静电生长因子释放到微纤维支架

该协议结合了静电纺丝和微球来开发组织工程支架来指导神经元。神经生长因子被封装在 PLGA 微球中，并电纺成透明质酸 （HA） 纤维支架。 通过在支架上接种初级雏鸡背根神经节并培养 4-6 天来测试蛋白质生物活性。

该手术的总体目标是创造一个多方面的环境来支持神经生长和修复。这是通过首先将生长因子封装在可降解微球中来实现的。第二步是为大部分环境准备支持材料。

接下来，将微球和支撑材料组合并电纺成对齐的纤维支架。最后一步是用小鸡背根神经节神经元测试支架。最终，免疫荧光显微镜用于显示与对照组相比，神经突生长和方向加速。

虽然该系统是为神经组织设计的，所使用的蛋白质和材料略有变化，但它也可以应用于各种组织类型，包括心脏、肺和骨骼。在开始此程序之前，准备必要的试剂、每体积重量为 2% 和 0.5% 的聚乙烯醇或 PVA 去离子水溶液、每体积 2% 的溶液、异丙醇和去离子水，以及所需亲水性蛋白的水溶液。地方。将 40 毫升 0.5% PVA 溶液放入 50 毫升离心管中，放在一个小瓶中，溶解 300 毫克 65 至 35 聚乳酸乙酸钴乙醇酸或 PLGA 和 3 毫升二氯甲烷。

涡旋混合器可用于加速 PLGA 溶解，混合 200 微升蛋白质溶液和 4 微升 2% PVA 溶液。将蛋白质 PVA 混合物倒入 PLGA 溶液中。解决方案将大部分保持独立。

使用约 10 瓦的 W ator 将小瓶放入装有冰水的烧杯中，搅拌溶液 5 到 10 秒，直到产生均匀的乳白色乳液。将乳液倒入先前制备的含有 0.5% PVA 的 50 毫升试管中。在涡旋混合器上高速混合溶液约 20 秒。

该解决方案将形成混浊的外观。将乳剂转移到 200 毫升烧杯中，以 350 RPM 的转速放在搅拌板上 2 分钟。将 50 毫升 2% 异丙醇加入搅拌板上的烧杯中。

让混合物继续搅拌至少 1 小时，让氯甲烷蒸发并使 PLGA 硬化。接下来，将微球溶液转移到离心管中，以 425 倍 G 离心 3 分钟。微球会聚集在管底并呈白色小心地从微球上方的管中取出上清液，并储存在 500 毫升瓶中。

用去离子水冲洗微球，将每根试管装满四分之三并摇晃以重新分配液体中的微球。最后一次冲洗后，重复离心去除上清液并用去离子水冲洗微球四次。取出上清液，与其他样品一起放入 500 毫升瓶中。

收集在离心管中的微球在零下 20 摄氏度冷冻过夜，然后冻干至少 24 小时。以下静电纺丝溶液应事先在去离子水中制备，每体积重量为 2%，甲基相关透明质酸或 miha，每体积重量为 3%，900 道尔顿聚环氧乙烷或 PEO 和每体积重量 0.05%。光引发剂溶液。

制备所需体积的静电纺丝溶液后，添加所需浓度的微球，最高可达每毫升 400 毫克。在涡旋混合器上混合溶液，直到微球均匀分布在溶液中。将溶液转移到注射器中，并连接一个 6 英寸 18 号钝头针头。

将注射器放入注射泵中，并将其设置为每小时 1.2 毫升的分配。在心轴上贴一层铝箔。这样可以轻松清理和存放成品脚手架。

旋转心轴用于创建对齐的纤维。将地线从高压电源连接到收集设备。将正极引线连接到针上，以确保电旋成功。

验证所有连接和设置是否正确非常重要。启动聚合物泵送，当在注射器末端可以看到溶液时，打开电压源并将电压设置为 24 千伏。运行解决方案，直到达到所需的支架厚度。

完成后，关闭电压源和注射泵。要开始此过程，请在电纺前用可移动的双面胶带将相关的盖玻片贴在电旋转器的收集区域。旋转到盖子上滑动，在静电旋转到所需厚度后易于作和查看。

如上一个视频片段所示，小心地从心轴上取下盖玻片。将涂有脚手架的盖玻片放入透明的氮气室中，并确保吹扫所有氧气。将腔室和支架置于 10 平方厘米的 365 纳米灯下 15 分钟。

交联位置后，盖上盖子滑入适当大小的孔板中。确保脚手架面朝上。将 100 至 200 微升培养基放在孔板的每个支架上。仔细。

将一个背根神经节或 DRG 放在培养基液滴中的每个支架上。对于较厚的支架，可能需要更多的介质。DRG 需要完全浸没并且在不漂浮。

将支架和 DRG 在 37 摄氏度下孵育 4 小时，使细胞粘附在支架上。接下来，将培养基填充至适合孔的水平。将板放回培养箱中，并在孵育期后孵育 4 至 6 天。

小心地从每个孔中取出培养基，并用 PBS 轻轻洗涤一次。使用每体积 4% 重量固定细胞 30 分钟。对甲醛随后按照既定方案对细胞中的神经丝和细胞核进行染色。

要使用荧光显微镜观察细胞，请将孔板放在显微镜的载物台上，并使用 dpi 的过滤器和激发设置定位细胞质量。识别出单元格后，将过滤器切换到 zi。要可视化延伸的神经突，请使用显微镜上的拼接功能收集和组合尽可能多的图像，以查看整个结构。

对 dpi、fite 和明场微球重复。通过该方案，始终如一地生产了直径为正负 14 微米且蛋白质封装率超过 85% 的蛋白质封装，并将电子旋转到支架中。该荧光图像显示了 PLGA 壳中带有 Rod Domine 且封装在其中的 BSA 拟合的代表性微球。

为了评估包埋，用 BSA 填充微球，并使用 Bradford 蛋白测定法检测超过 60 天的蛋白质释放情况。释放从最初的爆发开始，然后随着微球在静电纺丝后分解而继续。在整个 3D 纤维结构中都可以看到微球。

在这个完整支架的 SEM 图像中。球体可以在多个图层中看到，由箭头指示。这个高放大倍率图像是一个微球，上面有来自支架的纳米纤维。

背根神经节或 DRG 用于测试支架内微球中神经生长因子或 NGF 的活力。这是位于包含微球的支架上的 DRG。加载 NGF 的微球显示在一个较长的神经突内没有蛋白质的微球从 NGF 支架上的 DRG 延伸表明 NGF 是可行的并且可以促进生长。

看完这个视频，你应该对如何将蛋白质封装成微球并掺入纤维支架有很好的了解。