluo-4的荧光信号极弱，但在受体激活后释放的钙离子与其结合时，荧光信号可增强100倍以上。该技术无需耗时建立稳定转染细胞系（即外源遗传物质整合至宿主细胞基因组中的细胞系），仅需通过瞬时转染实现目标基因的临时表达即可完成筛选实验。该体系支持对数百种化合物进行中通量筛选。共转染具有广谱耦合能力的Gα16（可与大多数GPCR耦合），可使细胞内信号通路重定向为钙离子释放，从而不受受体天然信号通路类型的限制。HEK293T细胞易于操作，并在多年的受体去孤儿化实验中验证了其有效性。然而，针对特定受体的实验条件优化可能仍然必要。

浓度梯度系列，范围从 50 µM 至0.001 nM，对全部四种 果蝇 sNPF 肽（果蝇-sNPF-1：AQRSPSLRLRF酰胺， 果蝇-sNPF-2：SPSLRLRF酰胺， 果蝇-sNPF-3：PQRLRW酰胺， 果蝇-sNPF-4：PMRLRW酰胺）对瞬时表达该受体的HEK293T细胞的作用 果蝇 sNPF受体与混杂性Gα16 亚基。该G蛋白偶联受体可被所有四种肽在终浓度达0.1 nM时激活，且受体激活呈浓度依赖性。 图2 显示了三个重复实验中其中一个的相应图表 果蝇-sNPF-1 浓度梯度系列。阴性对照（洗涤缓冲液）未诱导出荧光信号，而阳性对照（PAR1 – 1 µM) 强烈激活了内源性蛋白酶激活受体-1，导致产生高荧光信号（± 30,000 RFU）。需要注意的是，典型曲线的偏离可能提示异常情况。例如，曲线持续上升而未能回到基线，可能与非受体介导的信号有关，如存在钙离子载体，或脂质双分子层受损导致钙离子泄漏。
该软件允许输入公式以计算不同浓度下的激活百分比或标准误差等参数。所得数据用于绘制初步的浓度-反应曲线，以估算 EC50 值，如 图3 中四种 Drome-sNPF 肽所示。图3 的曲线还包含了阴性对照的数据，即在转染了空载体 pcDNA3.1 的 HEK293T 细胞上测试 Drome-sNPF 肽的浓度系列。结果表明，将这些肽添加至上述细胞中对内源性受体无影响，但确实能够激活目标受体。随后，基于初始筛选的初步浓度-反应曲线，独立重复进行了三次基于荧光的钙流动员实验，并调整测试浓度以覆盖曲线的动态范围（图4）。Drome-sNPF-1（2.04 ± 1.48 nM ［95% 置信区间］）、Drome-sNPF-2（5.89 ± 3.74 nM）、Drome-sNPF-3（5.55 ± 3.95 nM）和 Drome-sNPF-4（0.50 ± 1.01 nM）的 EC50 值相似，表明它们激活受体的效力相当。
<img alt="显示多个浓度（0.05 至 50 µM）下 RFU 随时间变化的荧光动力学测定图" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51516/51516fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51516/51516fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 受体介导的荧光反应浓度系列实验的软件图形输出结果。在 Drome-sNPF 受体上测试了十二种终浓度（范围从 50 µM 到 0.001 nM）的 Drome-sNPF-1 肽。激活程度以相对荧光单位（RFU）表示。上图显示六个最高浓度的结果，下图显示六个最低浓度的结果。阳性对照（+）为 PAR1（1 µM），阴性对照（-）为洗涤缓冲液。
<img alt="sNPFR激活的剂量-反应曲线；图表；EC₅₀值；浓度与%激活率的关系。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51516/51516fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51516/51516fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 利用单次基于荧光的钙动员实验测定的黑腹果蝇（Drosophila）sNPF肽的初步浓度-反应曲线。图中以蓝色显示在HEK293T细胞中瞬时表达的黑腹果蝇（Drosophila）sNPF受体对四种黑腹果蝇（Drosophila）sNPF肽的浓度-反应曲线。红色曲线为阴性对照，即肽在转染了空载体pcDNA3.1的HEK293T细胞上的检测结果。荧光响应以相对于最大值的百分比（%）表示（100%激活）。曲线来自一次实验，每个浓度梯度均设三个重复。垂直条表示平均值的标准误（SEM），有时该误差小于所用符号，此时仅显示符号。
<img alt="受体激活的剂量-反应曲线；四部分图中显示对数浓度的EC50值" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51516/51516fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51516/51516fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. 通过三次独立的基于荧光的钙动员实验测定的黑腹果蝇（Drosophila）sNPF 肽的浓度-反应曲线及其相应的 EC50 值。在 HEK293T 细胞中瞬时表达的黑腹果蝇（Drosophila）sNPF 受体对四种黑腹果蝇（Drosophila）sNPF 肽的浓度-反应曲线，均来自三次独立实验，每次实验设三个复孔（n ≥ 9）。荧光信号以最高响应值为100%进行归一化，结果以相对百分比（%）表示（即100%激活）。星号标注了 n ≤ 9 的浓度点。误差线表示标准误（SEM），有时误差小于所用符号尺寸，此时仅显示符号。EC50 值及其95%置信区间一并标出。

本文所述的基于荧光的钙流测定法是一种中等通量的反向药理学筛选系统，用于鉴定孤儿G蛋白偶联受体（GPCRs）的功能性激活配体。

基于荧光的钙离子动员检测法表征G蛋白偶联受体

二十多年来，反向药理学一直是发现孤儿G蛋白偶联受体激活配体的主要策略……

以下实验的总体目标是鉴定孤儿G蛋白偶联受体（G protein coupled receptors，G PCRs）的功能性激活配体。该目标通过在细胞表达系统中瞬时转染目标A-G-P-C-R，并共转染一种广泛性G alpha 16构建体，实现两种蛋白的临时异源表达。第二步，将转染后的细胞加载钙离子敏感性染料flu oh four，该染料在与钙离子结合后荧光信号增强，从而检测细胞内钙库中钙离子的释放。接下来，通过使用候选配体化合物库刺激异源表达的受体，进行基于荧光的钙流测定实验，以鉴定能够激活该受体并引发细胞内信号级联反应的化合物，该反应导致内质网中钙离子的释放，其变化可通过荧光信号进行检测。实验结果可获得激活配体的半最大效应浓度（EC50）的浓度-反应曲线，该曲线基于向细胞表达系统施加不同浓度配体后所检测到的多种荧光信号而生成。相较于使用稳定克隆细胞系，采用瞬时转染以实现G蛋白偶联受体（GPCR）短暂表达的主要优势在于，无需耗时构建此类稳定转染的细胞系。转染通用型G蛋白α16亚基可将大多数G蛋白偶联受体（GPCR）的细胞内信号通路重定向至钙离子释放途径，而无论其在内源性环境中的天然信号通路如何。因此，该实验体系可在短时间内实现对数百种化合物在目标GPCR上的中等通量筛选。本实验操作将由本实验室的博士研究生Yellow Gas和技师Nick Su演示。在进行钙流检测前3天，于T75培养瓶中培养HEK 293T细胞，当细胞融合度达到80%时进行传代。每组实验准备一个T75培养瓶用于转染受体表达质粒，另准备一个用于转染空表达载体作为阴性对照。将培养瓶置于37摄氏度、含5% CO2的湿润培养箱中孵育20至24小时，直至细胞培养物达到约50%至70%融合度，如图所示。接着，向一个1.5毫升微量离心管中加入3.9微克受体构建体或空载体以及3.9微克G alpha 16表达构建体，再加入500微升jetPRIME缓冲液。通过涡旋充分混匀试管，随后短暂离心。然后加入37.5 µL的jetPRIME试剂，涡旋混匀后以最大速度离心1分钟。将转染混合物室温孵育10分钟。在室温下，将一个细胞群体标记为转染了表达载体，该载体编码目标 GPCR 和 G alpha 16 构建体；另一个培养瓶则标记为转染空载体和 G alpha 16 构建体。孵育后，将转染混合物逐滴加入细胞培养基中，注意将混合物直接加入培养基，避免接触培养瓶壁。将培养瓶置于 37°C、5%CO₂ 的湿化培养箱中孵育 20 至 24 小时，用于钙流测定实验。将转染后的细胞收集并接种至96孔黑色壁透明底板中。首先用每孔60微升的室温溶液对板子进行包被。含纤连蛋白的磷酸盐缓冲液。将培养板盖上盖子，在室温下孵育一小时。移除孔中的溶液，再将培养板在室温下不盖盖子孵育一小时。同时，从细胞中移除旧的培养基。用 3 mL 的 PBS 洗去死亡细胞，并吸除 PBS。然后加入 3 mL 室温 PBS 洗涤液，加入 EDTA，孵育 1 分钟后吸除溶液。此时，细胞形态由星形变为球形。轻轻敲击培养瓶底部使细胞脱落，并用 10 毫升室温 DM em 转移培养基反复冲洗收集细胞。将细胞转移至一个50毫升离心管中。为计数每毫升的细胞数量，取100微升细胞培养液加入一个1.5毫升微量离心管中，然后加入100微升裂解缓冲液，并通过轻弹管壁混匀。最后，加入 100 µL 稳定缓冲液，通过轻敲混匀。用细胞悬液填充核小体盒（nucleo cassette），并使用计数仪计数细胞。由于细胞被稀释了三倍，核小体观察软件（nucleo view software）会自动将细胞数量乘以三。加入裂解与稳定缓冲液后，将细胞稀释至终浓度为每毫升600,000个细胞，并在包被好的培养板中每孔接种150微升细胞悬液。为获得每孔约90,000个细胞的密度，避免产生气泡，并轻敲培养板使细胞均匀分布。为形成连续的细胞单层，将培养板置于37摄氏度、5%CO2的湿润培养箱中孵育16至24小时。弃去细胞中的培养基。每孔用 200 µL PBS 洗涤细胞，并吸去 PBS。注意，此后所有涉及细胞操作的步骤均需在避光条件下进行，因为从此时起，细胞将被加载荧光染料 fluoro four。每孔加入 55 µL 上样缓冲液，用铝箔纸包裹酶标板以避免光照，于室温孵育一小时。随后，使用洗涤缓冲液在硅化处理的 1.5 mL 微型离心管中溶解干燥的多肽。制备一系列稀释浓度以进行浓度-反应分析，并测定配体的 EC50 值。请注意，在检测过程中，将从化合物板中转移50微升配体至细胞板的含100微升洗涤缓冲液的孔中，因此需将化合物配制为其目标终浓度的三倍。接下来，以三复孔形式向化合物板的相应孔中加入70微升配体。每块板均需设置阳性和阴性对照。弃去细胞板中的上样缓冲液，每孔加入 100 微升洗涤缓冲液，避免光照。室温孵育 15 分钟。弃去细胞板中的洗涤缓冲液，每孔加入 100 微升新鲜洗涤缓冲液。将细胞板、化合物板和一个吸头架在37摄氏度下孵育15分钟。使用软件创建并加载所需的程序文件，并在此处激活读取室的温度控制单元。在37摄氏度下，以每行依次进行的方式，在525纳米波长下每1.52秒进行一次连续读数，持续测量钙离子响应信号两分钟。将flu oh four的激发波长设置为488纳米，并将总共50微升的化合物转移至细胞板中。读数开始后18秒，以26微升/秒的分配速度和135微升的移液高度开始操作。将化合物和细胞板以及吸头架放置在工作站设备的相应抽屉中。在开始实际的 flex 模式筛选之前，先以终点模式在相同的激发和发射波长下对细胞板进行一次读数。启动检测，并使用所示软件进行数据分析。以下是 doofus 短链 NPF 一个浓度系列的三个重复实验之一对应的图表。阴性对照未诱导出荧光信号，而阳性对照则强烈激活了内源性蛋白酶激活受体 one，从而产生强烈的荧光信号。该软件允许输入公式以计算不同浓度下的激活百分比或标准误差等数据。所得数据可用于绘制初步的浓度-反应曲线，以估算EC50值，图中展示了四种食管短链NPF肽的结果。曲线还包含了阴性对照的数据，即在转染了空载体的细胞上测试果蝇短链NPF肽的浓度梯度序列。结果表明，这些肽类物质对细胞内源性受体无影响，但确实能够激活目标受体。已开展基于荧光的钙流测定的初步浓度-反应曲线实验，并根据曲线的动态范围调整了测试浓度。果蝇 short npf 1、2、3 和 4 的 EC50 值相似，表明在该实验条件下，它们激活受体的效力相当。还可以采用其他方法，如构效关系研究，以回答更多问题，例如肽段中哪些氨基酸对受体激活至关重要。观看本视频后，您应能够充分理解如何开展基于荧光检测的钙流测定，用于鉴定G蛋白偶联受体的功能性激活配体。该流程包括维持稳定表达系统，随后通过转染将目标受体导入细胞体系。在刚性钙动员实验之后进行。

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科研

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生物学

G蛋白偶联受体的基于荧光的钙动员含量表征

通过使用光谱分辨的双光子显微成像系统，获得表达膜受体的细胞的福斯特共振能量转移（FRET）效率的像素级图谱，这些膜受体被认为可形成同源寡聚复合物。根据FRET效率图谱，我们能够估算所研究寡聚复合物的化学计量信息。...

体内 利用光谱分辨双光子显微镜定量分析G蛋白偶联受体相互作用

本文中，我们描述了用于研究趋化性的详细活细胞成像方法。我们介绍了荧光显微镜技术，用于监测迁移细胞中信号事件的时空动态。对信号事件的测量使我们能够进一步理解GPCR信号网络如何实现对趋化因子梯度的感知，并调控真核细胞的定向迁移。...

成像介导趋化性信号事件的G蛋白偶联受体（GPCR）：以盘基网柄菌（Dictyostelium discoideum）为例

本视频展示了一种涉及表达CXCR4趋化因子受体的胶质母细胞瘤细胞的细胞检测方法。该检测利用钙敏感性染料，在试剂作用时测量荧光变化，从而揭示细胞信号转导动态。...

一种用于鉴定CXCR4相互作用剂的细胞检测方法

检测G蛋白偶联受体对G蛋白选择性激活的简便方法，目前仍是细胞信号转导领域尚未解决的挑战。本文通过将G蛋白偶联受体（GPCR）与G蛋白肽段成对锚定，构建了基于福斯特共振能量转移（FRET）的生物传感器，可在活细胞中以可控浓度探测构象变化。...

使用活细胞悬浮荧光计检测法通过FRET传感器测量G蛋白选择性G蛋白偶联受体构象

鸟苷三磷酸（GTP）结合是G蛋白偶联受体（GPCR）激活过程中最早发生的事件之一。本实验方案描述了如何通过检测放射性标记的GTP类似物[35S]鸟苷-5'-O-(3-硫代)三磷酸（[35S]GTPγS）在特定配体作用下的结合情况，来药理学表征特定的GPCR-配体相互作用。...

通过放射性标记GTP结合测量G蛋白偶联受体信号传导

所述细胞检测旨在鉴定能够抑制或刺激CXC趋化因子受体4（CXCR4）相互作用的试剂，这些试剂可通过竞争性或变构方式抑制或激活由CXCR4激活引发的细胞内Ca2+...

一种基于动力学荧光的 Ca2+ 流动检测方法，用于鉴定 G 蛋白偶联受体激动剂、拮抗剂及别构调节剂

本研究描述了一种用于384孔板的高通量细胞内钙荧光检测方法，可用于在重组G蛋白偶联受体（GPCRs）上筛选小分子文库。该检测以牛蜱Rhipicephalus...

一种用于高通量筛选重组G蛋白偶联受体的“双加样”钙荧光检测法

已开发出一种改良的内皮细胞钙流测定实验方案，用于鉴定蛋白酶激活受体（PARs）的配体。新方案将总检测时间缩短了90至120分钟，并可获得可重复的浓度-反应曲线。...

利用酶标仪通过钙流测定法表征蛋白酶激活受体调节剂

本方案描述了基于BRET的生物传感器在G蛋白偶联受体配体刺激下，对活体HEK293细胞中G蛋白活化进行实时检测的应用。本文以β2-肾上腺素能受体和1型大麻素受体为例，展示了该传感器在多种G蛋白亚型及不同G蛋白偶联受体中的检测效率。...

基于BRET的G蛋白生物传感器用于活细胞中G蛋白偶联受体活性的检测

本文描述了一种用于估算激动剂对G蛋白偶联受体活性状态亲和常数（Kb）的方法。该分析可提供Kb的绝对值或相对值，具体取决于受体的组成性激活是否可测量。本方法适用于受体激活后产生的多种下游反应。...

量化G蛋白偶联受体上的激动剂活性

学习基于荧光的钙动员检测方法，用于孤儿G蛋白偶联受体（GPCR）的配体筛选。该方法利用HEK293T细胞和G alpha 16构建实现中高通量筛选，快速鉴定功能性激活配体。

基于荧光的钙离子动员检测法表征G蛋白偶联受体

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